崔垚，安宇，金桐宇，張帆，何品剛

（華東師范大學(xué)化學(xué)與分子工程學(xué)院，上海 200241）

表面納米溝槽對(duì)成纖維細(xì)胞定向行為的影響

崔垚，安宇，金桐宇，張帆*，何品剛*

（華東師范大學(xué)化學(xué)與分子工程學(xué)院，上海 200241）

在皮膚傷口愈合中，細(xì)胞的定向行為對(duì)加速傷口愈合起著非常重要的作用。該文采用納米壓印技術(shù)制備了線寬為200 nm、周期為400 nm及深度為200 nm的溝槽結(jié)構(gòu)，用于模擬體內(nèi)的細(xì)胞外基質(zhì)。將成纖維細(xì)胞L929培養(yǎng)在納米溝槽上，觀察細(xì)胞的延長(zhǎng)和鋪展方向，對(duì)細(xì)胞的定向行為進(jìn)行了定量分析。結(jié)果表明，L929細(xì)胞在納米溝槽上具有良好的延長(zhǎng)性，并能夠沿著納米溝槽的方向鋪展，說(shuō)明制備的納米溝槽能夠誘導(dǎo)成纖維細(xì)胞的定向行為，為皮膚傷口快速愈合的臨床研究奠定了基礎(chǔ)。

納米溝槽；成纖維細(xì)胞；定向行為

0 引言

皮膚是生命體重要的保護(hù)屏障，能夠阻擋病原體的侵入、維持體內(nèi)溫度以及防止體液流失，一旦受到傷害，必須及時(shí)愈合。在皮膚傷口愈合的過(guò)程中，細(xì)胞外基質(zhì)起著非常重要的作用，它包含了大量的納米纖維類結(jié)構(gòu)成分[1]，這些納米結(jié)構(gòu)可以誘導(dǎo)細(xì)胞的行為，包括繁殖、遷移等[2]。真皮成纖維細(xì)胞是傷口愈合中的主要功能細(xì)胞之一[3]，當(dāng)皮膚受到創(chuàng)傷時(shí)，成纖維細(xì)胞會(huì)向傷口定向遷移，使傷口收縮，促進(jìn)愈合[4]。如果它的行為出現(xiàn)異常，就會(huì)造成傷口愈合延緩并留下異常疤痕。因此，誘導(dǎo)受傷組織有效、快速地進(jìn)行修復(fù)，同時(shí)減少疤痕形成是非常重要的。

近年來(lái)，研究者發(fā)現(xiàn)微納米尺度形貌對(duì)細(xì)胞行為能夠產(chǎn)生很大的影響，其中納米溝槽是非常重要的類型之一，它由于更加接近人體的真實(shí)環(huán)境而備受關(guān)注[5-6]。納米溝槽對(duì)細(xì)胞有很強(qiáng)的“接觸引導(dǎo)”作用[6]，可使細(xì)胞在特定的方向上鋪展、排列、生長(zhǎng)、遷移等[7-10]。細(xì)胞的定向行為對(duì)組織的修復(fù)和再生有很大的促進(jìn)作用，因此，已應(yīng)用于研究皮膚傷口愈合、骨頭再生、干細(xì)胞分化等生物過(guò)程[8,11-12]。納米溝槽的尺寸對(duì)于細(xì)胞定向行為具有很大的影響[13]，為了能夠有效誘導(dǎo)皮膚成纖維細(xì)胞的定向行為，該文利用納米壓印技術(shù)制備了納米尺度的溝槽結(jié)構(gòu)，并定量分析了成纖維細(xì)胞L929在納米溝槽上的定向行為，對(duì)皮膚創(chuàng)傷快速修復(fù)的臨床研究起到了一定的推動(dòng)作用，以期推動(dòng)再生醫(yī)學(xué)和整形科學(xué)的發(fā)展。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 試劑與儀器

DMEM培養(yǎng)基、胎牛血清（FBS）、青霉素/鏈霉素混合液（P/S）和0.25%胰蛋白酶（含EDTA）均購(gòu)自Gibco公司。臺(tái)盼藍(lán)溶液、PBS片劑、戊二醛、丙酮和乙醇均購(gòu)自Sigma公司。成纖維細(xì)胞L929購(gòu)自上海博谷生物科技有限公司。

倒置熒光顯微鏡（奧林巴斯IX51）購(gòu)買(mǎi)自?shī)W林巴斯（中國(guó)）有限公司。NU-5500E二氧化碳恒溫培養(yǎng)箱和NU-425-400E生物安全柜購(gòu)買(mǎi)自NuAire（美國(guó)）公司。CRYOSYSTEM 750液氮儲(chǔ)藏罐購(gòu)自于MVE（美國(guó)）公司。SX-500高壓滅菌鍋，購(gòu)置于TOMY（日本）公司。恒溫水槽CU-600購(gòu)自于上海一恒科學(xué)儀器有限公司。離心機(jī)L-600購(gòu)自于湘儀離心機(jī)儀器有限公司。

1.2 納米溝槽的制備

石英具有良好的生物相容性和透光性，因此用作加工納米溝槽的基底。首先，在干凈、干燥的石英片上涂覆層光刻膠，之后將納米壓印模板壓在上面，并施以一定的壓力，待光刻膠固化后，移去模板，接著通過(guò)反應(yīng)離子刻蝕技術(shù)，在石英基底上得到納米溝槽結(jié)構(gòu)，最后，將殘留的光刻膠去除（圖1）。

圖1 納米溝槽制備過(guò)程示意圖Fig.1Schematic illustration of the nano-grooves fabrication process

1.3 細(xì)胞培養(yǎng)

L929細(xì)胞培養(yǎng)于由DMEM培養(yǎng)基（89%）、FBS（10%）和P/S（1%）配制而成的培養(yǎng)液中，培養(yǎng)環(huán)境為37℃、5%CO2。待細(xì)胞匯合度達(dá)到80%時(shí)，用0.25%胰蛋白酶消化、離心、臺(tái)盼藍(lán)染色計(jì)數(shù)后，以2000細(xì)胞/cm2接種于納米溝槽上進(jìn)行培養(yǎng)。

接種細(xì)胞之前，納米溝槽在丙酮和乙醇溶液中分別浸泡30 min，超聲清除表面殘留的有機(jī)物，接著在蒸餾水中超聲清洗15 min，之后，高溫（120℃）滅菌20 min，紫外照射1 h。

1.4 細(xì)胞定向行為的觀察和分析

細(xì)胞培養(yǎng)24 h后，選取納米溝槽上多處不同部位進(jìn)行顯微鏡拍照，用于觀察細(xì)胞的定向行為（以平面石英基底作為對(duì)照），同時(shí)以細(xì)胞之間不能接觸且每張照片中細(xì)胞數(shù)目大于40為原則，選取10張圖片進(jìn)行細(xì)胞定向行為的定量分析。

為了進(jìn)一步觀察細(xì)胞在納米溝槽上的定向行為，該文利用掃描電子顯微鏡（SEM）對(duì)細(xì)胞進(jìn)行了表征，表征之前，對(duì)細(xì)胞進(jìn)行了固定和脫水，步驟如下：細(xì)胞培養(yǎng)24 h后，棄去原有培養(yǎng)液并加入1 mL PBS溶液清洗3次，之后加入2.5%～3.0%戊二醛固定2.5 h，接著依次加入30%、50%、75%、80%、95%和100%（2次）乙醇進(jìn)行梯度脫水（15 min/次，）干燥后進(jìn)行SEM拍照。

2 結(jié)果與討論

2.1 納米線的表征

從SEM和原子力顯微鏡（AFM）圖片中可以看到制備的納米溝槽方向一致，排列規(guī)則，圖形完整，線寬和周期分別為200 nm和400 nm，深度為200 nm左右（圖2）。

2.2 細(xì)胞在納米溝槽上的定向行為

圖2 納米溝槽的SEM圖(A)和AFM圖(B)Fig.2SEM image(A)and AFM image(B)of nano-grooves

將L929細(xì)胞培養(yǎng)在納米溝槽上，24 h后，從圖3中可以看到大多數(shù)細(xì)胞是沿著納米溝槽方向鋪展和排列的，且有一定程度的延長(zhǎng)，而在平面上，細(xì)胞是無(wú)序的，向著各個(gè)方向延伸和鋪展。細(xì)胞的SEM圖進(jìn)一步清楚地顯示細(xì)胞骨架與納米溝槽方向相一致，細(xì)胞呈現(xiàn)出良好的定向性（圖4）。

2.3 細(xì)胞定向行為的定量分析

為了定量分析L929細(xì)胞在納米溝槽上的定向行為，該文對(duì)細(xì)胞的延長(zhǎng)度和鋪展方向進(jìn)行了統(tǒng)計(jì)。首先通過(guò)Photoshop軟件提取出細(xì)胞輪廓，然后由Image J軟件擬合成橢圓（圖5）。將橢圓的長(zhǎng)軸和短軸分別定義為細(xì)胞的長(zhǎng)和寬，它們之間的比值定義為細(xì)胞的延長(zhǎng)度（E）[14-15]。如果E大于4，則認(rèn)為細(xì)胞是延長(zhǎng)的。同時(shí)，將細(xì)胞長(zhǎng)軸和納米溝槽方向之間的夾角定義為θ，如果θ小于10°，則認(rèn)為細(xì)胞能夠沿著納米溝槽的方向定向鋪展。

圖3 L929細(xì)胞在納米溝槽(A)和平面基底(B)上的顯微鏡圖片(箭頭表示納米溝槽方向)Fig.3Microscopic observations of L929 cells on nano-grooves(A)and flat surface(B)(The direction of nano-grooves is indicated by the arrow)

圖4 L929細(xì)胞在納米溝槽上的SEM圖Fig.4SEM image of L929 cells on nano-grooves

圖5 細(xì)胞擬合及參數(shù)示意圖Fig.5Schematic representation of cell fitting and parameters

從細(xì)胞延長(zhǎng)度的分布情況可以看到（圖6A），71.22%細(xì)胞的E值大于4，5.96%細(xì)胞的E值在3到4之間，說(shuō)明延長(zhǎng)的細(xì)胞所占比例是較高的。圖6B是細(xì)胞與納米溝槽之間角度的分布情況，顯示56.33%細(xì)胞的θ小于10度，23.57%細(xì)胞的θ在10度到20度之間，表明大部分細(xì)胞與納米溝槽之間的夾角是比較小的，也就是說(shuō)細(xì)胞是沿著納米溝槽的方向鋪展的，表現(xiàn)出良好的定向行為。

圖6 L929細(xì)胞在納米溝槽上E值(A)和θ值(B)的統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)Fig.6Statistical data of E value(A)and alignment angle θ(B)for L929 cells on nano-grooves

3 結(jié)論

該文以石英為基底，制備了線寬200 nm、周期400 nm及深度200 nm的溝槽結(jié)構(gòu)，將L929細(xì)胞培養(yǎng)在納米溝槽上，結(jié)果表明成纖維細(xì)胞L929能夠沿著納米溝槽方向鋪展和排列，并有一定的延長(zhǎng)，說(shuō)明細(xì)胞在納米溝槽上產(chǎn)生了良好的定向行為。該文的研究將在一定程度上促進(jìn)臨床皮膚傷口快速愈合研究的發(fā)展，對(duì)再生醫(yī)學(xué)和整形科學(xué)具有重要的意義。

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Effect of nano-grooves on the alignment of fibroblasts

Cui Yao,An Yu,Jin Tong-yu,Zhang Fan*,He Pin-gang*
(School of Chemistry and Molecular Engineering,East China Normal University,Shanghai 200241,China)

The alignment behavior of cells plays a very important role in accelerating skin wound healing.In this paper,nano-imprinting technique was used to fabricate a nano-grooves structure with 200 nm in width of grooves, 400 nm in period and 200 nm in depth,simulating the extracellular matrix in vivo.L929 cells were cultured on the nano-grooves,followed by the observation and quantitative analysis of cell elongation and spreading direction.The results showed that L929 cells could be elongated and spread along the direction of nano-grooves,thus it could be concluded that the prepared nano-grooves could induce the alignment behavior of fibroblasts,which would lay the foundation for the rapid healing of skin wounds in clinical research.

nano-grooves;fibroblasts;cell alignment

國(guó)家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目（21405049）

*通信聯(lián)系人,E-mail:fzhang@chem.ecnu.edu.cn;pghe@chem.ecnu.edu.cn