杜湛湛，張　嬙，2，徐　平，王玉芬，葉　明（.合肥工業(yè)大學(xué)生物與食品工程學(xué)院，安徽合肥　230009；2.北方民族大學(xué)生物科學(xué)與工程學(xué)院，寧夏銀川　75002）

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粒毛盤菌多糖純化、硫酸酯化修飾及抗氧化活性評價(jià)

杜湛湛1，張嬙1，2，徐平1，王玉芬1，葉明1
（1.合肥工業(yè)大學(xué)生物與食品工程學(xué)院，安徽合肥230009；2.北方民族大學(xué)生物科學(xué)與工程學(xué)院，寧夏銀川750021）

摘要：文章以粒毛盤菌（Lachnum）為試驗(yàn)菌株，對其胞外多糖（LEP）進(jìn)行純化，并對獲得的均一組分LEP-1進(jìn)行硫酸酯化修飾，對修飾前多糖（LEP-1）和修飾后多糖（SLEP-1）進(jìn)行了掃描電子顯微鏡、紫外和紅外光譜表征，同時(shí)評價(jià)了兩者的體外抗氧化活性。結(jié)果表明：LEP-1是由葡萄糖和甘露糖組成的雜多糖，分子量約為473 kDa；SLEP-1的硫酸根取代度（DS）為1.97；SEM圖顯示修飾前后多糖表面形態(tài)由片狀變化為網(wǎng)狀；LEP-1的紅外光譜圖中有多糖的特征吸收峰，SLEP-1的紅外光譜圖除多糖的特征吸收峰外，在1 220 cm-1和818 cm-1處出現(xiàn)硫酸基團(tuán)的特征吸收峰；LEP-1和SLEP-1對·OH、DPPH·和O2-·有很強(qiáng)的清除作用，

SLEP-1的清除能力大于LEP-1，兩者均呈現(xiàn)一定的劑量效應(yīng)關(guān)系。因此，LEP-1和SLEP-1均有明顯的抗氧化活性，且可作為天然抗氧化劑應(yīng)用于食品和醫(yī)藥行業(yè)。

關(guān)鍵詞：粒毛盤菌；胞外多糖；修飾；抗氧化活性

葉明（1959-），男，安徽懷寧人，博士，合肥工業(yè)大學(xué)教授，博士生導(dǎo)師.

真菌多糖具有抗氧化、降血糖及免疫調(diào)節(jié)等多種生物活性，多年來一直受到研究者的廣泛關(guān)注［1］。不同來源的真菌多糖具有的生物活性強(qiáng)弱存在差別，這與多糖復(fù)雜的結(jié)構(gòu)有關(guān)，即真菌多糖的一級結(jié)構(gòu)和高級結(jié)構(gòu)均可在不同程度上影響多糖的活性［2-4］，并且選擇合適的化學(xué)修飾方法可以改變多糖原有生物活性強(qiáng)弱或使多糖產(chǎn)生新的活性［5-6］。研究表明，黑靈芝（Ganoderma atrum）多糖進(jìn)行硫酸酯化修飾后，不同取代度的硫酸酯化多糖的免疫調(diào)節(jié)和抗氧化活性大小不同，其中對DPPH·清除率比修飾前有所提高，還原力和總抗氧化力下降［7］；香菇多糖經(jīng)硫酸化修飾后，抗腫瘤、抗凝血和免疫調(diào)節(jié)作用得到很大提高，而且具有明顯的抗艾滋病毒效果［5］。

粒毛盤菌屬（Lachnum）是屬于柔膜菌目（Helotiales）晶杯菌科（Hyaloscyphaceae）的一類腐生性真菌［8］，其多糖有同多糖和雜多糖之分，具有多種不同的結(jié)構(gòu)，有抗氧化、抗衰老和抗腫瘤等多種生物活性［1-2，9］，進(jìn)行磷酸化、羧甲基化和硫酸化等化學(xué)修飾后其抗腫瘤、抗慢性腎衰和抗氧化活性都有不同程度的提高［1-2，10-11］。

本文從一株粒毛盤菌的發(fā)酵液中提取純化出一種胞外多糖（LEP-1），對其進(jìn)行結(jié)構(gòu)表征和硫酸酯化修飾，并研究其修飾前后結(jié)構(gòu)的變化，初步評價(jià)兩者的體外抗氧化活性。

1　材料與方法

1.1材料與儀器

菌種及其發(fā)酵培養(yǎng)基：粒毛盤菌YM268子實(shí)體采集于安徽黃山，由合肥工業(yè)大學(xué)微生物資源與應(yīng)用研究所分離保藏。發(fā)酵培養(yǎng)基：無水葡萄糖30 g/L，酵母膏5 g/L，MgSO47H2O 1.0 g/L，KH2PO41.0 g/L，VB150 mg/L，pH自然。

試劑：無水葡萄糖，分析純，天津市光復(fù)科技發(fā)展有限公司；酵母膏，生物試劑，北京奧博星生物技術(shù)有限責(zé)任公司；抗壞血酸（VC），分析純，上海展云化工有限公司。

儀器：Sephadex G-100（法瑪西亞公司）、GCMS分析儀（日本津島公司）、Waters-1515 HPLC系統(tǒng)（Waters-1515型HPLC泵、Waters-2414視差遮光監(jiān)測器，Waters公司）、SU8020場發(fā)射掃描電子顯微鏡（日本日立公司）。

1.2發(fā)酵與胞外多糖的提取

將粒毛盤菌YM268種子液接種于100 L的發(fā)酵罐中發(fā)酵，攪拌速度為160 r/min，發(fā)酵溫度為26℃，發(fā)酵時(shí)間為8 d。將發(fā)酵液旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)濃縮，3倍體積的95%乙醇醇沉24 h，4 500 r/min離心8 min，蒸餾水復(fù)溶。將得到的粗多糖脫蛋白、脫色、透析（透析袋13 kDa）和凍干。將初級純化后的多糖用雙蒸水配成0.15 mg/mL的溶液［12］。采用Sephadex G-100色譜柱，進(jìn)樣量為1 mL，以雙蒸水洗脫（收集器4 min 2 mL每管）。繪制洗脫曲線，收集主要組分并命名為LEP-1［11］。

1.3LEP-1的純度和分子量測定

用高效液相凝膠滲透色譜（HPGPC）法測定LEP-1的純度和分子量，以雙蒸水為流動相，流速為0.5 mL/min，柱溫為35℃。根據(jù)洗脫峰型分布判斷樣品純度，并由葡聚糖標(biāo)品的標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算分子量［11-12］。

1.4單糖組分分析

依據(jù)文獻(xiàn)［12］的方法，將干燥的LEP-1水解、還原和乙?；?，用GC-MS檢測完全水解的LEP-1的乙酰化衍生物，然后用NIST 11 MS Database和MS Search Program v.2.0分析得出色譜數(shù)據(jù)。GC-MS條件［12］如下：HP-5型適應(yīng)毛細(xì)血管柱（30 m×0.25 mm×0.25 μm）；柱溫采用程序升溫，起始溫度為50℃，以10℃/min速度升至250℃，進(jìn)樣口溫度為260℃；離子源，EI，70 eV；He流速為1 mL/min；分子量范圍為35～650 aum/s。

1.5.1SLEP-1的制備

將90 mL吡啶加入附有冷凝管和溫度計(jì)的250 mL三頸瓶中，用電磁加熱攪拌器攪拌，同時(shí)緩慢加入三氧化硫-吡啶的質(zhì)量為7.5～9.0 g。加熱至90℃，再加入LEP-1粉末1.5 g，恒溫?cái)嚢? h，冷卻至室溫。反應(yīng)液用3 mol/L的NaOH溶液調(diào)至中性，加入5倍體積的95%乙醇，靜置24 h。離心，將沉淀物復(fù)溶于水，分別用自來水和蒸餾水透析2 d和1 d，過濾，冷凍干燥，得硫酸酯化多糖，命名為SLEP-1［13］。

1.5.2SLEP-1硫酸基質(zhì)量分?jǐn)?shù)的測定

精密稱取105℃干燥至恒質(zhì)量的108.75 mg K2SO4，以1 mol/L的HCl溶解，于100 mL容量瓶中定容，搖勻即得硫酸根標(biāo)準(zhǔn)貯備液（0.6 mg/mL）。分別準(zhǔn)確吸取硫酸根標(biāo)準(zhǔn)貯備液0、0.04、0.08、0.12、0.16、0.20 mL，均以HCl溶液增加至0.20 mL，加入3%的三氯乙酸3.8 mL及氯化鋇-明膠溶液（用0.5%明膠溶液配制BaCl2質(zhì)量分?jǐn)?shù)為1%的溶液）1.0 mL，搖勻，室溫靜置15 min后于360 nm測吸光度A1，以1.0 mL的0.5%明膠溶液代替氯化鋇-明膠溶液重復(fù)上述操作，測吸光度A2，以硫酸根質(zhì)量為橫坐標(biāo)，吸光度差值（A1-A2）為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線［14］。

將3 mg SLEP-1溶于3 mL 1 mol/L HCl溶液，100°C沸水浴1 h后吸取0.2 mL，按標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作方法，測定A1和A2，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程計(jì)算硫酸基質(zhì)量分?jǐn)?shù)。

多糖中取代基（substituent）的質(zhì)量分?jǐn)?shù)［9］w可表示為：

所以硫酸取代度DS為：

其中，162為一個(gè)單糖殘基的相對分子質(zhì)量；Msub為取代基的摩爾質(zhì)量，Msub＝81。

Paula Pérez Sobrino（2014：137-168）認(rèn)為多模態(tài)隱喻理論需要進(jìn)一步發(fā)展，需要建立概念相互作用模式賦予多模態(tài)信息更豐富的內(nèi)涵。比如需要建立動態(tài)多模態(tài)概念整合模式(multi-modal conceptual integration patterns)以探究多模態(tài)表達(dá)結(jié)構(gòu)。該模式下多模態(tài)輸入的創(chuàng)造性融合在很大程度上受多模態(tài)隱喻和轉(zhuǎn)喻的復(fù)合體的互相作用的制約和引導(dǎo)。

1.6掃描電子顯微鏡分析

利用場發(fā)射掃描電子顯微鏡觀察LEP-1和SLEP-1的表面結(jié)構(gòu)特征。取適量粉末，分別粘于實(shí)驗(yàn)臺的導(dǎo)電膠上，用洗耳球吹去浮樣，真空噴金，進(jìn)行SEM觀察。然后利用SEM系統(tǒng)在3.0 kV加速電壓下測定，圖像的放大倍率為500倍和2 000倍。

1.7紫外與紅外光譜分析

采用安捷倫CARY 5000紫外可見近紅外分光光度計(jì)對LEP-1和SLEP-1進(jìn)行紫外光譜分析，掃描范圍為190～2 500 nm；采用Nicolet 67型傅立葉紅外光譜儀對LEP-1和SLEP-1進(jìn)行紅外光譜分析，掃描范圍為4 000～400 cm-1。

1.8LEP-1和SLEP-1的抗氧化活性測定

1.8.1對·OH的清除作用

取5×l0-3mol/L鄰二氮菲溶液1.5 mL，加pH值為7.4、0.05 mol/L的磷酸緩沖液2.0 mL混勻，加7.5×10-3mol/L FeSO4溶液1.0 mL，每加1管立即混勻，再加入1 mL H2O2（0.1%），最后以蒸餾水增加至總體積為10 mL。反應(yīng)液在37℃保溫1 h，在536 nm下測A損傷。測定LEP-1和SLEP-1溶液及Vc清除·OH的作用：依上述步驟分別加入不同質(zhì)量濃度的LEP-1、SLEP-1和Vc溶液后再加H2O2，在37℃下保溫1 h，測A加樣。未損傷管不加H2O2及多糖溶液或Vc溶液，測A未損傷［15-16］。

清除率的計(jì)算公式為：

1.8.2對DPPH·的清除作用

配制0.1 mmol/L的DPPH·無水乙醇溶液，取1 mL DPPH·溶液，與3 mL不同質(zhì)量濃度的LEP-1、SLEP-1和Vc溶液混勻，黑暗環(huán)境下靜置30 min，517 nm處測混合液的吸光度A樣品，測定無水乙醇溶液作為空白對照的吸光度A空白［17］。

清除率的計(jì)算公式為：。

1.8.3對O2-·的清除作用

每支試管加入3 mL 50 mmol/L Tirs-HCl（pH ＝8.2）緩沖液，1 mL不同質(zhì)量濃度的LEP-1、SLEP-1和Vc溶液，混勻后于25℃下保溫20 min，加入經(jīng)25℃預(yù)熱0.3 mL 7 mmol/L鄰苯三酚溶液，準(zhǔn)確反應(yīng)4 min，加1 mL 10 mmol/L HCl終止反應(yīng)，在318 nm處測吸光度A1、以水代替反應(yīng)試劑的吸光度A1'、以水代替樣品溶液的吸光度A0［17］。

清除率的計(jì)算公式為：

1.9數(shù)據(jù)分析

所有實(shí)驗(yàn)均重復(fù)3次，數(shù)據(jù)取平均值±標(biāo)準(zhǔn)差，采用DPS數(shù)據(jù)處理軟件對實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析處理。

2　結(jié)果與討論

2.1LEP的分離純化

從粒毛盤菌YM268的發(fā)酵液中提取得到胞外粗多糖（LEP），其得率約為0.15 g/L。

冷凍干燥的LEP粗品經(jīng)Sephadex G-100分離后，得到2種多糖組分，分別命名為LEP-1和LEP-2，收集主要組分LEP-1進(jìn)行以下實(shí)驗(yàn)，洗脫曲線如圖1所示。

圖1　LEP的Sephadex G-100柱層析圖譜

LEP-1的高效液相凝膠滲透色譜圖如圖2所示，由圖2可看出，LEP-1以一個(gè)單一對稱峰在23.53 min時(shí)出現(xiàn)，這表明LEP-1均一性較好［11］。通過標(biāo)準(zhǔn)曲線log MW＝595＋93.50t - 11.45t2＋0.68t3（t為洗脫時(shí)間）計(jì)算得出LEP-1的平均分子量約為473 kDa。

GC-MS軟件分析LEP-1水解的乙?；a(chǎn)物組成如圖3所示，由圖3可看出，保留時(shí)間為19.198 min和19.356 min時(shí)出現(xiàn)峰，說明LEP-1是由葡萄糖和甘露糖組成的雜多糖。

圖2　LEP-1的高效液相凝膠滲透色譜圖

圖3　LEP-1水解的乙?；a(chǎn)物的總離子流色譜圖

2.2SLEP-1的硫酸取代度

硫酸根標(biāo)準(zhǔn)曲線如圖4所示。

圖4　硫酸根質(zhì)量濃度標(biāo)準(zhǔn)曲線

回歸方程為：

Y＝0.018 47 X＋1.999 4，R2＝0.994 7。

據(jù)該方程計(jì)算得SLEP-1中—SO3H的質(zhì)量分?jǐn)?shù)為66.17%，從而得SLEP-1的硫酸基團(tuán)取代度DS＝1.97。

2.3LEP-1和SLEP-1的掃描電子顯微鏡分析

掃描電子顯微鏡圖如圖5所示，由圖5可看出，LEP-1呈多層片狀，表面較為平整，說明多糖分子間交聯(lián)緊密，分子間相互作用強(qiáng)，且與LEP-1的高分子量的特性有關(guān)［18］。SLEP-1呈網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，且網(wǎng)孔大小不一，隨著放大倍數(shù)的增加，可以看出SLEP-1也為片層狀。與LEP-1相比，SLEP-1中網(wǎng)孔的出現(xiàn)可能是由于在化學(xué)修飾過程中多糖微觀學(xué)的物理表象發(fā)生了變化。由此可知，用化學(xué)方法對多糖這種大分子物質(zhì)進(jìn)行修飾，可能使其微觀學(xué)上的物理表象有一定的變化，而這種變化也可能成為對修飾結(jié)果做出判斷的依據(jù)之一。

圖5　LEP-1和SLEP-1的掃描電鏡圖

2.4LEP-1和SLEP-1的紫外和紅外光譜

LEP-1和SLEP-1的紫外光譜圖如圖6所示。

圖6　LEP-1和SLEP-1的紫外光譜圖

由圖6可看出，LEP-1在197 nm處有多糖的特征吸收峰，260 nm和280 nm之間無吸收峰出現(xiàn)，說明LEP-1中無蛋白質(zhì)和核酸；SLEP-1在264 nm附近出現(xiàn)了一個(gè)新的寬吸收峰，是—S—O—/—SO3的特征吸收峰，即硫酸根基團(tuán)的n→π*電子躍遷導(dǎo)致，說明硫酸酯化修飾成功［19］。

LEP-1紅外光譜如圖7所示，由圖7可知，3 390 cm-1處的寬峰為O—H基團(tuán)的振動峰［20］；2 930 cm-1處的信號峰為—CH的伸縮振動峰；1 640 cm-1的信號峰說明結(jié)合水的存在［11］；1 410 cm-1為C—H彎曲振動吸收峰；1 140 cm-1為—COOH的吸收峰。950～1 200 cm-1信號峰表明LEP-1中有吡喃糖［21］；910 cm-1為吡喃葡萄糖環(huán)的不對稱伸縮振動引起的［22］；812 cm-1的特征吸收峰表明α構(gòu)型多糖的存在，也可能是吡喃糖環(huán)引起的［23］。

圖7　LEP-1和SLEP-1的紅外光譜圖

硫酸化修飾后，碳水化合物的特征峰呈現(xiàn)出了一定的變化。SLEP-1在2 930 cm-1的亞甲基中C—H伸縮振動峰（即單糖殘基的C-6的特征吸收峰）和在1 410 cm-1的甲基和亞甲基的C—H變角振動吸收峰均比LEP-1顯著減弱。這是因?yàn)镃-6位上的羥基由于空間位阻較小且不參與形成穩(wěn)定多糖高級結(jié)構(gòu)的氫鍵，比較活潑［24］，所以硫酸酯化通常易在C-6發(fā)生取代，從而對亞甲基的影響較大［25］。SLEP-1在1 220 cm-1處出現(xiàn)一個(gè)新的吸收峰，為—O—SO3H中S＝O的伸縮振動峰，且在818 cm-1處有C—O—S伸縮振動吸收。

2.5LEP-1和SLEP-1的抗氧化活性

2.5.1LEP-1和SLEP-1對·OH的清除作用

鄰二氮菲與Fe2＋形成的絡(luò)合物在536 nm處有最大吸收峰，是一種常用的氧化還原指示劑。Fenton反應(yīng)產(chǎn)生的·OH能夠氧化Fe2＋-鄰二氮菲絡(luò)合物為Fe2＋-鄰二氮菲，使其最大吸收峰消失。

LEP-1和SLEP-1對·OH的清除作用如圖8所示。由圖8可知，LEP-1和SLEP-1對·OH均有一定的清除作用。當(dāng)質(zhì)量濃度小于250 mg/L時(shí)，LEP-1和SLEP-1對·OH的清除率隨質(zhì)量濃度的增大而升高；當(dāng)質(zhì)量濃度大于250 mg/L時(shí)，LEP-1 和SLEP-1對·OH的清除率升高趨勢趨于平緩。但是，兩者對·OH的清除率均小于對照組Vc。 LEP-1和SLEP-1對·OH的清除作用可能是通過糖醛酸與亞鐵離子耦合，進(jìn)而抑制·OH產(chǎn)生；也可能通過提供H原子，與·OH結(jié)合成水，達(dá)到清除自由基的效果［26］；另有研究表明，多糖對·OH的清除作用與糖鏈上所攜帶的負(fù)電荷有關(guān)，這也解釋了SLEP-1比LEP-1對·OH清除率高的原因［27］。但是，LEP-1和SLEP-1具體的抗氧化機(jī)制有待進(jìn)一步驗(yàn)證。

圖8　LEP-1和SLEP-1對·OH的清除作用

2.5.2LEP-1和SLEP-1對DPPH·的清除作用

DPPH·溶液具有特征的紫紅色團(tuán)吸收峰，自由基清除劑可使其單電子配對，從而使其吸收逐漸消失，其褪色程度與其所接受的電子數(shù)成定量關(guān)系。LEP-1和SLEP-1對DPPH·的清除作用如圖9所示。

圖9　LEP-1和SLEP-1對DPPH·的清除作用

由圖9可知，LEP-1和SLEP-1對DPPH的清除作用逐漸增強(qiáng)。當(dāng)質(zhì)量濃度小于100 mg/L時(shí)，兩者差別較小；當(dāng)質(zhì)量濃度大于100 mg/L時(shí)，SLEP-1對DPPH·的清除率大于LEP-1，并且差別逐漸增大。但是，兩者對DPPH·的清除率均小于對照組Vc。SLEP-1具有較強(qiáng)的DPPH·清除能力，可能是—OSO3H基團(tuán)激活了異頭碳上的氫原子，且激活程度越高，供氫能力越強(qiáng)，抗氧化能力越強(qiáng)［28］。

2.5.3LEP-1和SLEP-1對O2-·的清除作用

鄰苯三酚在堿性溶液中易發(fā)生自氧化反應(yīng)，通過接受1個(gè)電子，生成超氧陰離子自由基和有色中間物質(zhì)，隨著時(shí)間的延長，有色產(chǎn)物得到積累，LEP-1可將O2-·歧化分解成H2O2和O2，進(jìn)而抑制鄰苯三酚的自氧化速率。LEP-1和SLEP-1對O2-·的清除作用如圖10所示。

圖10　LEP-1和SLEP-1對O2-·的清除作用

由圖10可知，隨著質(zhì)量濃度的增加，LEP-1 和SLEP-1對O2-·的清除率均增加，并呈現(xiàn)一定的劑量效應(yīng)關(guān)系。當(dāng)質(zhì)量濃度為250 mg/L時(shí)，LEP-1和SLEP-1對O2-·的清除率分別為53.85%和58.47%，且大于該質(zhì)量濃度時(shí)趨于平緩。但是，SLEP-1對O2-·的清除率整體略高于LEP-1，明顯低于對照組Vc。SLEP-1因?yàn)榱蛩峄鶊F(tuán)（吸電子基團(tuán)）的存在，O—H的解離能較弱，從而為O2-·供氫，表現(xiàn)出較強(qiáng)的清除能力［29-30］。另有研究表明，硫酸酯化修飾可能打破了不舒展構(gòu)象造成的羥基被包裹在分子內(nèi)形成的分子內(nèi)氫鍵，并使羥基釋放出來［31］，從而提高抗氧化活性。

3　結(jié)束語

本文對從粒毛盤菌YM268中分離純化得到LEP-1，經(jīng)GC-MS分析水解的乙?；a(chǎn)物得出LEP-1是一種由葡萄糖和甘露糖組成的雜多糖；LEP-1的HPGPC圖譜表明其分子量約為473 kDa；用三氧化硫-吡啶法測定硫酸酯化修飾后得到的SLEP-1的DS為1.97；SEM圖顯示硫酸酯化修飾后多糖的表面形態(tài)由多層片狀變?yōu)槎鄬泳W(wǎng)狀結(jié)構(gòu)。

SLEP-1對·OH、DPPH·和O2-·的清除作用比LEP-1強(qiáng)，且存在劑量效應(yīng)關(guān)系，故LEP-1 和SLEP-1可以作為天然抗氧化劑應(yīng)用到食品和醫(yī)藥中。LEP-1硫酸酯化修飾后抗氧化活性的增強(qiáng)可能是由—OSO3H的引入和原有構(gòu)象的改變引起的。因此，本研究為進(jìn)一步探究不同化學(xué)修飾方法對粒毛盤菌多糖的抗氧化活性的影響提供了理論依據(jù)。

［參考文獻(xiàn)］

［1］Qiu T，Ma X，Ye M，et al.Purification，structure，lipid lowering and liver protecting effects of polysaccharide from Lachnum YM281［J］.Carbohydrate Polymers，2013，98（1）：922-930.

［2］Ye M，Yuan R，He Y，et al.Phosphorylation and anti-tumor activity of exopolysaccharide from Lachnum YM120［J］.Carbohydrate Polymers，2013，97（2）：690-694.

［3］胡順珍，賈樂.食藥用真菌多糖構(gòu)效關(guān)系研究進(jìn)展［J］.生物技術(shù)通報(bào)，2007（4）：42-44.

［4］鄧超，鄔敏辰.食用菌深層發(fā)酵及其多糖活性研究進(jìn)展［J］.安徽農(nóng)業(yè)科學(xué)，2007，35（15）：4622-4625.

［5］趙曉燕，王長云.分子修飾在多糖構(gòu)效關(guān)系研究中的應(yīng)用［J］.海洋湖沼通報(bào)，2000（3）：10-14.

［6］Ma L，Chen H，Zhang Y，et al.Chemical modification and antioxidant activities of polysaccharide from mushroom Inonotus obliquus［J］.Carbohydrate Polymers，2012，89（2）：371-378.

［7］Chen Y，Zhang H，Wang Y，et al.Sulfated modification of the polysaccharides from Ganoderma atrum and their antioxidant and immunomodulating activities［J］.Food Chemistry，2015，186：231-238.

［8］孫柘，邱濤，袁如月，等.粒毛盤菌多糖脫蛋白方法及其條件優(yōu)化［J］.浙江大學(xué)學(xué)報(bào)：農(nóng)業(yè)與生命科學(xué)版，2012，38（4）：519-523.

［9］He Y L，Ye M，Jing L Y，et al.Preparation，characterization and bioactivities of derivatives of an exopolysaccharide from Lachnum［J］.Carbohydrate Polymers，2015，117：788-796.

［10］Wu Y，Ye M，Du Z，et al.Carboxymethylation of an exopolysaccharide from Lachnum and effect of its derivatives on experimental chronic renal failure［J］.Carbohydrate Polymers，2014，114（19）：190-195.

［11］He Y，Ye M，Du Z，et al.Purification，characterization and promoting effect on wound healing of an exopolysaccharide from Lachnum YM405［J］.Carbohydrate Polymers，2014，105 （25）：169-176.

［12］Ye M，Qiu T，Peng W，et al.Purification，characterization and hypoglycemic activity of extracellular polysaccharides from Lachnum calyculiforme［J］.Carbohydrate Polymers，2011，86 （1）：285-290.

［13］田庚元，李壽桐，宋麥麗，等.牛膝多糖硫酸酯的合成及其抗病毒活性［J］.藥學(xué)學(xué)報(bào)，1995，30（2）：107-111.

［14］李珺，鐘耀廣，劉長江.香菇多糖硫酸酯化修飾的研究［J］.遼寧農(nóng)業(yè)科學(xué)，2010（1）：14-16.

［15］劉培勛，高小榮，徐文清，等.銀耳堿提多糖抗氧化活性的研究［J］.中藥藥理與臨床，2005，21（4）：35-37.

［16］陳吳西，蔡敬民，邱濤，等.Lachnum YM328多糖發(fā)酵條件優(yōu)化及抗氧化性［J］.合肥工業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)：自然科學(xué)版，2011，34（2）：300-303，312.

［17］葉明，李世艷，楊柳，等.禾本科粒毛盤菌多糖提取及其抗氧化活性研究［J］.浙江大學(xué)學(xué)報(bào)：農(nóng)業(yè)與生命科學(xué)版，2009，35（2）：153-157.

［18］劉阿娟，張靜，張化朋，等.虎奶菇菌核多糖SHNP的分離純化及形貌觀測［J］.農(nóng)產(chǎn)品加工：學(xué)刊，2013（9）：66-69.

［19］Racaud A，Allouche A R，Antoine R，et al.UV electronic excitations in acidic sugars［J］.Journal of Molecular Structure：THEOCHEM，2010，960（1/2/3）：51-56.

［20］Zhang T，Marchant R E.Novel polysaccharide surfactants：the effect of hydrophobic and hydrophilic chain length on surface active properties［J］.Journal of Colloid and Interface Science，1996，177（2）：419-426.

［21］Chen J，Yong Y，Xing M，et al.Characterization of polysaccharides with marked inhibitory effect on lipid accumulation in Pleurotus eryngii［J］.Carbohydrate Polymers，2013，97（2）：604-613.

［22］Chen Y，Mao W，Gao Y，et al.Structural elucidation of an extracellular polysaccharide produced by the marine fungus Aspergillus versicolor［J］.Carbohydrate Polymers，2013，93（2）：478-483.

［23］Wang X，Sun R，Zhang J，et al.Structure and antioxidant activity of polysaccharide POJ-U1a extracted by ultrasound from Ophiopogon japonicus［J］.Fitoterapia，2012，83（8）：1576 -1584.

［24］王順春，方積年.香菇多糖硫酸化衍生物的制備及其結(jié)構(gòu)分析［J］.生物化學(xué)與生物物理學(xué)報(bào)，1999，31（5）：594-597.

［25］Yang J，Du Y，Wen Y，et al.Sulfation of Chinese lacquer polysaccharides in different solvents［J］.Carbohydrate Polymers，2003，52（4）：397-403.

［26］Barahona T，Encinas M V，Mansilla A，et al.A sulfated galactan with antioxidant capacity from the green variant of tetrasporic Gigartina skottsbergii（Gigartinales，Rhodophyta）［J］.Carbohydrate Research，2012，347（1）：114-120.

［27］王元鳳，金征宇，彭永華，等.硫酸酯化茶多糖的制備及清除羥自由基活性的研究［J］.食品工業(yè)，2009（2）：1-4.

［28］Wang J，Guo H，Zhang J，et al.Sulfated modification，characterization and structure-antioxidant relationships of Artemisia sphaerocephala polysaccharides［J］.Carbohydrate Polymers，2010，81（4）：897-905.

［29］Zhu X Y，Wu J M，Jia Z S.Superoxide anion radical scavenging ability of quaternary ammonium salt of chitosan［J］.Chinese Chemical Letters，2004，15（7）：808-810.

［30］Zhang Z，Wang F，Wang X，et al.Extraction of the polysaccharides from five algae and their potential antioxidant activity in vitro［J］.Carbohydrate Polymers，2010，82（1）：118-121.

［31］柳紅.南瓜多糖的修飾、結(jié)構(gòu)分析及抗氧化活性的研究［D］.西安：陜西師范大學(xué)，2008.

（責(zé)任編輯閆杏麗）

Purification and sulfated modification of a Lachnum polysaccharide and evaluation of its antioxidant activity

DU Zhan-zhan1，ZHANG Qiang1，2，XU Ping1，WANG Yu-fen1，YE Ming1
（1.School of Biotechnology and Food Engineering，Hefei University of Technology，Hefei 230009，China；2.College of Biological Science and Engineering，Beifang University of Nationalities，Yinchuan 750021，China）

Abstract：A polysaccharide isolated from Lachnum（LEP）was purified，and one of its faction（LEP-1）separated with Sephadex G-100 was sulfated，named as SLEP-1.The LEP-1 and SLEP-1 were characterized by scanning electron microscope（SEM），UV and FT-IR spectra，and the antioxidant activities of them were also evaluated.The results showed that LEP-1 was a heteropolysaccharide，and consisted of glucose and mannose with the molecular weight of about 473 kDa.The degree of substitution（DS）of sulfated polysaccharide was 1.97.The SEM pictures showed that the surface morphology of LEP-1 was changed from laminar structure to reticulum after sulfation.The characteristic absorption peaks of polysaccharides appeared in the FT-IR spectrum of LEP-1，while the FT-IR spectrum of SLEP-1 also had the characteristic absorption peaks of polysaccharides，and the characteristic absorption peaks of sulfate groups of SLEP-1 appeared at 1 220 cm-1and 818 cm-1at the same time.The scavenging abilitie peaks of LEP-1 and SLEP-1 on·OH，DPPH·and O2-·were strong，the scavenging ability of SLEP-1 was stronger than LEP-1 and both of them showed a certain degree of dose-response relationship.Therefore，both of LEP-1 and SLEP-1 had obvious antioxidant activities，and they could be applied as natural antioxidant in food and pharmaceutical industries.

Key words：Lachnum；polysaccharide；modification；antioxidant activity

作者簡介：杜湛湛（1990-），女，河南鹿邑人，合肥工業(yè)大學(xué)碩士生；

基金項(xiàng)目：國家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目（31470146）

收稿日期：2014-12-10；修回日期：2015-03-04

Doi：10.3969/j.issn.1003-5060.2016.01.025

中圖分類號：Q949.32；TS201.23

文獻(xiàn)標(biāo)識碼：A

文章編號：1003-5060（2016）01-0134-07