王亞婷，何彩霞，盧振輝，王 琦，楊少奇，李 洋

(1. 寧夏醫(yī)科大學(xué)，寧夏銀川 750004；2. 寧夏醫(yī)科大學(xué)總醫(yī)院肝膽外科；3. 寧夏醫(yī)科大學(xué)總醫(yī)院消化內(nèi)科，寧夏銀川 750004；4. 寧夏吳忠新區(qū)醫(yī)院，寧夏銀川 751100)

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SALL4在肝癌中的表達(dá)及其對(duì)預(yù)后的影響

王亞婷1，何彩霞1，盧振輝2，王 琦2，楊少奇3，李 洋4

(1. 寧夏醫(yī)科大學(xué)，寧夏銀川 750004；2. 寧夏醫(yī)科大學(xué)總醫(yī)院肝膽外科；3. 寧夏醫(yī)科大學(xué)總醫(yī)院消化內(nèi)科，寧夏銀川 750004；4. 寧夏吳忠新區(qū)醫(yī)院，寧夏銀川 751100)

目的 檢測(cè)人類(lèi)婆羅雙樹(shù)樣基因4(SALL4)在肝癌中的表達(dá)情況，探討SALL4表達(dá)與原發(fā)性肝細(xì)胞癌(HCC)患者預(yù)后的相關(guān)性。方法 應(yīng)用免疫組織化學(xué)法檢測(cè)60例石蠟HCC標(biāo)本及其中32例癌旁組織標(biāo)本SALL4蛋白的表達(dá)，分析其與HCC患者臨床病理學(xué)資料及預(yù)后的關(guān)系；采用熒光定量RT-PCR、Western blot法，分別檢測(cè)23例新鮮HCC及癌旁肝組織中SALL4 mRNA和蛋白的相對(duì)含量。結(jié)果 HCC組織中SALL4蛋白的表達(dá)率(81.67%，49/60)顯著高于癌旁組織(6.25%，2/32)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=48.047，P<0.01)；SALL4蛋白在HCC中的表達(dá)與甲胎蛋白水平有關(guān)(P<0.05)；SALL4高表達(dá)和低表達(dá)組患者的平均生存時(shí)間分別為(26.20±2.37、34.05±1.26)個(gè)月，SALL4高表達(dá)組患者的1、3年生存率(75.9%、55.2%)顯著低于SALL4低表達(dá)組1、3年生存率(95.0%、85.0%，χ2=5.044，P<0.05)。肝癌及癌旁組織的SALL4 mRNA的相對(duì)量分別為14.80±8.62、0.17±0.13，兩組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=8.14，P<0.01)。Western blot檢測(cè)結(jié)果顯示，SALL4蛋白在HCC中的相對(duì)量為0.354±0.103。癌旁組織中幾乎不表達(dá)。結(jié)論 SALL4表達(dá)與肝癌患者預(yù)后密切相關(guān)，可作為肝癌患者判斷預(yù)后的預(yù)測(cè)指標(biāo)。

肝癌；SALL4基因；免疫組織化學(xué)；Western blot；實(shí)時(shí)熒光定量PCR

我國(guó)肝癌(hepatocellular carcinoma, HCC)發(fā)病率呈逐年上升趨勢(shì)，肝癌術(shù)后復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移率高居不下，使得其遠(yuǎn)期療效并不理想[1]。因此，篩選出能指導(dǎo)預(yù)后的分子標(biāo)記對(duì)肝癌治療非常重要。近期大量研究認(rèn)為，肝癌的復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移與肝癌干細(xì)胞密切相關(guān)，肝癌細(xì)胞中類(lèi)干細(xì)胞或祖細(xì)胞亞型具有預(yù)后差的特征[2]。人類(lèi)婆羅雙樹(shù)樣轉(zhuǎn)錄因子4(spalt-like transcription factor 4, SALL4)在胚胎早期發(fā)育、器官形成以及胚胎干細(xì)胞(embryonic stem cell, ESC)增殖和多能性維持方面發(fā)揮著重要作用，是經(jīng)典的干細(xì)胞標(biāo)記物。SALL4在乳腺癌、胃癌、結(jié)直腸癌、食管癌等腫瘤中均表達(dá)異常[3-6]，提示其與腫瘤發(fā)生發(fā)展關(guān)系密切。但在肝癌方面研究較少。本研究將探討SALL4在肝癌中的表達(dá)和作用。

1 材料與方法

1.1 臨床標(biāo)本

選取寧夏醫(yī)科大學(xué)總醫(yī)院2010年2月～2014年12月肝膽外科手術(shù)治療，經(jīng)病理確診的60例HCC石蠟標(biāo)本及其中32例癌旁組織標(biāo)本、10例膽管細(xì)胞性肝癌標(biāo)本、10例肝血管瘤標(biāo)本。其中男性44例，女性16例，年齡范圍：26～74歲，平均年齡50歲。分化程度：高分化11例，中、低分化49例。術(shù)后當(dāng)日即為隨訪開(kāi)始，通過(guò)住院記錄和電話進(jìn)行隨訪，隨訪截止時(shí)間為2015年2月。另有2013年2月至2014年10月經(jīng)手術(shù)切除的新鮮HCC標(biāo)本23例及相應(yīng)癌旁組織(距離癌組織2 cm)。標(biāo)本取得后立即轉(zhuǎn)移至液氮罐中，隨后置于-80 ℃冰箱中凍存。以上病例均有完整的臨床病理學(xué)資料，術(shù)前均未進(jìn)行化療或放療。研究經(jīng)醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)并征得病人或家屬同意。

1.2 實(shí)驗(yàn)試劑

SALL4鼠抗人單克隆抗體，購(gòu)自Abcam公司。免疫組化試劑盒、鼠抗人beta-actin單克隆抗體均購(gòu)自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司。全蛋白提取試劑盒、BCA蛋白含量檢測(cè)試劑盒購(gòu)自南京凱基生物科技發(fā)展有限公司?？俁NA提取試劑盒購(gòu)自O(shè)mega公司。ECL發(fā)光試劑盒、RNA反轉(zhuǎn)錄試劑盒、熒光RT-PCR試劑盒均購(gòu)自Thermo公司。熒光RT-PCR為羅氏LightCycler?480 RT-PCR儀。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 免疫組化Elivision二步法 石蠟包埋組織連續(xù)切片(厚4 μm)，置于65 ℃烤箱中過(guò)夜。石蠟切片常規(guī)脫蠟、水化，間接蒸汽修復(fù)抗原20 min，抗原修復(fù)液為EDTA(pH 8.0)；依次滴加30 mL/L H2O2，室溫20 min；山羊血清封閉液，20 min；SALL4鼠抗人單克隆抗體(1∶100)，4 ℃過(guò)夜；聚合物輔助劑20 min。辣根酶標(biāo)記抗小鼠IgG多聚體30 min；DAB顯色；常規(guī)脫水，透明，封片。PBS代替一抗作為陰性對(duì)照。結(jié)果判定：每張切片選取5個(gè)高倍鏡視野，胞核內(nèi)無(wú)顯色為陰性(-)；25%～50%的細(xì)胞核顯色、染色顆粒較淡為弱陽(yáng)性(+)；50%～75%細(xì)胞核顯色、染色顆粒較深為中度陽(yáng)性()；>75%細(xì)胞核染色，且染色顆粒深為強(qiáng)陽(yáng)性()。

1.3.2 熒光定量RT-PCR檢測(cè)SALL4 mRNA的表達(dá) ①根據(jù)GenBank提供的SALL4基因序列(NM_020436.3)，由上海生工生物有限公司設(shè)計(jì)合成SALL4引物，上游：5′-AACGCCACTGTCTCCAAGAT-3′；下游：5′-CACGCAAGTTCTCCCTTAGC-3′；內(nèi)參GAPDH引物，上游：5′-CAAGGTCATCCATGACAACTTTG-3′；下游：5′-GTCCACCACCCTGTTGCTGTAG-3′。②總RNA提取及逆轉(zhuǎn)錄：取60 mg組織按試劑盒說(shuō)明提取總RNA，經(jīng)NanoDrop 2000分光光度計(jì)檢測(cè)總RNA質(zhì)量及濃度，取2 μg總RNA，進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)合成cDNA。③嚴(yán)格按照試劑說(shuō)明操作，PCR反應(yīng)體系為25 μL。其中SYBR Green qPCR master mix 12.5 μL，上下游引物各1 μL，模板2 μL，置于羅氏LightCycler?480 PCR擴(kuò)增儀上，反應(yīng)條件：95 ℃預(yù)變性10 min、95 ℃變性15 s、60 ℃退火30 s，40次循環(huán)后72 ℃延伸30 s。④mRNA含量采用相對(duì)定量法：獲得各樣本待測(cè)基因及同樣本GAPDH的Ct值后用2-△△Ct方法計(jì)算[7]。定量PCR反應(yīng)產(chǎn)物同時(shí)進(jìn)行電泳鑒定，實(shí)驗(yàn)共重復(fù)3次。

1.3.3 Western blot法 提取肝癌及癌旁組織總蛋白，BCA法測(cè)定蛋白濃度；上樣蛋白為50 μg，SDS-PAGE凝膠電泳后，400 mA 1.5 h轉(zhuǎn)至硝酸纖維素膜；50 g/L脫脂奶粉室溫封閉1 h；一抗鼠抗人SALL4單克隆抗體(1∶500)4 ℃孵育過(guò)夜，二抗(1∶5 000)室溫下孵育2 h，曝光成像。以凝膠定量軟件Quantity-one分析灰度值。同時(shí)檢測(cè)內(nèi)參beta-actin(1∶1 000)的表達(dá)。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

2 結(jié) 果

2.1 SALL4蛋白的定位與表達(dá)

SALL4蛋白主要定位于細(xì)胞核。HCC組織中SALL4的表達(dá)率(81.67%，49/60)顯著高于癌旁組織(6.25%，2/32)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=48.047，P<0.01)；在10例膽管細(xì)胞性肝癌的表達(dá)率為80%。SALL4在肝血管瘤組織中不表達(dá)(表1、圖1)。

表1 不同肝組織標(biāo)本中SALL4蛋白的表達(dá)陽(yáng)性率(例)

Tab.1 The positive expressions rate of SALL4 in different tissues [n(%)]

標(biāo)本例數(shù)陰性陽(yáng)性+陽(yáng)性率(%)肝細(xì)胞性肝癌601110281181.67肝膽管細(xì)胞性肝癌10224280.00肝癌癌旁組織32302006.25肝血管瘤肝組織10100000.00

圖1 SALL4蛋白在肝組織中的表達(dá)情況

Fig.1 Expression of SALL4 protein in the liver tissues (×400)
A：SALL4蛋白在HCC組織中呈陽(yáng)性表達(dá)；B：SAll4蛋白在癌旁組織中無(wú)表達(dá)；C：SALL4在膽管細(xì)胞性肝癌中呈陽(yáng)性表達(dá)；D：SAll4蛋白在肝血管瘤中無(wú)表達(dá)。

2.2 SALL4表達(dá)與患者臨床特征及生存時(shí)間的關(guān)系

在60例HCC組織中，SALL4蛋白表達(dá)與性別、年齡、部位、腫瘤最大徑、分化程度、HBsAg、門(mén)靜脈癌栓、TNM分期無(wú)明顯關(guān)系(P>0.05)，與甲胎蛋白水平有關(guān)(P<0.05，表2)。將60例肝癌組織分為陰性表達(dá)組(-，n=11)、低表達(dá)組(+，n=10)、高表達(dá)組(或，n=39)。總體生存時(shí)間顯示，截止到36個(gè)月，SALL4高表達(dá)組患者平均生存時(shí)間為(26.20±2.37)個(gè)月，95%可信區(qū)間(CI為21.56～30.85)，1、3年累計(jì)生存率分別為75.9%，55.2%；SALL4低表達(dá)組患者平均生存時(shí)間為(34.05±1.26)個(gè)月，95%可信區(qū)間CI為(31.58～36.52)，1、3年累計(jì)生存率分別為95.0%，85.0%；SALL4陰性組患者平均生存時(shí)間為(35.09±0.87)個(gè)月，95%可信區(qū)間CI為(33.39～36.79)，1、3年累計(jì)生存率分別為100%，90.9%。SALL4高表達(dá)組患者的生存率明顯低于低表達(dá)組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=5.044，P=0.025<0.05)(圖2)。

2.3 熒光定量RT-PCR檢測(cè)結(jié)果

在23例肝細(xì)胞癌中有21例表達(dá)SALL4 mRNA，對(duì)應(yīng)癌旁組織中10例表達(dá)SALL4 mRNA。SALL4 mRNA在23例肝癌組織中的相對(duì)表達(dá)量為14.80±8.62，癌旁組織的相對(duì)表達(dá)量為0.17±0.13，經(jīng)t檢驗(yàn)，兩組統(tǒng)計(jì)學(xué)差異顯著(t=8.14，P<0.01)(圖3、圖4)。

表2 SALL4表達(dá)情況與臨床病理特征的關(guān)系

Tab.2 Relationship between SALL4 expression and clinicopathologic characteristics in hepatocellular carcinoma tissues

臨床病理特征例數(shù)SALL4蛋白表達(dá)情況-+P值性別 男448361.000b 女16313年齡0.648a <55歲29623 ≥55歲31526腫瘤直徑0.500b <5cm35530 ≥5cm25619分化程度0.989b 中低49940 高1129AFP0.043b <400μg/L31922 ≥400μg/L29227HbsAg0.677b -1239 +48840門(mén)靜脈癌栓0.882b 有1028 無(wú)50941TNM分期0.059b Ⅰ～Ⅱ43538 Ⅲ～Ⅳ17611

a為卡方檢驗(yàn)；b為Fisher’s精確概率檢驗(yàn)法(n<40或有理論數(shù)<1)。

圖2 SALL4高表達(dá)與低表達(dá)組患者的總體生存曲線

Fig.2 Overall survival curve in high SALL4 expression group and low SALL4 expression group

圖3 熒光定量RT-PCR反應(yīng)擴(kuò)增曲線

Fig.3 The amplification curve graph by FQ-RT-PCR

圖4 熒光定量RT-PCR反應(yīng)溶解曲線

Fig.4 The melt curve graph by FQ-RT-PCR

2.4 Western blot檢測(cè)結(jié)果

SALL4蛋白在23例肝癌組織中的相對(duì)表達(dá)量為0.354±0.103。癌旁組織中幾乎不表達(dá)(圖5)。

3 討 論

人類(lèi)婆羅雙樹(shù)樣基因(SALL)家族共4個(gè)成員，人的SALL4基因定位于染色體20q13.13-q13.2，編碼C2H2型鋅指蛋白轉(zhuǎn)錄因子[8-9]。研究表明，SALL4的表達(dá)富集于胚胎和成人干細(xì)胞及類(lèi)干細(xì)胞中，有助于生物發(fā)育過(guò)程中的細(xì)胞干性及腫瘤生長(zhǎng)，是一個(gè)涉及胚胎、器官發(fā)生及腫瘤干細(xì)胞(cancer stem cell, CSC)相關(guān)的干細(xì)胞基因。SALL4與轉(zhuǎn)錄因子包括SOX2、Oct3/4、Nanog等相互作用共同維系了ESC的多功能性，是維持ESC無(wú)限增殖、自我更新、多向分化的重要調(diào)控基因[10]。而SALL4作為核心因素，在這個(gè)調(diào)控網(wǎng)絡(luò)中起主導(dǎo)作用[11]。

圖5 SALL4蛋白在肝癌及癌旁組織的表達(dá)

Fig.5 SALL4 protein expression in hepatocellular carcinoma and paracarcinoma tissues
A、C：肝癌組織；B、D：癌旁組織。

ZHANG等[4]通過(guò)功能分析表明，SALL4可上調(diào)Bmi-1和Lin28B從而促進(jìn)胃上皮向間質(zhì)細(xì)胞轉(zhuǎn)化并獲得干細(xì)胞潛質(zhì)，參與胃癌的發(fā)生和轉(zhuǎn)移。OIKAWA等[12]通過(guò)免疫組化證實(shí)，SALL4在胎兒及嬰兒的肝細(xì)胞中高表達(dá)，20例HCC中有17例病人的SALL4蛋白表達(dá)陽(yáng)性，在成人正常肝細(xì)胞及膽管細(xì)胞中未檢出SALL4蛋白。本實(shí)驗(yàn)中，SALL4在大部分HCC呈高表達(dá)，與OIKAWA的研究結(jié)果一致。而SALL4在正常肝組織中幾乎不表達(dá)的特點(diǎn)，提示SALL4有可能作為肝癌腫瘤標(biāo)記物之一。本實(shí)驗(yàn)同時(shí)檢測(cè)了10例膽管細(xì)胞性肝癌中SALL4的表達(dá)，其中有8例表達(dá)SALL4。研究發(fā)現(xiàn)SALL4的表達(dá)可誘導(dǎo)CK19和EPCAM的表達(dá)，CK19作為膽管上皮和膽管細(xì)胞性肝癌的特異性染色標(biāo)記，提示SALL4在促進(jìn)肝干細(xì)胞分化為膽管細(xì)胞的過(guò)程中可能發(fā)揮了重要作用[13]。

本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)SALL4表達(dá)與AFP有關(guān)，AFP作為一種癌胚蛋白，主要來(lái)自胚胎的肝細(xì)胞，在部分生殖細(xì)胞腫瘤及胃腸道腫瘤中升高，而健康成人中合成受到抑制。有趣的是，SALL4蛋白在胎兒和部分新生兒肝臟中表達(dá)，而在健康成人肝組織中無(wú)表達(dá)，但又重新表達(dá)于部分預(yù)后不良的肝癌患者體內(nèi)[12]。AFP、SALL4同為癌胚胎蛋白，兩者表達(dá)是否有內(nèi)在關(guān)聯(lián)性，有待于進(jìn)一步研究。

本研究結(jié)果顯示癌旁組織中SALL4 mRNA的表達(dá)與其蛋白表達(dá)一致性有差異，提示其表達(dá)強(qiáng)度可能受到體內(nèi)諸多因素的影響，但具體機(jī)制有待于進(jìn)一步研究。PCR結(jié)果表明SALL4 mRNA在HCC中呈高表達(dá)，SALL4作為干細(xì)胞群的可靠指標(biāo)，它的水平在數(shù)量上提示了肝癌組織中含有干細(xì)胞的比例。大量研究表明，包括肝癌在內(nèi)的一些實(shí)體惡性腫瘤存在CSC，干細(xì)胞特異性標(biāo)記物呈過(guò)表達(dá)的腫瘤細(xì)胞通常具有較高的侵襲性和致瘤能力。

新近研究發(fā)現(xiàn)，SALL4的高表達(dá)與結(jié)直腸癌細(xì)胞的遷移和進(jìn)展密切相關(guān)，SALL4可作為結(jié)直腸癌獨(dú)立的生存預(yù)測(cè)因子[5]。OIKAWA等[13]發(fā)現(xiàn)SALL4在成年鼠成肝細(xì)胞(hepatoblast)的表達(dá)隨著長(zhǎng)大后逐漸沉默，表明在胎鼠肝臟細(xì)胞早期分化方面起到了重要的作用。進(jìn)一步敲除SALL4基因可抑制移植肝腫瘤生長(zhǎng)，提高了免疫缺陷瘤小鼠的平均存活時(shí)間。本實(shí)驗(yàn)Kaplan-Meier生存分析顯示，SALL4高表達(dá)組肝癌患者平均生存時(shí)間(26.20±2.37月)較低表達(dá)組(34.05±1.26月)明顯縮短。表明肝癌組織中SALL4蛋白表達(dá)越強(qiáng)，患者的生存期越短，預(yù)后越差。SALL4的表達(dá)可影響肝癌的惡性生物學(xué)行為，可能作為肝癌患者病情程度判斷及預(yù)后不良的預(yù)測(cè)指標(biāo)。但本研究入組病例較少，需進(jìn)一步加大樣本量進(jìn)行深入研究。

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(編輯 韓維棟)

Expression and prognostic significance of SALL4 in hepatocellular carcinoma

WANG Ya-ting1, HE Cai-xia1, LU Zhen-hui2, WANG Qi2, YANG Shao-qi3, LI Yang4

(1. Ningxia Medical University, Yinchuan 750004; 2. Department of Hepatobiliary Surgery,General Hospital of Ningxia Medical University, Yinchuan 750004; 3. Department of Gastroenterology, General Hospital of Ningxia Medical University, Yinchuan 750004;4. Wuzhong New District Hospital, Yinchuan 751100, China)

Objective To evaluate the expression of human spalt-like transcription factor 4 (SALL4) in hepatocellular carcinoma (HCC) and its relationship with the prognosis of primary HCC. Methods Immunohistochemical method was used to detect SALL4 protein expression in 60 cases of HCC paraffin specimens and 32 cases of corresponding paracarcinoma tissue paraffin specimens. We explored the relationship of SALL4 expression with the patients’ clinicopathological data and the prognosis of HCC. Meanwhile, fluorescence quantitative reverse transcription polymerase chain reaction (FQ-RT-PCR) and Western blot were used to detect SALL4 expression in another 23 pairs of tumors and matched peritumoral samples of HCC with radical resection. Results The high expression rate of SALL4 protein (81.67%, 49/60) in HCC tissues was higher than that in paracarcinoma tissues (6.25%, 2/32), with a significant difference (χ2=48.047,P<0.01). The expression of SALL4 in HCC was correlated with AFP (P<0.05). The average survival time for patients in high SALL4 expression group and low SALL4 expression group was 26.20±2.37 and 34.05±1.26 months, respectively. Moreover, 1-year survival rate (75.9%) and 3-year rate (55.2%) in high SALL4 expression group were significantly lower than those in low expression group (95.0%, 85.0%,χ2=5.044,P<0.05). SALL4 mRNA in HCC and paracarcinoma tissues was 14.80±8.62 and 0.17±0.13, respectively, with a significant difference (t=8.14,P<0.01). Western blot results showed the relative expression of SALL4 protein in liver cancer tissues was 0.354±0.103, but SALL4 protein was hardly expressed in paracarcinoma tissues. Conclusion SALL4 expression is closely related to the postoperative prognosis of patients with HCC. Therefore, it can be used as a predictor for prognosis of liver cancer patients.

hepatocellular carcinoma; spalt-like transcription factor 4 (SALL4) gene; immunocytochemistry; Western blot; real-time fluorescence quantitative reverse transcription polymerase chain reaction (RT-PCR)

2015-04-20

2015-07-10

寧夏回族自治區(qū)對(duì)外科技合作項(xiàng)目 Supported by the External Technology Cooperation Projects of Ningxia Hui Autonomous Region

楊少奇. E-mail: shaoqiynh@hotmail.com

R735.7

A

10.7652/jdyxb201601022

優(yōu)先出版：http://www.cnki.net/kcms/detail/61.1399.R.20151209.1621.010.html(2015-12-09)