朱宇萍,劉丹丹

（內江師范學院化學化工學院，四川內江 641112）

基于納米空心Pt-Au 復合物共修飾癌胚抗原免疫傳感器的研究

朱宇萍*,劉丹丹

（內江師范學院化學化工學院，四川內江 641112）

利用犧牲模板法制備納米空心Pt-Au復合物。將萘酚/硫堇通過鍵合作用修飾在玻碳電極表面，并利用硫堇的氨基將表面吸附有亞硒酸根負離子的空心納米Pt-Au復合物修飾在萘酚/硫堇膜表面，以此固載癌胚抗體，從而構建新型癌胚抗原免疫傳感器。以循環(huán)伏安法對電極構建過程及性能進行測試，結果表明，此免疫傳感器對癌胚抗原有良好的電流響應。在優(yōu)化實驗條件下，癌胚抗原(CEA)的濃度在0.1～80 ng/mL內有良好的線性關系，檢測限為0.03 ng/mL。該免疫傳感器有望應用于臨床上CEA的檢測。

癌胚抗原；免疫傳感器；空心納米材料；硫堇；Pt-Au

0 引言

癌胚抗原(CEA)是一種具有黏附性、可溶性的異性糖蛋白分子。研究發(fā)現(xiàn)腫瘤患者血清中CEA濃度較之正常人有所上升，臨床上CEA可作為肺癌、乳腺癌、腸癌等多種癌癥的腫癌標志物之一，通過患者血清中CEA濃度可檢測腫癌變[1]。

當前已有酶聯(lián)免疫吸附法(ELISA)、時段辨別熒光免疫法(TRFIA)、放射性免疫法(RIA)、化學發(fā)光免疫法(CLIA)[2]等檢測CEA。但CLIA檢測儀器價格昂貴、RIA自身的放射污染及使用條件的限制。電化學免疫傳感器擁有制作簡單、高靈敏度、檢測快速便捷、穩(wěn)定性好等優(yōu)點，電化學免疫傳感器對CEA的定量測定有著更高的利用前景。

納米材料是近年來應用較多的新型材料。納米材料擁有比表面效應、量子尺寸效應、小尺寸效應和宏觀量子隧道效應[3-4]，許多文獻報道用納米材料構建免疫傳感器。以納米復合物作為基底，固載生物分子能夠加大固載量、提高反應活性；另外納米材料生物相容性可保持吸附的抗體生物活性、無毒性和生物可降解性[5]。將Fe304@Au磁性納米材料[6]、碳納米管[7]、石墨烯納米復合物[8]等引入免疫傳感器的制作已屢見不鮮，空心結構的納米材料具有較大的內腔，在藥物緩釋、輸送等領域有明顯的載帶能力[9]。而金（Au）、鉑（Pt）納米材料就具有比表面大、良好穩(wěn)定性、生物相容等性質。另外空心納米Pt-Au復合物具有微球的構型，較大的內部空腔可以包裹更多的生物大分子及納米顆粒，從而提高其固載量。同時空心納米微球比實心納米微球具有更高的催化活性[10]，也能有效提高抗體的生物活性。實驗利用亞硒酸（H2SeO3）還原硒核鉑-金殼結構(Se@Pt-Au)實心納米粒子而得到空心納米Pt-Au，其表面吸附的亞硒酸根負離子(SeO32)可加快電子的傳遞。另外Au與硫堇(Thi)上的氨基(-NH2) π-π共軛效應可加大對納米空心Pt-Au的固載。

含有兩個-NH2的Thi染料分子是一種固載納米Pt-Au的良好電子媒介材料[11]。通過萘酚（Nafion）上磺酸基與Thi離子交換將Thi組裝在電極表面[12]。表面吸附有SeO32-的空心納米Pt-Au微球與電極上Thi中的-NH2結合，并用牛血清白蛋白(Bovine serum albumin,BSA)封閉非特異性吸附點，從而制得一種新型的CEA免疫傳感器。

1 實驗部分

1.1 儀器與試劑

CH1660D電化學工作站(上海辰華儀器公司)；AB204-S電子天平(瑞士Mettler-toledo公司)；MP230酸度計(瑞士Mettler-toledo公司)；BRAN-SONIC 200超聲清洗儀(德國BRASON ULTRASCHALL公司)；DF-101S型集熱式恒溫加熱磁力攪拌器(上海瑞茲儀器設備有限公司)；回流裝置(冷凝管、蒸餾燒瓶、鐵架臺等)；K2Cr2O7-H2SO4浸泡、清洗所有的玻璃儀器，晾干。

氯鉑酸(H2PtCl6)(上海化學試劑公司)、氯金酸（HAuCl4）(上海化學試劑公司)、萘酚(Nafion)(美國sigma公司)、硫堇(Thi)、亞硒酸(H2SeO3)、癌胚抗原(CEA)和抗體(anti-CEA)(鄭州博賽生物技術股份有限公司)、牛血清白蛋白(BSA)(美國sigma公司)、抗壞血酸(Vitamin C，VC)、氯化鉀(KCl)、醋酸(HAc)、醋酸鈉(NaAc)，以上試劑未加說明，均為分析純，實驗用水為二次蒸餾水。

1.2 空心納米鉑-金(Pt-Au)的制備

按文獻[13-14]，將0.1 mol/L的VC溶液1 mL迅速加入至60 mL 1.5×10-3mol/L的H2SeO3溶液中，室溫下攪拌30 min，制備得到磚紅色的硒溶膠(Se)。在攪拌條件下將0.0193 mol/L H2PtCI6與0.02428 mol/L HAuCl4按1∶1(V∶V)混合均勻滴加到25 mL的Se溶膠中，同時加入0.1 mol/L VC溶液1 mL。室溫下攪拌反應約0.5 h，即制得硒核鉑-金殼結構的實心納米粒子(Se@Pt-Au)。在100℃下，將Se@Pt-Au實心納米粒子與過量的1.0×10-3mol/L亞硫酸鈉(Na2SO3)在堿性條件下一起回流冷凝反應2 h，經離心清洗，可得到不含Se的Pt-Au納米空心微球。

1.3 免疫傳感器的制備

將玻碳電極(GCE)(φ=4 mm)依次用0.3、0.05 μm的氧化鋁糊(Al2O3)拋光至鏡面。用二次蒸餾水沖洗以除去拋光粉。并依次用二次蒸餾水、無水乙醇、二次蒸餾水在超聲儀中分別超聲清洗5 min，室溫下晾干，備用。

用微量注射器取1.25%(ω%)Nafion溶液5 μL滴凃在已處理過的GCE表面，自然晾干后置于0.05 mol/L Thi中浸泡30 min，取出、干燥，制得表面為深藍色的硫堇膜電極。再將修飾有Thi的電極浸泡在空心納米Pt-Au溶膠中，1 h后取出自然晾干。接著將上述修飾電極浸泡在anti-CEA與二次蒸餾水的混合溶液(V∶V=1∶1)中置于4℃的冰箱中，孵育8 h。最后用0.25%(ω%)的BSA溶液浸泡修飾電極30 min，取出，存放在4℃的冰箱中，備用。制備過程見圖1。

圖1 免疫傳感器的制備過程Fig.1Schematic diagram of the stempwise immunosensor construction process

1.4 檢測方法

實驗選用循環(huán)伏安法（Cyclic Voltammentry，CV）表征不同修飾階段下電極的電化學行為。電極測量采用三電極系統(tǒng)：Ag-AgCl電極為參比電極，鉑電極(Pt)為對電極，被修飾的GCE電極為工作電極。0.1 mol/L HAc-NaAc(pH=5.5)溶液為測試底液。-0.6～0.2 V范圍為循環(huán)伏安法的測試電位。掃描速率為50 mV/s。無特別說明，實驗均在25℃的溫度下進行。

2 結果與討論

2.1 免疫傳感器的電化學特性

運用CV法研究電極在制備過程的電化學特性。圖2中曲線a為GCE在0.1 mol/L KCl+HAc-NaAc(pH5.5)溶液中的掃描曲線。由圖可見，無氧化還原峰。這是由于測試底液中沒有氧化還原探針存在。曲線b為電極修飾了Nafion的循環(huán)伏安曲線。因為Nafion是大分子有機物會阻礙電子傳輸能力，其電化學過程是非可逆，所以電極上修飾Nafion后仍無氧化還原鋒[15]。當電極表面修飾上Thi后出現(xiàn)一對準可逆的氧化還原峰，這是由于Thi分子的-NH2與質子(H+)結合促進Thi的氧化還原。表明Thi有利于電子的傳遞(曲線c)[16]。納米空心Pt-Au微球通過靜電吸附到修飾電極上后，其氧化峰值進一步上升(曲線d)。這是因為Pt-Au良好導電性、大的比表面能加快電子的傳遞[17]。另外Pt-Au之間存在協(xié)同作用也會使電流值增加[18]。當anti-CEA通過自身的-NH2與Pt-Au形成π-π共軛固載到空心納米Pt-Au的表面[19]，其氧化鋒的電流值明顯降低（曲線e)，這是因為抗體是大分子蛋白質，且具有疏水性阻礙了電子的傳遞[20]。曲線f是用BSA封閉電極表面的非特異性吸附位點，氧化峰值進一步下降。當被修飾的電極在20 ng/mL CEA抗原中孵育15 min后，氧化峰電流值再次下降(曲線g)，表明結合形成的免疫復合物阻止了電子的傳輸[21]。

圖2 電極在修飾過程中的循環(huán)伏安圖Fig.2Cyclic voltammograms of different electrodes (a)bare GCE electrode;(b)Nafion/GCE;(c)Thi/Nafion/GCE (d)空心納米Pt-Au微球/Thi/Nafion/GCE; (e)anti-CEA/空心納米Pt-Au微球/Thi/Nafion/GCE (f)BSA/anti-CEA/空心納米Pt-Au微球/Thi/Nafion/GCE (g)CEA/BSA/anti-CEA/空心Pt-Au微球/Thi/Nafion/GCE

圖3是在HAc-NaAc(pH5.5)的溶液中，免疫傳感器以不同掃描速率的CV的表征圖。由內至外的掃描速度分別是：25、50、100、150、200、300、400、500、600、700 mV/s。隨著掃描速率的增加，氧化峰的電流值逐漸增長，還原峰的電流值逐漸減小，且氧化峰、還原峰的電流值分別與掃描速度的平方根呈線性關系（見插圖）。其氧化峰的線性方程為Current=3.0997v1/2+0.8659，相關系數(shù)為0.9996；還原峰的線性方程為Current=-2.8730 v1/2-3.4925，相關系數(shù)為-0.9974。表明該免疫傳感器的氧化還原反應受擴散過程的影響[20]。

2.2 實驗條件的優(yōu)化

2.2.1 緩沖溶液pH的優(yōu)化

pH對免疫電極的檢測的影響有兩個方面：一方面對抗體、抗原活性的影響；另一方面，蛋白質生物兼容性[10]。實驗探究緩沖溶液的pH值在3.5～7.0范圍內，免疫傳感器的電化學響應特性。由圖4可知，氧化峰電流值隨著緩沖液pH值增大而逐漸減小。H+過大有利于電子媒介Thi發(fā)生氧化還原反應，但H+過高引起蛋白質變性及縮短免疫傳感器使用壽命[22]，同時H+過低易引起蛋白質失活。因此，實驗選擇緩沖液的最佳pH值為5.5。

2.2.2 孵育時間的優(yōu)化

抗體與抗原的反應是一種動態(tài)平衡，不同的抗原與抗體反應的平衡常數(shù)不同[21]?？乖c抗體免疫結合的復合物會隨著結合時間延長而增加直至達到平衡態(tài)。實驗檢測了免疫傳感器在不同孵育時段的氧化峰電流值。圖5可見，在初始20 min內，氧化峰電流值隨著時間增大而減小，說明抗原、抗體在不斷進行特異性結合。20 min后峰電流值基本不變。表明20 min時免疫電極上復合物量達到基本恒定。因此選擇20 min為免疫孵育時間。

圖3 免疫電極在不同的掃描速率下的循環(huán)伏安圖（插圖：掃面速度的平方根與電流的關系圖）Fig.3Cyclic voltammograms of immunoelectrode at different scan rates. inset;plots of peak currents vs.v1/2

圖4 免疫傳感器在不同pH緩沖液下的循環(huán)伏安圖Fig.4Cyclic roltammograms of the immunosensor in buffer solution at various pH

圖5 孵育時間對免疫傳感器的影響Fig.5Effect of incubating time on immunoreaction

2.2.3 孵育溫度的優(yōu)化

溫度太低，蛋白質分子的活性下降，從而抗原與抗體結合的速率慢，反應時間長；溫度較高時，蛋白質分子活性高，抗原抗體結合的速率快，反應時間短[5]。然而，高溫會導致抗原和抗體蛋白失活或損失。實驗研究在5～45℃范圍內免疫傳感器的響應電流。由圖6結果表明，免疫傳感器的氧化峰電流值隨測試溫度的升高而降低，在接近人體體溫(37℃)時，免疫反應最充分，電流值最小。當再次升高溫度，免疫傳感器響應電流值升高，但過高溫度使部分復合物失活或變性。免疫傳感器長時間高溫下，不利于其本身的性能和壽命，因而選擇25℃為最佳孵育溫度。

2.3 免疫傳感器的性能

2.3.1 免疫傳感器對CEA抗原的響應標準曲線

在優(yōu)化實驗條件下，將免疫傳感器依次置于不同濃度的CEA抗原中孵育20 min后，進行CV表征。其氧化峰電流值隨著CEA抗原濃度的增加不斷減小(見圖7)。實驗結果表明，CEA濃度在0.1～80 ng/mL范圍內，免疫傳感器的氧化電流值與CEA濃度呈良好的線性關系。線性方程為Current=-0.0523c+14.69，相關系數(shù)為0.9932，該電極的檢出限為0.03 ng/mL。

圖6 孵育溫度對免疫傳感器的影響Fig.6Effect of incubating temperature on immunoreactions

圖7 峰電流與CEA抗原濃度的關系Fig.7Linear relationship between anodic peak current response

2.3.2 免疫傳感器的選擇性

考察了免疫傳感器在有干擾物的混合溶液中的選擇性。將免疫傳感器分別置于含80 ng/mL CEA抗原純溶液與含80 ng/mL CEA抗原及干擾物(AFP抗原、L-半胱氨酸、牛血清蛋白、抗壞血酸、葡萄糖)[19]的混合溶液中各孵育20 min，進行對比實驗。結果顯示，免疫傳感器在混合溶液中的電流值與僅含有80 ng/mL CEA抗原溶液中的電流值相差2.8%，表明該免疫傳感器的選擇性良好。

3 結論

實驗向預處理的GCE電極上滴涂Nafion，利用Nafion的磺酸基結合Thi，將Thi修飾在GCE電極上。利用Thi的-NH2將表面吸附有SeO32-的空心納米Pt-Au微球修飾在萘酚/硫堇膜表面，從而構建了一種新型的CEA免疫傳感器。該傳感器特點在于利用加大比表面的空心納米Pt-Au微球的空心結構及Pt-Au生物相容性，對抗原固定量方面有所提高。實驗表明，該CEA傳感器制備簡單，抗干擾能力強，為CEA的檢測提供了一個較好的方法，有望應用于臨床CEA檢測。

[1]安海珍,袁若,柴雅琴,等.基于聚硫堇、DNA納米銀復合物共修飾癌胚抗原免疫傳感器的研究[J].化學學報,2008,66(6):633-638.

[2]趙錦航,牛小方,鄭麗,等.基于HGB/PTh/AuNCs無標記癌胚抗原免疫傳感器的研究[J].化學研究與應用, 2014,26(5):652-657.

[3]王廣鳳,朱艷紅,陳玲,等.功能性納米材料在電化學免疫傳感器中的應用[J].分析化學評價與進展, 2013,41(4):608-615.

[4]朱宇萍,何偉,王碧.新型納米二氧化鈦的制備、表征及其在甲胎蛋白免疫傳感器中的應用[J].分析測試學報,2013,32(11):1322-1327.

[5]張萍,馮年平,武培怡.聚合物空心納米球及其在藥學領域的應用[J].上海:上海中醫(yī)藥大學藥劑教研室, 2006,30(8):350-353.

[6]朱宇萍,袁若,柴雅琴,等.基于碳納米管/L-半管氨酸/ Fe3O4@Au的納米復合材料的電流型甲胎蛋白免疫傳感器的研究[J].分析化學,2012,40(3):359-364.

[7]Su Hui lan,Yuan Ruo,Chai Ya qin,et al.An Amperometric α-1-Fetoprotein Immunosensor Based on Sandwich Nanohybrid of Functionalized Multi-walled Carbon Nanotubes[J].Journal of Instrumental Analysis,2012, 31(9):1064-1069.

[8]劉艷,石文兵.功能化石墨烯復合材料在電化學免疫傳感器中的應用[J].河南師范大學學報(自然科學版),2014,42(6):55-61.

[9]Hu Y,Jiang X Q,Ding Y,et al.Core-template-free strategy for preparing hollow nanospheres[J].AdvMater, 2004,16(11):933-937.

[10]梁敏.基于無機納米材料構建夾心免疫傳感器的研究[D].重慶:西南大學,2011.

[11]Chen Xian Guang,Qian Ying,Zhuang Su Juan,et al.Hydrogan peroxide Biosensor Based on Immobilizing Enzyme by Gold Nanoparticles and Thionine[J].Acta chimica sinice,2007,65(4):337-343.

[12]朱宇萍,袁若,柴雅琴,等.納米金與磁性納米復合物構建電流型免疫傳感器的研究[J].分析測試學報, 2012,31(4):423-429.

[13]顏亮亮,溫飛鵬,徐金龍,等.鉑-金-鉑納米空球的制備及其催化甲酸氧化性能[C].第十二屆全國有機分子電化學與工業(yè)學術會議論文集.上海:華東理工大學,2010.276-277.

[14]鐘艷,溫飛鵬,徐金龍,等.金-鉑納米空球催化甲醇氧化的行為[C].第十二屆全國有機分子電化學與工業(yè)學術會議論文集.上海:華東理工大學,2010.173-177.

[15]李娟,賈麗萍,姚飛,等.Nafion/DNA/納米鉑復合膜修飾電極的制備及其應用于多巴胺的高靈敏高選擇性測定[J].南京師大學報(自然學科版),2013,36(2): 67-73.

[16]李春香,曾云龍.基于原位電聚合硫堇的雙酶型葡萄糖傳感器的研究[J].分析科學學報,2006,22(3):339-341.

[17]劉珂珂,劉清,黃海平,等.基于聚(3,4-乙烯二氧噻吩) /天青I復合物薄膜和納米金修飾的電流型甲胎蛋白免疫傳感器的研究[J].分析化學,2014,42(2):192-196.

[18]李正.雙金屬納米粒子修飾電極的電催化及無試劑電化學免疫傳感器研究[D].江蘇:蘇州大學,2008.

[19]冉小琪.基于納米材料構建甲胎蛋白、癌胚抗原及人絨毛膜促性腺激素電化學免疫傳感器的研究[D].重慶:西南大學,2011.

[20]余晟,劉雪,余萌,等.石墨烯修飾離子液體電極制備癌胚抗原免疫傳感器[J].信陽師范學院學報(自然科學版),2012,25(2):530-533.

[21]管姝,袁若,柴雅琴,等.基于聚2,6-二氨基吡啶膜及納米金修飾的癌胚抗原免疫傳感器研究[J].化學學報,2009,67(16):1923-1928.

[22]劉亞西.基于納米材料構建癌胚抗原及甲胎蛋白電化學免疫傳感器的研究[D].重慶:西南大學,2010.

Study on the carcinoembryonic antigen immunosensor modified by Pt-Au hollow nanocomposites

Zhu Yu-ping*，Liu Dan-dan
(College of Chemistry and Chemical Engineering，Neijiang Normal University，Neijiang 641112，China)

The Pt-Au hollow nanocomposites was prepared by template sacrifice.By bonding action,the nafion/ thionine was modified on the surface of the glassy carbon electrode.The Pt-Au hollow nanocomposites on which surface the selenite anion was adsorbed,were modified on the surface of the nafion/thionine film by the amidogen of the thionine,to immobilize antibody CEA to construct the CEA immunosensor.The conconstruction process and performance of the electrode were measured.The result showed that the immunosensor had well current response for CEA.Under the optimal conditions,in the concentration of CEA of 0.1～80 ng/mL,the linear relation was well,and the detection limit was 0.03 ng/mL.The immunosensor could be used for the clinical detection of CEA.

CEA;immune sensor;hollow nanocomposites;thionine;Pt-Au

四川省教育廳科研項目（15ZA0292）

*通信聯(lián)系人,Tel：13696067037，E-mail：judy20060830@163.com