張 勇，孟凡迪，張靖垚，付軍科，劉 昌，吳齊飛

(西安交通大學(xué)第一附屬醫(yī)院：1. 胸外科；2. 肝膽外科，陜西西安 710061)

?

靶向下調(diào)Cep55表達水平對肝癌細胞增殖能力的影響

張 勇1，孟凡迪2，張靖垚2，付軍科1，劉 昌2，吳齊飛1

(西安交通大學(xué)第一附屬醫(yī)院：1. 胸外科；2. 肝膽外科，陜西西安 710061)

目的 通過siRNA干擾技術(shù)下調(diào)中心體相關(guān)蛋白Cep55的表達水平，并檢測對肝癌HepG2和Hep3B細胞增殖能力的影響，為原發(fā)性肝癌的基因靶向治療提供理論依據(jù)。方法 應(yīng)用Cep55特異性siRNA轉(zhuǎn)染肝癌HepG2和Hep3B細胞，采用Real-time PCR和Western blot方法分別從mRNA和蛋白質(zhì)水平檢測Cep55 siRNA對Cep55基因的干擾效果，MTT法檢測下調(diào)Cep55表達水平時細胞增殖能力的變化，流式細胞儀檢測細胞周期分布變化。結(jié)果 與陰性對照組比較，干擾siRNA組Cep55的mRNA及蛋白表達水平均出現(xiàn)明顯降低(P<0.05)；MTT檢測結(jié)果顯示下調(diào)Cep55表達水平能夠顯著抑制肝癌細胞增殖(P<0.05)；流式細胞儀檢測顯示下調(diào)Cep55表達水平能夠增加G1期細胞的比例，同時降低G2-M期細胞的比例，出現(xiàn)明顯的G2期阻滯。結(jié)論 下調(diào)Cep55表達水平能夠顯著抑制肝癌細胞的增殖能力，并出現(xiàn)G2期阻滯，提示Cep55可能成為原發(fā)性肝癌的有效治療靶點。

中心體相關(guān)蛋白Cep55；原發(fā)性肝癌；細胞增殖；細胞周期；siRNA

原發(fā)性肝癌是全球最主要的惡性腫瘤之一，其病程進展迅速，并具有很高的復(fù)發(fā)及轉(zhuǎn)移率；近年來成為我國腫瘤相關(guān)死亡率的第二位，僅次于肺癌，已成為影響人類身體健康并造成經(jīng)濟重大危害的世界衛(wèi)生問題。原發(fā)性肝癌主要治療方式目前仍是手術(shù)切除，但因其起病隱匿，早期發(fā)現(xiàn)困難，致使確診時病程往往進展到局部晚期或有遠處轉(zhuǎn)移，單純手術(shù)切除困難，且術(shù)后肝癌的復(fù)發(fā)率較高。因此，探索關(guān)于原發(fā)性肝癌有效的早期檢測與治療手段，對提高肝癌患者的術(shù)后生存質(zhì)量有重要實際意義。

中心體相關(guān)蛋白(centrosomal protein 55 ku, Cep55)是新近發(fā)現(xiàn)的典型卷曲螺旋蛋白家族成員之一，其主要功能是錨定微管聚合相關(guān)蛋白，參與紡錘體形成，進而調(diào)控細胞增殖。研究表明，Cep55與多種腫瘤的發(fā)生發(fā)展關(guān)系密切[1]，但是尚未見研究報道其對原發(fā)性肝癌生物學(xué)功能的影響。本研究通過體外應(yīng)用siRNA干擾技術(shù)，抑制Cep55在HepG2和Hep3B細胞中的表達，觀察其對肝癌細胞增殖能力的影響，以探尋Cep55對肝癌細胞生物學(xué)功能的影響。

1 材料與方法

人肝癌細胞HepG2和Hep3B均購自中科院上海細胞研究所，Cep55干涉siRNA購自上海吉瑪科技有限公司。其具體序列如下：Cep55-siRNA#1：5′-GGAGAAGAAUGCUUA-UCAAUU-3′；Cep55-siRNA#2：5′-GAAGAGAAU-GAUAUUGCUAUU-3′；Control-siRNA：5′-GCAA-GCUGACCCUGAAGUUCAU-3′。細胞培養(yǎng)液RPMI-1640、胎牛血清(FBS)購自北京鼎國生物技術(shù)有限公司，Lipofectamine 2000轉(zhuǎn)染試劑購自上海玉博生物科技有限公司，SYBR Real-time PCR試劑盒和cDNA反轉(zhuǎn)錄試劑盒購自大連寶生生物公司，Cep55兔抗人多克隆抗體購自美國Santa Cruz公司，免疫組化染色試劑盒、HRP標記山羊抗兔IgG二抗試劑盒和DAB顯色試劑盒購自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司，MTT檢測試劑盒和流式細胞周期檢測試劑盒購自美國Sigma公司。

1.2 細胞培養(yǎng)

人肝癌細胞株HepG2和Hep3B均在含100 mL/L FBS的RPMI-1640培養(yǎng)液中培養(yǎng)，根據(jù)需要加入青霉素(100 μg/mL)和鏈霉素(100 μg/mL)防止細胞被細菌污染；將含有細胞及RPMI-1640完全培養(yǎng)基的培養(yǎng)皿放置于50 mL/L CO2細胞培養(yǎng)箱中，37 ℃常規(guī)培養(yǎng)，隔天換液，3～5 d傳代。

1.3 細胞轉(zhuǎn)染

取增殖期細胞接種于6孔板上，當(dāng)細胞密度達到底面積的70%左右時棄去培養(yǎng)皿內(nèi)的液體，PBS洗滌2次，更換新配制的不含血清及抗生素的DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)1 h；取適量的siRNA與Lipofectamine 2000各加入250 μL不含血清及抗生素的DMEM培養(yǎng)基中，使用移液器緩慢吹打混勻，常溫放置10 min；將上述siRNA與Lipofectamine 2000各250 μL稀釋液混勻，室溫孵育15 min；用無血清DMEM培養(yǎng)基漂洗細胞2次，將孵育好的混合液500 μL轉(zhuǎn)移至6孔板中，輕輕搖勻，使其覆蓋整個皿底；37 ℃、50 mL/L CO2細胞培養(yǎng)箱中孵育8 h后，更換含100 mL/L FBS的DMEM培養(yǎng)基(不含抗生素)，繼續(xù)培養(yǎng)24 h。

1.4 肝癌細胞中Cep55表達水平的檢測

Cep55 siRNA轉(zhuǎn)染HepG2和Hep3B細胞后，提取RNA樣品，應(yīng)用Real-time PCR檢測Cep55基因mRNA表達水平的變化，方法按照試劑盒說明書操作，計算Cep55基因相對表達量(2-ΔΔCt)。

液體飼料配方設(shè)計中，受副產(chǎn)品中的水分和鹽含量影響，干物質(zhì)采食量成為液體飼喂模式的第一限制因子，合適的水料比、多餐飼喂和飲水設(shè)計顯得非常重要[2]（見表1）。由于物料形態(tài)不同，在水的介導(dǎo)下，一些物料的營養(yǎng)價值發(fā)生改變。Perez等[6]研究表明，玉米胚芽粕和玉米麩在添加玉米漿后，代謝能分別提高17%和12%，且總能、干物質(zhì)、N、鈣、磷的消化率提高。在生長育肥階段，賴氨酸能量比每天略為降低，成本利益將增加。高權(quán)新[7]研究結(jié)果顯示，隨著浸泡時間的增加，發(fā)酵液體飼料中的植酸降解率大幅度提高。仔豬、生長豬和育肥豬液體飼料總磷為0.6%、0.47%、0.39%時生產(chǎn)性能不受影響。

另提取蛋白，應(yīng)用Western blot法檢測轉(zhuǎn)染后Cep55蛋白表達的變化，具體方法依照產(chǎn)品說明書進行，Cep55一抗工作液稀釋比為1∶500。

1.5 MTT法檢測細胞增殖能力

實驗分為無義序列陰性對照siRNA轉(zhuǎn)染組和Cep55 siRNA Mix轉(zhuǎn)染組。取對數(shù)生長期細胞，用培養(yǎng)液調(diào)整細胞懸液密度達2×103/L后接種于96孔板。在1、2、3、4、5 d每孔分別加入5 g/L MTT溶液10 μL，于37 ℃培養(yǎng)4 h。吸棄孔內(nèi)培養(yǎng)液，每孔加入DMSO 100 μL，振蕩器上振蕩10 min使結(jié)晶充分溶解，酶標儀檢測490 nm波長處的吸光度(A)值，記錄結(jié)果并繪制細胞生長曲線。

1.6 流式細胞術(shù)檢測細胞周期

消化轉(zhuǎn)染后處于對數(shù)生長期細胞，使細胞完全分散變?yōu)閱蝹€細胞，預(yù)冷的PBS洗滌2次，1 500 r/min離心5 min收集細胞，棄上清，加入1 mL預(yù)冷PBS重懸細胞，加入PI(1∶40)及RNase(1∶100)避光冰浴10 min，流式細胞儀檢測細胞周期，方法按照流式細胞周期分析試劑盒產(chǎn)品說明書操作。

1.7 統(tǒng)計學(xué)分析

2 結(jié) 果

2.1 Cep55基因沉默效果情況

利用Western blot及Real-time PCR技術(shù)檢測HepG2和Hep3B肝癌細胞轉(zhuǎn)染后Cep55的表達變化進行評估。分別應(yīng)用兩種Cep55 siRNA轉(zhuǎn)染HepG2和Hep3B肝癌細胞后，HepG2轉(zhuǎn)染細胞內(nèi)Cep55蛋白(siRNA#1：0.611±0.099；siRNA#2：0.159±0.052)和Hep3B轉(zhuǎn)染細胞內(nèi)Cep55蛋白(siRNA#1：0.261±0.066；siRNA#2：0.062±0.028)的表達水平相比于各自對照siRNA組蛋白(HepG2，control siRNA：1±0.121；Hep3B，control siRNA：1±0.112)水平均顯著降低(圖1)；HepG2轉(zhuǎn)染細胞內(nèi)Cep55 mRNA(siRNA#1：0.431±0.069；siRNA#2：0.109±0.041)和Hep3B轉(zhuǎn)染細胞內(nèi)Cep55 mRNA(siRNA#1：0.217±0.056；siRNA#2：0.032±0.011)較各自對照組mRNA(HepG2，control siRNA：1±0.091；Hep3B，control siRNA：1±0.092)水平均顯著降低(圖2)。

圖1 Western blot檢測經(jīng)Cep55 siRNA轉(zhuǎn)染的HepG2和Hep3B肝癌細胞中Cep55蛋白的表達變化

Fig.1 Cep55 protein expression in HepG2 and Hep3B cells after transfection with Cep55 siRNA detected by Western blot
1：control siRNA；2：Cep55-siRNA#1；3：Cep55-siRNA#2。與control siRNA組比較，*P<0.05。

圖2 應(yīng)用Real-time PCR檢測經(jīng)Cep55 siRNA轉(zhuǎn)染的HepG2和Hep3B中Cep55 mRNA的表達變化

Fig.2 Cep55 mRNA expression in HepG2 and Hep3B cells after transfection with Cep55 siRNA detected by Real-time PCR
1：control siRNA；2：Cep55-siRNA#1；3：Cep55-siRNA#2。與control siRNA組比較，*P<0.05。

在后續(xù)Cep55相關(guān)的siRNA干擾實驗中，我們將Cep55 siRNA#1與Cep55 siRNA#2進行混合轉(zhuǎn)染，以此盡量避免siRNA實驗中出現(xiàn)的脫靶效應(yīng)。

2.2 Cep55沉默表達對肝癌細胞增殖能力的影響

對轉(zhuǎn)染pcDNA3.1-Cep55和Cep55 siRNA Mix的HepG2和Hep3B肝癌細胞的MTT檢測結(jié)果顯示：Cep55 siRNA Mix組細胞的增殖抑制在轉(zhuǎn)染第3天開始出現(xiàn)，在轉(zhuǎn)染3、4、5 d的增殖能力較對照組抑制差異有統(tǒng)計學(xué)意義(圖3)。

圖3 MTT檢測Cep55 siRNA Mix轉(zhuǎn)染HepG2(A)和Hep3B(B)肝癌細胞的增殖變化

Fig.3 Proliferation of HepG2(A) and Hep3B(B) cells after transfection with Cep55 siRNA Mix detected by MTT assay
與control-siRNA轉(zhuǎn)染組比較，*P<0.05。

2.3 流式細胞術(shù)檢測轉(zhuǎn)染時細胞周期的變化

HepG2和Hep3B肝癌細胞轉(zhuǎn)染Cep55 siRNA Mix后，流式細胞術(shù)結(jié)果顯示：Cep55 siRNA Mix抑制兩種肝癌細胞Cep55的表達，HepG2細胞的G2-M期、S期、G1期(37.99%、31.80%、30.21%)與對照組(18.27%、36.29%、45.45%)比較，G2-M期細胞比例顯著升高，G1期細胞比例降低；Hep3B細胞的G2-M期(31.84%)較對照組(12.39%)顯著升高，G1期細胞的比例(37.78%)較對照組(50.31%)降低(圖4)。

圖4 流式細胞術(shù)檢測Cep55 siRNA Mix轉(zhuǎn)染HepG2和Hep3B肝癌細胞時細胞周期分布變化

Fig.4 FCM analysis of the cell cycle distribution structure of HepG2 and Hep3B cells after transfection with Cep55 siRNA Mix
1：HepG2 control-siRNA；2：HepG2 Cep55-siRNA；3：Hep3B control-siRNA；4：Hep3B Cep55-siRNA。

3 討 論

原發(fā)性肝癌是全球目前最常見的惡性腫瘤之一，其來源主要分為兩種：肝實質(zhì)細胞和肝內(nèi)膽管內(nèi)皮細胞[2]。肝細胞癌(hepatocellular carcinoma, HCC)是原發(fā)性肝癌主要的組織學(xué)類型，占總體的85%～90%[3]。近年來原發(fā)性肝癌在我國所導(dǎo)致的死亡率僅次于肺癌，我國HCC患者占世界HCC總死亡率的55%[4]。目前針對原發(fā)性肝癌主要治療方式仍為手術(shù)切除[5]，但其起病隱匿，早期發(fā)現(xiàn)困難，確診時病程往往進展到局部晚期或有遠處轉(zhuǎn)移，術(shù)后復(fù)發(fā)率較高[6]。因此新的化療藥物及分子靶向藥物的應(yīng)用成為原發(fā)性肝癌的研究熱點，探討其發(fā)病機制并尋找有潛力的生物標記分子，為肝癌的個性化治療提供有力的理論依據(jù)。

Cep55定位于人染色體10q23.33，其轉(zhuǎn)錄的cDNA由464個氨基酸構(gòu)成，包含9個外顯子，根據(jù)其所編碼區(qū)域的不同被劃分為3個部分：N端(1-57)；三聯(lián)螺旋域(57-355)；C端(355-464)[7]。Cep55在許多組織器官(脾、腎、肝、肺、胸腺、前列腺、睪丸、卵巢、胚胎、小腸、結(jié)腸、心、腦和骨骼肌等)中均有表達，其中以睪丸中表達量最高，胸腺次之[8]。研究表明，Cep55可與微管聚集相關(guān)蛋白CG-NAP和Kendrin相互作用而參與紡錘體的裝配。Cep55是通過其C端與中心體相關(guān)蛋白CG-NAP和Kendrin的偶聯(lián)而錨定于中心體上的[8]，而CG-NAP和Kendrin是γ-微管蛋白和其他蛋白質(zhì)構(gòu)成的γ-微管蛋白環(huán)形復(fù)合物(γ-TuRC)的主要調(diào)控者。該蛋白質(zhì)復(fù)合物是微管的一種高效集結(jié)結(jié)構(gòu)，是中心體微管裝配的起始結(jié)構(gòu)[9]?？梢姡珻ep55雖不是微管聚集、紡錘體裝配所必需, 但是可通過相關(guān)蛋白質(zhì)而參與此過程的調(diào)控[10]。Cep55表達水平的降低可導(dǎo)致多核細胞、中期紡錘體異常(多于2個)，并且許多細胞停滯于中間體階段，胞質(zhì)分裂失敗，這些現(xiàn)象證明了Cep55在紡錘體裝配、極化、分離及胞質(zhì)分裂中的重要調(diào)控作用。此外，Cep55表達異常通常會導(dǎo)致中心體異常，而這一中心體異常現(xiàn)象在多種腫瘤細胞中頻繁發(fā)生，因此，Cep55可能與腫瘤的發(fā)生發(fā)展存在潛在的相關(guān)性[11]。

研究表明，Cep55與多種腫瘤的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)，如：胃癌、乳腺癌、口腔鱗癌和頭頸部鱗癌等[12-16]。既往研究顯示，Cep55參與腫瘤多種生物學(xué)功能可能是通過P53[17]、PLK1[17-19]、FoxM1[15-16]和TEX14[20]等信號通路介導(dǎo)的。目前，關(guān)于Cep55基因與原發(fā)性肝癌的相關(guān)性研究尚未見報道。本研究利用siRNA在肝癌細胞HepG2和Hep3B中沉默Cep55基因的表達，結(jié)果顯示：在兩種肝癌細胞內(nèi)抑制Cep55的表達水平，能夠顯著抑制肝癌細胞的增殖能力；同時，肝癌細胞G1期細胞的比例明顯減低，G2-M期細胞的比例顯著升高，出現(xiàn)明顯的G2期阻滯，提示Cep55基因沉默可能抑制細胞分裂。

綜上所述，本研究初步證實了中心體相關(guān)蛋白Cep55在原發(fā)性肝癌中可能涉及的生物學(xué)功能，抑制其表達能顯著降低肝癌細胞的增殖能力，而這可能與其對細胞周期的調(diào)控相關(guān)。本研究結(jié)果為以Cep55為靶點的肝癌臨床預(yù)測和治療提供了初步的理論依據(jù)，但對Cep55與肝癌發(fā)生發(fā)展作用的具體機制尚需進一步研究。

[1] JEFFERY J, SINHA D, SRIHARI S, et al. Beyond cytokinesis: the emerging roles of CEP55 in tumorigenesis[J]. Oncogene, 2015, doi: 10.1038/onc.2015.128.

[3] LAFARO KJ, DEMIRJIAN AN, PAWLIK TM. Epidemiology of hepatocellular carcinoma[J]. Surg Oncol Clin N Am, 2015, 24(1):1-17.

[4] CHEN W, ZHENG R, ZHANG S, et al. Report of incidence and mortality in China cancer registries, 2009[J]. Chin J Cancer Res, 2013, 25(1):10-21.

[5] LOPE CR, TREMOSINI S, FORNER A, et al. Management of HCC[J]. J Hepatol, 2012, 56:S75-S87.

[6] EL-SERAG HB, RUDOLPH KL. Hepatocellular carcinoma: epidemiology and molecular carcinogenesis[J]. Gastroenterology, 2007, 132(7):2557-2576.

[7] GALINDO-CUSPINERA V, WINNIG M, BUFE B, et al. A TAS1R receptor-based explanation of sweetwater-taste[J]. Nature, 2006, 441(7091):354-357.

[8] FABBRO M, ZHOU BB, TAKAHASHI M, et al. Cdk1/Erk2 and Plk1 dependent phosphorylation of a centrosome protein, Cep55, is required for its recruitment to midbody and cytokinesis [J]. Dev Cell, 2005, 9(4):477-488.

[9] DOXSEY SJ. Molecular links between centrosome and midbody[J]. Mol Cell, 2005, 20(2):170-172.

[10] VAN DER HORST A, SIMMONS J, KHANNA KK. Cep55 stabilization is required for normal execution of cytokinesis[J]. Cell Cycle, 2009, 8(22):3742-3749.

[11] KUMAR A, RAJENDRAN V, SETHUMADHAVAN R, et al. CEP proteins: the knights of centrosome dynasty[J]. Protoplasma, 2013, 250(5):965-983.

[12] TAO J, ZHI X, TIAN Y, et al. CEP55 contributes to human gastric carcinoma by regulating cell proliferation[J]. Tumour Biol, 2014, 35(5):4389-9439.

[13] MONDAL G, ROWLEY M, GUIDUGLI L, et al. BRCA2 localization to the midbody by filamin A regulates cep55 signaling and completion of cytokinesis[J]. Dev Cell, 2012, 23(1):137-152.

[14] INODA S, HIROHASHI Y, TORIGOE T, et al. Cep55/c10orf3, a tumor antigen derived from a centrosome residing protein in breast carcinoma[J]. J Immunother, 2009, 32(5):474-485.

[15] JANUS JR, LABORDE RR, GREENBERG AJ, et al. Linking expression of FOXM1, CEP55 and HELLS to tumorigenesis in oropharyngeal squamous cell carcinoma[J]. Laryngoscope, 2011, 121(12):2598-2603.

[16] WASEEM A, ALI M, ODELL EW, et al. Downstream targets of FOXM1: CEP55 and HELLS are cancer progression markers of head and neck squamous cell carcinoma[J]. Oral Oncol, 2010, 46(7):536-542.

[17] CHANG YC, WU CH, YEN TC, et al. Centrosomal protein 55 (Cep55) stability is negatively regulated by p53 protein through Polo-like kinase 1 (Plk1) [J]. J Biol Chem, 2012, 287(6):4376-4385.

[18] BASTOS RN, BARR FA. Plk1 negatively regulates Cep55 recruitment to the midbody to ensure orderly abscission[J]. J Cell Biol, 2010, 191(4):751-760.

[19] VAN DER HORST A, KHANNA KK. The peptidyl-prolyl isomerase Pin1 regulates cytokinesis through Cep55[J]. Cancer Res, 2009, 69(16):6651-6659.

[20] IWAMORI T, IWAMORI N, MA L, et al. TEX14 interacts with CEP55 to block cell abscission[J]. Mol Cell Biol, 2010, 30(9):2280-2292.

(編輯 國 榮)

Effect of knockdown of centrosomal protein 55 ku on the proliferation of human hepatocellular carcinoma cells

ZHANG Yong1, MENG Fan-di2, ZHANG Jing-yao2, FU Jun-ke1, LIU Chang2, WU Qi-fei1

(1. Department of Thoracic Surgery; 2. Department of Hepatobiliary Surgery, the First Affiliated Hospital of Xi’an Jiaotong University, Xi’an 710061, China)

Objective To investigate the effects of small interfering RNA (siRNA) knockdown of centrosomal protein 55 ku (Cep55) on the proliferation capacity of human hepatocellular carcinoma cells HepG2 and Hep3Binvitroso as to provide theoretical evidence for gene-targeted therapy for human hepatocellular carcinoma. Methods Cep55 siRNA was transfected into human hepatocellular carcinoma cells HepG2 and Hep3B with Lipofectamine 2000. Real-time PCR and Western blotting were used to detect the expression of Cep55 at mRNA and protein levels. Cell proliferation was evaluated by MTT assay and cell cycle analysis was performed by flow cytometry. Results Cep55 siRNA was successfully transfected into HepG2 and Hep3B cells, resulting in the significant inhibition of Cep55 mRNA and protein expressions (P<0.05). Downregulation of Cep55 significantly decreased the proliferation of HepG2 and Hep3B cells (P<0.05) and induced G2 cell cycle arrest. Conclusion Downregulating the expression of Cep 55 can inhibit the proliferation of hepatocellular carcinoma cells and induce G2 cell cycle arrest, which indicates that Cep 55 may be a potential target for primary hepatocellular carcinoma therapy.

centrosomal protein 55 ku (Cep55); primary hepatocellular carcinoma; cell proliferation; cell cycle; siRNA

2015-02-11

2015-05-18

中國博士后基金資助項目(No.2013M532058)；陜西省科技攻關(guān)計劃資助項目(No.2013K12-08-01) Supported by the China Postdoctoral Foundation (No.2013M532058) and the Key Science and Technology Project of Shaanxi Province (No.2013K12-08-01)

吳齊飛. E-mail: wuqifei-1@163.com

R735.7

A

10.7652/jdyxb201601008

優(yōu)先出版：http://www.cnki.net/kcms/detail/61.1399.R.20151112.1537.002.html(2015-11-12)