張開雪，劉振鵬，閆 嵩，任偉超，劉秀波，馬 偉

（黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院 哈爾濱 150040）

黃芪次生代謝研究進(jìn)展＊

張開雪，劉振鵬，閆 嵩，任偉超，劉秀波，馬 偉＊＊

（黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院 哈爾濱 150040）

目的：黃芪為豆科植物，它的生物活性成分種類很多，且都有不同的藥理作用。黃芪內(nèi)生真菌的報道很少，所以對它的研究才剛剛開始。植物次生代謝網(wǎng)絡(luò)復(fù)雜，利用誘導(dǎo)子提高植物特定代謝途徑的次生代謝產(chǎn)物的產(chǎn)量，對生物合成途徑進(jìn)行調(diào)控。誘導(dǎo)子分為生物誘導(dǎo)子和非生物誘導(dǎo)子，而關(guān)于誘導(dǎo)子的作用機(jī)理，只有一個初步的假說，沒有作用機(jī)理的指導(dǎo)，篩選也較盲目。為了消除試驗(yàn)的背景噪音，無土栽培方式在植物內(nèi)生真菌及根際微生物研究中，消除了土壤菌群的影響。隨著新學(xué)科的產(chǎn)生和新技術(shù)的發(fā)展，組學(xué)技術(shù)、新一代測序技術(shù)應(yīng)運(yùn)而生，并在各個領(lǐng)域得到廣泛應(yīng)用。

黃芪 次生代謝 誘導(dǎo)子 無土栽培 組學(xué)技術(shù) 新一代組學(xué)技術(shù)

《中國藥典》（2015版）規(guī)定，黃芪是蒙古黃 芪 Astragalus membranaceus （Fisch.）Bge.var. mongholicus (Bge.) Hsiao或 膜 莢 黃 芪 Astragalus membranaceus （Fisch.）Bge.的干燥根，而蒙古黃芪是膜莢黃芪的變種。黃芪又稱戴糝、芰草、百木、黃耆，首載于中國古代第一部本草著作《神農(nóng)本草經(jīng)》，味甘，性微溫，歸肺、脾經(jīng)，具有補(bǔ)氣升陽，固表止汗，利水消腫，生津養(yǎng)血，行滯通痹，托毒排膿，斂瘡生肌等功效[1-6]。其基原為豆科黃芪屬Astragalus Linn.植物，多年生草本，全世界共有11個亞屬2 000余種，中國有8個亞屬278種[2]，廣泛分布于中國華北、東北、內(nèi)蒙古和西北地區(qū)，主產(chǎn)于黑龍江、內(nèi)蒙古、山西、遼寧、河北等地，是重要的北方藥材。

黃芪廣泛應(yīng)用于臨床配方，具有強(qiáng)心、抗心肌缺血、提高免疫力、降糖、抗衰老、保護(hù)臟器等多種藥理作用[7，8]。黃芪中含有多種生物活性成分，包括多糖、皂苷、黃酮、氨基酸、亞麻酸、亞油酸、谷甾醇、葉酸及多種微量元素等，其中黃芪多糖、黃芪皂苷、黃芪黃酮等為其特征活性成分。黃芪多糖具有免疫調(diào)節(jié)、提高巨噬細(xì)胞活性、抗腫瘤等作用[9-13]。黃芪甲苷具有抗炎、鎮(zhèn)痛、降壓、鎮(zhèn)靜等藥理作用[14]。黃芪黃酮具有增強(qiáng)機(jī)體非特異性免疫及特異性體液免疫[15，16]、抗心肌缺血[17-22]、防護(hù)肝損傷[23]等藥理作用。

1 誘導(dǎo)子在植物次生代謝途徑研究中的應(yīng)用

植物次生代謝網(wǎng)絡(luò)復(fù)雜，使人們通過不同的方法來刺激代謝途徑以增加目標(biāo)次生代謝產(chǎn)物的合成量。目前，利用誘導(dǎo)子對目標(biāo)次生代謝產(chǎn)物的生物合成途徑進(jìn)行調(diào)控，已被看作是一種大幅度提高培養(yǎng)物中代謝產(chǎn)物含量的重要方法。誘導(dǎo)子能夠?qū)χ参锏奶囟ɑ蜻M(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)，開啟相關(guān)的植物次生代謝途徑，積累目標(biāo)次生代謝產(chǎn)物，從而提高植物特定代謝途徑的次生代謝產(chǎn)物產(chǎn)量。

1.1 誘導(dǎo)子的種類及應(yīng)用

從植物病理學(xué)角度進(jìn)行的定義，誘導(dǎo)子（Elicitor）是指能引起植物抗病生理過程，誘導(dǎo)植物產(chǎn)生植保素（Phytoalexin）并引起植物過敏反應(yīng)（Hypersensive Reaction，HR）的因子[24]。誘導(dǎo)子是一類特殊的觸發(fā)因子，它能夠開啟代謝過程中酶的活性，因而能夠增加次生代謝物的含量，有時甚至可以誘導(dǎo)出新的化合物。誘導(dǎo)子根據(jù)來源可分為非生物誘導(dǎo)子（Abiotic Elicitor，AE）和生物誘導(dǎo)子（Biotic Elicitor，BE）。其中，AE以物理和化學(xué)因子引起誘導(dǎo)作用，BE是植物體在防御過程中為抵抗微生物感染而產(chǎn)生的有誘導(dǎo)作用的誘導(dǎo)子[25]。

1.1.1 非生物誘導(dǎo)子

非生物誘導(dǎo)子不是植物細(xì)胞中天然成分但又能觸發(fā)植物細(xì)胞形成抗毒素信號的物質(zhì)。常見的非生物誘導(dǎo)子有乙烯（Ethylene，ET）、水楊酸（Salicylic Acid，SA）、茉莉酸（Jasmonic Acid，JA）、茉莉酸甲酯（Jasmonic Acid Methyl Ester， MeJA）、草酸（Oxalic Acid，OA）等，還有一些金屬離子和紫外光，這些因素均能誘導(dǎo)植物產(chǎn)生抗性，增強(qiáng)其次生代謝途徑[20]。外源性MeJA類化合物能有效刺激植物萜類、黃酮類、生物堿類等次生代謝物的生物合成[26-29]。SA可誘導(dǎo)紫杉醇含量的提高[30]，促進(jìn)胞內(nèi)過氧化物含量增加[31]。用Cu2+處理能增加紅豆杉培養(yǎng)細(xì)胞紫杉醇含量的提高[25]。紫外光能刺激胡蘿卜素、類黃酮、多酚和質(zhì)體醌等次生代謝產(chǎn)物的形成[32]。

1.1.2 生物誘導(dǎo)子

生物誘導(dǎo)子是指植物體在防御過程中為對抗微生物感染而產(chǎn)生的物質(zhì)，包括分生孢子、降解細(xì)胞壁的酶類、細(xì)胞壁碎片、有機(jī)體產(chǎn)生的代謝物。對于生物誘導(dǎo)子來說，目前應(yīng)用最廣、研究最多的是真菌誘導(dǎo)子。真菌誘導(dǎo)子的特點(diǎn)是能快速、高度專一和選擇性的誘導(dǎo)植物特定基因的表達(dá)，從而活化相應(yīng)次生代謝途徑，最后產(chǎn)生目標(biāo)次生代謝產(chǎn)物[33，34]。自從1968年Crutckshand等首次對真菌誘導(dǎo)子進(jìn)行了報道后，對真菌誘導(dǎo)子的研究對象有很多：將灰葡萄孢、灰黃霉素、大麗輪枝孢和融黏帶酶混合培養(yǎng)濾液作為誘導(dǎo)子來提高紫杉醇、紫杉堿的產(chǎn)量[35]，利用葡萄孢屬的真菌菌絲體勻化產(chǎn)物作為誘導(dǎo)子來提高罌粟血根堿的含量[36]，利用真菌誘導(dǎo)子提高紅豆杉細(xì)胞紫杉醇的含量[37-39]。

1.2 誘導(dǎo)子的作用機(jī)理及篩選

從目前的研究來看，誘導(dǎo)子對次生代謝途徑的調(diào)控具有專一性，對同一代謝途徑調(diào)控的誘導(dǎo)子具有多樣性。例如，真菌誘導(dǎo)子可快速激活百脈根的毛狀根中的苯丙氨酸氨基裂解酶（Phenylalanine Amino Lyase，PAL）合成異黃酮化合物，而對其它無直接關(guān)系的酶沒有明顯的作用；也有研究者發(fā)現(xiàn)用12種不同真菌菌絲體勻漿對長春花細(xì)胞懸浮培養(yǎng)，其吲哚生物堿含量和對照組比較均明顯提高[40，41]。而誘導(dǎo)子作用機(jī)理只有一個初步的理論假說：誘導(dǎo)子作為一種外界信號引起植物細(xì)胞膜上的受體位點(diǎn)識別，識別后兩者的結(jié)合引起細(xì)胞膜上及細(xì)胞內(nèi)相關(guān)的生理生化連鎖反應(yīng)，與植保素有關(guān)的酶活性發(fā)生改變，最終導(dǎo)致植保素的合成和積累。

由于沒有作用機(jī)理基礎(chǔ)理論的指導(dǎo)，使誘導(dǎo)子的篩選工作成為困擾研究者多年的一個難題，目前的篩選還停留在較盲目的嘗試階段。要想有效地利用誘導(dǎo)子來提高目標(biāo)次生代謝產(chǎn)物的產(chǎn)量，就要對次生代謝途徑的關(guān)鍵酶及相應(yīng)的誘導(dǎo)子進(jìn)行具體研究，弄清楚兩者之間的調(diào)控關(guān)系，如此才能將“誘導(dǎo)子誘導(dǎo)-合成目標(biāo)次生代謝產(chǎn)物”的整個鏈條貫穿起來。根據(jù)目標(biāo)代謝產(chǎn)物的特征結(jié)構(gòu)及其相應(yīng)的生理功能選擇與之相應(yīng)的誘導(dǎo)子，從而避免目前誘導(dǎo)子篩選工作的盲目性。

在真菌誘導(dǎo)子的研究中，也應(yīng)加強(qiáng)誘導(dǎo)子的純化和結(jié)構(gòu)分析，因?yàn)樵谘芯空婢鷮Υ紊x調(diào)控的影響時，往往使用的是多種菌體及其發(fā)酵液的混合物，在混合物中難以避免不同調(diào)控作用的誘導(dǎo)子之間起相互作用，這樣就可能會削弱或增強(qiáng)某個誘導(dǎo)子的調(diào)控程度，使其調(diào)控作用結(jié)果復(fù)雜而不穩(wěn)定，為研究工作帶來困難。對真菌誘導(dǎo)子進(jìn)行純化，能清楚的對其結(jié)構(gòu)和功能做進(jìn)一步的確定，這樣就能揭示真菌誘導(dǎo)子在植物次生代謝途徑中的調(diào)控機(jī)理。將結(jié)構(gòu)和功能清楚的誘導(dǎo)子用于次生代謝產(chǎn)物的生產(chǎn)，提高目標(biāo)次生代謝產(chǎn)物的產(chǎn)量。在具有相同生物產(chǎn)量的植株群體中生產(chǎn)出更多的目標(biāo)次生代謝產(chǎn)物，自然資源利用率會大大提高，將會大大降低目標(biāo)次生代謝產(chǎn)物的生產(chǎn)成本，它將帶來可觀的經(jīng)濟(jì)、社會及生態(tài)效益。

2 黃芪內(nèi)生真菌的研究現(xiàn)狀

黃芪為豆科黃芪屬多年生草本植物，和多數(shù)豆科植物一樣，黃芪和土壤根際微生物菌群的共生現(xiàn)象非常普遍。由于黃芪屬于藥用植物，相關(guān)研究多集中在藥理和病理方面，針對其內(nèi)生真菌的研究較少，現(xiàn)有報道集中在近幾年，內(nèi)容只涉及內(nèi)生菌菌種的分離、內(nèi)生真菌和寄主次生代謝物質(zhì)相似性研究，并未將其作為誘導(dǎo)子用于黃芪次生代謝途徑的研究。因此，對黃芪內(nèi)生真菌的研究處于起步階段。有研究從黃芪中成功分離出內(nèi)生菌，經(jīng)鑒定，這些內(nèi)生菌一般具有抑菌活性。例如，從膜莢黃芪Astragalus membranaceus葉中分離得到一株瓶霉菌屬Phialophora sp.內(nèi)生真菌，對常見的4種細(xì)菌有不同程度的抑菌活性[42]；從蒙古黃芪中分離并鑒定出7個菌屬28種內(nèi)生菌菌株[43-44]；從恒山黃芪（屬于蒙古黃芪）中分離得到分屬于3目、6科、17屬的內(nèi)生真菌菌株49株，其中有33株菌至少能抑制1種指示菌[45-47]。

3 無土栽培在根際微生物研究中的應(yīng)用

為了消除試驗(yàn)的背景噪音，研究者建立了各種試驗(yàn)操作體系以消除不可控因素。早期研究溫度及光周期等因素對植物的影響時，科研工作者使用了人工氣候室進(jìn)行試驗(yàn)；在研究基因功能過程中，科研人員利用全基因組測序遺傳背景清楚的模式植物，并建立了組織培養(yǎng)體系以及細(xì)胞懸浮體系，這些手段都在具體研究中起作用，并得到了相應(yīng)的成果。例如，利用細(xì)胞懸浮體系建立的細(xì)胞發(fā)酵工程工業(yè)化生產(chǎn)目標(biāo)產(chǎn)品?；蚬こ萄芯繉ο蠖际侵参锏奶囟ńM織和細(xì)胞，當(dāng)這部分組織和細(xì)胞離開母體系統(tǒng)后，整個代謝調(diào)控網(wǎng)絡(luò)發(fā)生改變，研究結(jié)果只能適用于試驗(yàn)室以及對技術(shù)要求很高的生物工程的工廠化生產(chǎn)，無法用于大面積的野外自然條件下的生產(chǎn)。

在植物內(nèi)生菌及根際微生物的研究中，土壤環(huán)境含有的微生物群落增加了背景噪音，選擇無土栽培方式來消除土壤菌群的影響無疑是個好辦法。無 土 栽 培（Soilless Culture，Hydroponics，Solution Culture）是指不用天然土壤，而用營養(yǎng)液或固體基質(zhì)加營養(yǎng)液栽培作物的方法[48]。

1859-1865年期間，德國科學(xué)家薩奇斯（Sachs）和克諾普（Knop）進(jìn)行植物礦質(zhì)營養(yǎng)的生理研究，為無土栽培技術(shù)研究揭開了序幕。無土栽培先后經(jīng)歷了無土栽培的試驗(yàn)研究階段[49,50]、生產(chǎn)的起步階段[51]，真正發(fā)展階段開始于1970 年丹麥 Groden公司開發(fā)的巖棉栽培技術(shù)和 1973 年英國溫室作為研究所的 NFT 技術(shù)[52]。20 世紀(jì) 70年代以后，隨著營養(yǎng)液膜技術(shù)和巖棉栽培技術(shù)的發(fā)展，世界上商業(yè)性的蔬菜和花卉無土栽培逐漸深入到生產(chǎn)中。進(jìn)入 20世紀(jì) 80 年代以后，科學(xué)技術(shù)的快速發(fā)展推動了無土栽培生產(chǎn)的擴(kuò)大，無土栽培生產(chǎn)亦進(jìn)入了一個迅速發(fā)展階段。

無土栽培最廣泛的應(yīng)用是在蔬菜栽培生產(chǎn)中，在過去幾十年的全世界蔬菜生產(chǎn)過程中，因具有無公害生產(chǎn)的環(huán)境優(yōu)勢[54-56]，而越來越受歡迎[53]。蔬菜的無土栽培過程中，與傳統(tǒng)土壤栽培條件下相似的植物根部病害依然困擾著生產(chǎn)者，進(jìn)行營養(yǎng)液和栽培槽消毒雖然可以解決這個問題，但是這一方法成本很高，不但破壞了植物根系的有害微生物，也破壞了植物根系周圍的有益微生物群落。最近，研究者將更多的興趣都集中于各種微生物在無土栽培中的作用[57]。有報道顯示，在無土栽培體系中利用有益微生物進(jìn)行生態(tài)防治的效果好于在傳統(tǒng)的土壤栽培環(huán)境中的有益微生物生態(tài)防治。因此，推斷在無土栽培的環(huán)境系統(tǒng)中有益微生物的菌群比在傳統(tǒng)土壤環(huán)境中更容易建立。

4 組學(xué)技術(shù)和新一代測序技術(shù)的應(yīng)用

4.1 組學(xué)技術(shù)的應(yīng)用

組學(xué)技術(shù)（Omics Technology）是隨著系統(tǒng)生物學(xué)（Systems Biology）新學(xué)科的產(chǎn)生和發(fā)展應(yīng)運(yùn)而生的，主要包括基因組學(xué)、轉(zhuǎn)錄組學(xué)、蛋白質(zhì)組學(xué)和代謝組學(xué)技術(shù)等，系統(tǒng)生物學(xué)及組學(xué)技術(shù)是近20年來生物學(xué)研究發(fā)展最為迅速的領(lǐng)域?；蚪M學(xué)（Genomics）是研究生物基因組的組成，組內(nèi)各基因的精確結(jié)構(gòu)、相互關(guān)系及表達(dá)調(diào)控的科學(xué)；蛋白質(zhì)組學(xué)（Proteomics）是指對“一種基因組所表達(dá)的全套蛋白質(zhì)”，包括一種細(xì)胞乃至一種生物所表達(dá)的全部蛋白質(zhì)進(jìn)行研究的科學(xué)；代謝組學(xué)（Metabolomics）則是對生物體內(nèi)所有代謝物進(jìn)行定量分析，并尋找代謝物與生理病理變化相對關(guān)系的研究方式，是系統(tǒng)生物學(xué)的組成部分。

轉(zhuǎn)錄組（Transcriptome）的概念由 Velculescu VE.等首先提出。轉(zhuǎn)錄組是指特定細(xì)胞在某一功能狀態(tài)下全部表達(dá)的基因總和，代表了每一個基因的身份和表達(dá)水平。同一細(xì)胞在不同的生長時期及生長環(huán)境下，基因表達(dá)情況是不完全相同的，具有特定的空間性和時間性特征[58]。與基因組具有靜態(tài)實(shí)體的特點(diǎn)不同，轉(zhuǎn)錄組是受外源和內(nèi)源因子調(diào)控的。因此，它是物種基因組和外部物理特征的動態(tài)聯(lián)系，是反映生物個體在特定器官、組織或某一特定發(fā)育、生理階段細(xì)胞中所有基因表達(dá)水平的數(shù)據(jù)?？捎脕肀容^不同組織或生理狀況下基因表達(dá)水平差異，發(fā)現(xiàn)與特定生理功能相關(guān)的基因，推測未知基因。

由于組學(xué)技術(shù)能夠一次從整體上觀察分析得到大量的指標(biāo)變化，已經(jīng)成為基因功能和生物標(biāo)志物的研究中的主要研究手段。不同組學(xué)技術(shù)之間的交叉使用和數(shù)據(jù)關(guān)聯(lián)、組學(xué)技術(shù)和傳統(tǒng)的分子生物學(xué)手段有機(jī)結(jié)合都將是未來轉(zhuǎn)化各領(lǐng)域研究的重要手段。

4.2 轉(zhuǎn)錄組學(xué)技術(shù)在藥用植物次生代謝研究中的應(yīng)用

藥用植物和藥用植物提取物及其衍生物是臨床用藥的主要來源。以提高藥用植物次生代謝產(chǎn)物，而對藥用植物次生代謝網(wǎng)絡(luò)及其調(diào)控的研究，一直是藥用植物應(yīng)用領(lǐng)域的研究中心。采用單個基因點(diǎn)的研究方式，無法全面闡述次生代謝途徑和構(gòu)建代謝調(diào)控網(wǎng)絡(luò)[59，60]。各種組學(xué)的研究為藥用植物次生代謝調(diào)控網(wǎng)絡(luò)的研究提供了可能，其中轉(zhuǎn)錄組學(xué)從基因轉(zhuǎn)錄水平反映了基因的表達(dá)情況，為藥用植物次生代謝途徑中關(guān)鍵基因的篩選和功能的研究提供了技術(shù)支持。

如今，轉(zhuǎn)錄組學(xué)研究已經(jīng)在藥用植物中得到了廣泛的應(yīng)用，已經(jīng)成為發(fā)現(xiàn)新基因與關(guān)鍵基因克隆及功能驗(yàn)證的重要手段之一。在西洋參中利用轉(zhuǎn)錄組學(xué)技術(shù)挖掘出24條可能參與人參皂苷生物合成相關(guān)酶的基因，通過功能驗(yàn)證鑒定出了甲羥戊酸（Mevalonic Acid，MVA）代謝途徑中的關(guān)鍵酶——3-甲基-3-羥基戊二酰輔酶A還原酶（3-Hydroxy-3-Methylglutaryl Coenzyme A Reductase，HMGR）基因，明確了西洋參中人參皂苷的生物合成途徑[61-62]。由于藥用植物沒有基因組測序背景作參考，采用測序長度較長的454/Roche GS FLX測序技術(shù)，對于基因的拼接結(jié)果更為可靠，利用該技術(shù)對西洋參的根進(jìn)行了高通量轉(zhuǎn)錄組測序，發(fā)現(xiàn)了可能參與不同類型人參皂苷生物合成過程相關(guān)的150條細(xì)胞色素P450和235條糖基轉(zhuǎn)移酶候選序列[63]；同樣使用該技術(shù)對丹參的2年生根部進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組高通量測序，獲得1.8萬余個unigene。通過unigene注釋和功能分類，其中27個unigene可能參來自于參酮合成的代謝途徑，29個unigene可能來自于丹酚酸合成的代謝途徑，70個unigene可能來自于CYP450過程，還有轉(zhuǎn)錄因子序列577條[64]；對烏拉爾甘草的454/ Roche GS FLX高通量轉(zhuǎn)錄組測序，共獲得2.7萬多個unigene，發(fā)現(xiàn)了屬于甘草甜素生物合成途徑中的16個酶的基因，從而初步建立了甘草甜素生物合成途徑[65]。利用分子生物學(xué)技術(shù)實(shí)現(xiàn)藥用植物次生代謝途徑中關(guān)鍵酶基因的克隆與體外高效表達(dá)，進(jìn)行次生代謝生物工程化生產(chǎn)，大規(guī)模的生產(chǎn)藥用植物的生物活性成分是未來發(fā)展方向。

4.3 新一代測序技術(shù)在組學(xué)中的應(yīng)用

隨著生命科學(xué)進(jìn)入后基因組時代，功能基因組學(xué)、轉(zhuǎn)錄組學(xué)、蛋白質(zhì)組學(xué)、系統(tǒng)基因組學(xué)等組學(xué)研究越來越引起人們的重視，相應(yīng)的對測序技術(shù)要求也越來越高，傳統(tǒng)測序方法在測序深度和廣度等方面已經(jīng)無法滿足大規(guī)?；蚪M測序的需求。研究者已經(jīng)到認(rèn)識到快速、低成本測序技術(shù)對生命科學(xué)發(fā)展的重要性。在此背景下新一代高通量測序（Next-Generation Genome Sequencing,NGS）技術(shù)應(yīng)運(yùn)而生，其中最具代表性的技術(shù)平臺有454/Roche GS FLX、Illumina基因組分析儀Ⅱ系統(tǒng)及應(yīng)用系統(tǒng)生物公司的SOLiD測序技術(shù)。

NGS技術(shù)具有速度快、成本低、測序度深、產(chǎn)出量大等特點(diǎn)，使其在生命科學(xué)研究領(lǐng)域迅速得到廣泛應(yīng)用。在植物分子生物學(xué)研究領(lǐng)域，NGS技術(shù)的出現(xiàn)使基因組測序、轉(zhuǎn)錄組測序、lncRNA測序、microRNAs 測序等不再是難題，有力地支持和推動了植物分子生物學(xué)的研究。同時，NGS技術(shù)在非模式植物全基因組測序工作中也起到了極大的推動作用，新物種全基因組測序的信息不斷被公布，使科研工作者擺脫了對非模式植物研究缺乏遺傳背景的束縛。2002年的植物全基因組測序完成量是3例，2010年的植物全基因組測序完成量是32例，僅在2010年就有蘋果、黃瓜和玉米的大型基因組得以測序完成[66-68]，相隔8年，完成量增加了9倍多，平均一年有4個植物的基因組被測序完成。2011年，可可、橡膠樹、野草莓、麻風(fēng)樹等多種植物基因組測序完成[69-72]。

轉(zhuǎn)錄水平的調(diào)控是生物體最主要的調(diào)控方式之一，對轉(zhuǎn)錄水平的研究已從基因芯片技術(shù)步移到建立于高通量測序基礎(chǔ)上的轉(zhuǎn)錄組研究。對同一樣品的深度測序即使是低表達(dá)量的基因也可以被捕捉到，而對不同樣品進(jìn)行同時測序可以獲得樣品之間的差異表達(dá)基因。對有參考基因組的轉(zhuǎn)錄組進(jìn)行研究還可以獲得轉(zhuǎn)錄本的表達(dá)豐度，轉(zhuǎn)錄發(fā)生位點(diǎn)，可變剪切，轉(zhuǎn)錄本SNP等重要生物學(xué)信息[73]。如對紅花種子、葉片和花使用Illumina的Solexa測序技術(shù)進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組測序和數(shù)據(jù)的生物信息學(xué)分析，獲得了紅花這3個部位的差異表達(dá)基因[74]。

轉(zhuǎn)錄組學(xué)研究的一個重要方面就是發(fā)現(xiàn)和分析ncRNA。早期研究認(rèn)為非編碼RNA（ncRNA）是沒有功能的基因，只有少數(shù)的ncRNA分子可作為生物遺傳信息從DNA傳向蛋白質(zhì)過程中的中間過渡產(chǎn)物，其功能是協(xié)助RNA轉(zhuǎn)錄與蛋白質(zhì)翻譯[75]。近年來，隨著相關(guān)技術(shù)的發(fā)展進(jìn)步，研究發(fā)現(xiàn)基因組中約有50%的DNA轉(zhuǎn)錄為RNA，僅有約2%的RNA參與蛋白質(zhì)的翻譯，剩余的98%均不參與[76]。ncRNA 按其功能可分為看家ncRNA和調(diào)節(jié)ncRNA。前者通常穩(wěn)定表達(dá)，發(fā)揮著一系列對細(xì)胞存活至關(guān)重要的功能，主要包括轉(zhuǎn)移 RNA（tRNA）、核糖體 RNA（rRNA）、小核RNA（snRNA）及小核仁 RNA（snoRNA）等；后者主要包括長鏈ncRNA（lncRNA）和以microRNA為代表的小ncRNA（small ncRNA），在表觀遺傳、轉(zhuǎn)錄及轉(zhuǎn)錄后等多個層面調(diào)控基因表達(dá)[77]。

過去幾年里對ncRNA的研究大部分集中于小ncRNA[78，79]。有研究者對草莓不同發(fā)育時期果實(shí)的microRNA進(jìn)行Illumina的Sloexa深度測序。基于microRNA 相似性序列和二級結(jié)構(gòu)預(yù)測，從測序數(shù)據(jù)中獲得164個保守的microRNA和37個新的microRNA。通過RT-PCR技術(shù)對37個新的microRNA進(jìn)行驗(yàn)證，來進(jìn)一步預(yù)測新的microRNA的潛在靶基因，對其進(jìn)行功能注釋分析發(fā)現(xiàn)，這些microRNA可能編碼SNARE蛋白、PLAC8家族蛋白、RNA結(jié)合蛋白、NAC轉(zhuǎn)錄因子等功能蛋白。這些microRNA具有較高的測序頻次，表明它們在草莓的果實(shí)中有很高的表達(dá)量，這說明它們參與了草莓果實(shí)的生長發(fā)育[80]。lncRNA 由于序列保守性較低曾經(jīng)一度被認(rèn)為是轉(zhuǎn)錄噪音，隨著研究的不斷深入直到近幾年才證明，lncRNA 具有明確的生物學(xué)功能[81，82]。目前對 lncRNA 的認(rèn)識尚處于初級階段，一般認(rèn)為大于200 nt且缺乏蛋白編碼能力的轉(zhuǎn)錄本為lncRNA，迄今發(fā)現(xiàn)的lncRNA長度從幾百nt到十幾nt不等，大概可以分為正義的、反義的、內(nèi)含子型的及基因間的[83]。lncRNA可以通過不同模式發(fā)揮多種分子功能，如調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)錄模式，調(diào)節(jié)蛋白質(zhì)活力，具有結(jié)構(gòu)和組織功能，改變RNA加工方式和作為一些小RNA的前體[84]。

1 國家藥典委員會. 中華人民共和國藥典. 北京:化學(xué)工業(yè)出版社,2015: 302-303.

2 韓燕. 中藥黃芪的研究概況,河南中醫(yī)學(xué)院學(xué)報,2003,18(6): 86-88.

3 趙永華,俞敏倩,張麗萍. 黃芪. 北京: 中國中醫(yī)藥出版社,2001: 1.

4 肖培根. 新編中藥志. 北京: 化學(xué)工業(yè)出版社,2002: 876-893.

5 吳松權(quán),王立平,孫麗娜,等. 黃芪染色體核型分析. 湖北農(nóng)業(yè)科學(xué),2006,45(5): 631-633.

6 吳松權(quán),孫麗娜,王立平,等. 黃芪親緣關(guān)系的RAPD分析. 江蘇農(nóng)業(yè)科學(xué),2007,1: 144-145.

7 江燕. 黃芪藥理作用及在方劑配伍方面的應(yīng)用. 中國實(shí)用醫(yī)藥,2015,10(1): 226-227.

8 張玉婷. 黃芪現(xiàn)代藥理作用與血液病分析. 實(shí)用中醫(yī)內(nèi)科雜志,2007,21(2): 14-15.

9 Kiyohara H,Uchida T,Takakiwa M,et al. Different contributions of side-chainsin β-D-(1→3,6)-galactans on intestinal Peyer’s patchimmunomodulation by polysaccharides from Astragalus mongholics Bunge. Phytochemistry,2009,71(2-3): 280-293.

10 Cho W C,Leng K N. In vitro and in vivo immune modulating and immune restorative effects of Astragalus membranaceus. Journal of Ethonpharmacol,2007,113(1): 132-141.

11 Li R,Chen WC,Wang WP,et al. Extraction，characterization of Astragalus polysaccharides andits immune modulating activities in rats with gastric cancer. Carbohydrate Polymers,2009,78(4): 738-742.

12 張小梅. 黃芪多糖的免疫調(diào)節(jié)作用及抗腫瘤作用研究進(jìn)展. 大連大學(xué)學(xué)報,2003,24(6): 101-104.

13 Yuan Y,Sun M,Li K S. Astragalus mongholicus polysaccharide inhibits lipopolysaccharide-induced production of TNF-α and interleukin-8. World Journal of Gastroenterology,2009,15(29): 3676- 3680.

14 Zhang W J,Hu Fang L P,Binder B R,et al. Antiinflammatory activity of astragaloside IV ismediated by inhibition of NF- kappa B activation and adhesion molecule expression. Thromb Haemost,2003,90(5): 904-914.

15 李淑芳. 中藥黃芪藥理作用研究進(jìn)展. 湖北中醫(yī)雜志,2013,35(6): 73-75.

16 楊鳳華,康成,李淑華,等. 黃芪水溶性黃酮類對小鼠細(xì)胞免疫功能的影響. 時珍國醫(yī)國藥,2002,13(12): 718-719.

17 周吉燕,樊懿,孔建龍,等. 黃芪中不同提取成分對大鼠心肌缺血-再灌注損傷的心功能影響. 中國中藥雜志,2000,25(5): 301-302.

18 王洪軍,趙明,于影. 黃芪總黃酮對急性心肌梗死大鼠心臟血流動力學(xué)及心肌細(xì)胞鈣電流的作用. 中國心血管病研究,2008,6(4): 291-293.

19 包吉日木圖,趙明,包伍葉. 黃芪總黃酮對急性心肌梗死心室肌細(xì)胞鈉電流的作用. 中國心血管病研究,2008,6(1): 59-61.

20 趙明,于影,邵慧杰,等. 黃芪總黃酮對大鼠試驗(yàn)性心律失常的保護(hù)作用. 中國心血管病研究,2007,5 (12): 918-919.

21 李曉光,張文杰,孫瑩,等. 黃芪總黃酮對豚鼠心室肌細(xì)胞動作電位和延遲整流鉀電流的作用.心肺血管病雜志,2008,27(1): 49-51.

22 周承. 中藥黃芪藥理作用及臨床應(yīng)用研究. 亞太傳統(tǒng)醫(yī)藥， 2014,10(22): 100-101.

23 汪德清,丁保國,馬艷青,等. 黃芪總黃酮對乙酰氨基酚(撲熱息痛)所致肝損傷的防護(hù)機(jī)制探討. 中國中藥雜志,2001,26(9): 617-620.

24 王和勇,羅恒,孫敏. 誘導(dǎo)子在藥用植物細(xì)胞培養(yǎng)中的應(yīng)用. 中草藥,2004,35 (8): 附3-7.

25 孫晶,楊洪一,隋春. 不同因子對藥用植物毛狀根產(chǎn)量和次生代謝產(chǎn)物積累影響的研究進(jìn)展中國現(xiàn)代中藥,2014,16 (11): 945-952.

26 孫際薇. 茉莉酸甲酯對曼陀羅毛狀根的生長及次生代謝產(chǎn)物產(chǎn)生的影響. 西南大學(xué)碩士學(xué)位論文，2014:12-13.

27 楊鈺琪. 雷公藤不定根培養(yǎng)體系的建立和兩相培養(yǎng)研究. 西北農(nóng)林科技大學(xué)碩士學(xué)位論文，2013: 16-17.

28 李翠霞,王兆豐,張繼,等. 誘導(dǎo)子對百里香中次生代謝產(chǎn)物的影響差異. 中國藥學(xué)雜志,2013,48(2):96-100.

29 趙春芳,余龍江,劉智,等. 茉莉酸甲酯誘導(dǎo)下紅豆杉細(xì)胞產(chǎn)生紫杉烷類物質(zhì)群代謝輪廓分析. 植物分類與資源學(xué)報,2005(5): 557-564.

30 苗志奇,未作君,元英進(jìn). 水楊酸在紫杉醇生物合成中誘導(dǎo)作用的研究. 生物工程學(xué)報,2000,16(4): 509-513.

31 梅興國,張舟寧,蘇湘鄂,等. 水楊酸對紅豆杉細(xì)胞的誘導(dǎo)作用.生物技術(shù),2000,10(6): 18-20.

32 賈民隆.光質(zhì)對黃芪三種藥效成分的積累調(diào)控及多糖在根中的組織定位.山西農(nóng)業(yè)大學(xué)碩士學(xué)位論文，2013: 26-27.

33 房慧勇,朱虹,丁海麥,等. 影響愈傷組織中次生代謝產(chǎn)物含量的因素研究進(jìn)展. 中國中藥雜志,2014,39(15): 2846-2850.

34 李琰,趙磊,崔蕾，等. 誘導(dǎo)子對雷公藤不定根生長和次生代謝產(chǎn)物含量的影響. 生物工程學(xué)報， 2015,31(5): 734-743.

35 張敏敏,陳玉梁,趙瑛,等. 藥用植物組織培養(yǎng)生產(chǎn)有效成分的影響因素研究進(jìn)展. 甘肅農(nóng)業(yè)科技,2013,(7): 43-46.

36 譚燕,賈茹,陶金華,等. 內(nèi)生真菌誘導(dǎo)子調(diào)控藥用植物活性成分的生物合成. 中草藥， 2013,44 (14): 2004-2008.

37 葉龍飛,王金海,張景紅. 聯(lián)合誘導(dǎo)子提高藥用植物代謝產(chǎn)物產(chǎn)量的研究進(jìn)展. 廣東化工， 2014， 41(10): 207-208.

38 張長平,李春,元英進(jìn),等. 真菌誘導(dǎo)子對懸浮培養(yǎng)南方紅豆杉細(xì)胞態(tài)勢及紫杉醇合成的影響. 生物工程學(xué)報,2001,17(4): 436-440.

39 劉群,李天祥,李慶和,等. 藥用植物細(xì)胞懸浮培養(yǎng)產(chǎn)生次生代謝產(chǎn)物的研究進(jìn)展. 天津中醫(yī)藥大學(xué)學(xué)報,2014,33 (6): 375-377.

40 Jian Zhao,Zhu W,Hu Q. Selection of fungal elicitors to increase indole alkaloid accumulation in Catharanthus roseus suspension cell culture. Enzyme & Microbial Technology,2001,28(7): 666-672.

41 Jian Zhao,Zhu W,Hu Q. Enhanced catharanthine production in Catharanthus roseus cell culture by combined elicitor treatment in shake flasks and bioreactors. Enzyme & Microbial Technology,2001,28(7-8): 673-681.

42 孫月,王琦. 膜莢黃芪內(nèi)生真菌次生代謝產(chǎn)物鑒定及抑菌活性.菌物研究,2006: 22-23.

43 馬偉,孫麗英,張喜武,等. 黃芪內(nèi)生真菌發(fā)酵液中有效成分的初步研究. 中醫(yī)藥學(xué)報,2012,40(3): 118-121.

44 馬偉,賈艷姝,李娜,等. 植物黃芪根內(nèi)生真菌的分離. 東北林業(yè)大學(xué)學(xué)報,2012,40(4): 62-63,116.

45 周鳳,劉瑞,張弘弛,等. 一株具抗菌活性的恒山黃芪內(nèi)生真菌的分離與鑒定. 陜西科技大學(xué)學(xué)報(自然科學(xué)版),2012,30(3): 80-82,87.

46 周鳳,張弘弛,劉瑞,等. 恒山黃芪內(nèi)生真菌Aspergillus sp. 代謝產(chǎn)物的分離和生物活性的測定. 中國試驗(yàn)方劑學(xué)雜志,2012,18(4): 125-128.

47 周鳳,張弘弛,劉瑞,等. 恒山黃芪內(nèi)生真菌分離鑒定及抗菌活性的研究. 食品科技,2012,37 (1): 22-25,28.

48 郭世榮. 無土栽培學(xué). 北京: 中國農(nóng)業(yè)出版社,2003: 443.

49 萬軍. 國內(nèi)外無土栽培技術(shù)現(xiàn)狀及發(fā)展趨勢. 科技創(chuàng)新導(dǎo)報,2011(1): 11.

50 劉建華,光輝,李青峰. 蔬菜有機(jī)生態(tài)型無土栽培研究進(jìn)展. 湖南農(nóng)業(yè)科學(xué),2012(19):52-55,62.

51 田吉林,汪寅虎. 設(shè)施無土栽培基質(zhì)的研究現(xiàn)狀存在問題與展望.上海農(nóng)業(yè)學(xué)報,2000,16(4): 87-92.

52 孫中華,李遠(yuǎn)新. 蔬菜無土栽培技術(shù)的發(fā)展. 遼寧農(nóng)業(yè)科學(xué),2004(4): 34-35.

53 牛玉,戚志強(qiáng),劉昭華,等. 苦瓜無土栽培技術(shù)研究. 北方園藝,2015(7): 36-38.

54 劉明德. 番茄水肥一體化無土栽培技術(shù). 現(xiàn)代農(nóng)業(yè)科技,2014(24):176,178.

55 靳建紅. 蔬菜有機(jī)無土栽培技術(shù)的優(yōu)化及推廣. 農(nóng)民致富之友,2015,5: 189.

56 關(guān)紹華,熊翠華,何迅 ,等. 無土栽培技術(shù)現(xiàn)狀及其應(yīng)用. 現(xiàn)代農(nóng)業(yè)科技,2013(23):133-135.

57 Postma J,Willemsen-de Klein,M.J.E.I.M. van Elsas J D. Effect of the indigenous microflora on thedevelopment of root and crown rot caused by Pythium aphanidermatum in cucumber grown in rockwool. Phytopathology,2000,90(2): 125-133.

58 Lander E S,Linton L M,Birren B,et al. Initial sequencing and analysis of the human genome. Nature,2001,409: 860-921.

59 Collua G,Unvera N,Peltenburg-Loomana AMG,et al. Geraniol 10-hydroxylase1,a cytochrome P450 enzyme involved in terpenoid indole alkaloid biosynthesis. Febs Letters,2001,508(2): 215-220.

60 Seki H,Ohyama K,Sawai S,et al. Licorice β-amyrin 11-oxidase,a cytochrome P450 with a key role in the biosynthesis of the triterpene sweetener glycyrrhizin. Proceedings of the National Academy of Sciences,2008,105(37): 14204-14209.

61 陳士林,孫永巧,宋經(jīng)元,等. 西洋參cDNA文庫構(gòu)建及表達(dá)序列標(biāo)簽( EST)分析. 藥學(xué)學(xué)報,2008,6(43): 657-663.

62 Wu Q,Song J Y,Sun Y Q,et al. Transcript profiles of Panax quinquefolius from flower,leaf and root bring new insights into genes related to ginsenosides biosynthesis and transcriptional regulation. Physiologia Plantarum,2010,138(2): 134-149.

63 Sun C,Li Y,Wu Q,et al. De novo sequencing and analysis of American ginseng root transcriptome using a GS FLX Titanium platform to discover putative genes involved in ginsenoside biosynthesis. BMC Genomics,2010,11: 262.

64 李瀅,孫超,羅紅梅,等. 基于高通量測序454 GS FLX的丹參轉(zhuǎn)錄組學(xué)研究.藥學(xué)學(xué)報,2010,45(4): 524-529.

65 Li Y,Luo H,Sun C,et al. EST analysis reveals putative genes involved in glycyrrhizin biosynthesis. Bmc Genomics,2010,11(1): 52-59.

66 Velasco R,Zharkikh A,Affourtit J,et al. The genome of the domesticated apple ( Malus × domestica Borkh.). Nature Genetics,2010,42(10): 833-839.

67 Huang S,Li R,Zhang Z,et al. The genome of the cucumber,Cucumis sativus L. Nature Genetics,2009,41(12): 1275-1281.

68 Schnable P S,Ware D,Fulton R S,et al. The B73 maize genome: complexity,diversity,and dynamics. Science,2009,326(5956): 1112-1115.

69 Argout X,Salse J,Aury J M,et al. The genome of Theobroma cacao. Nature Genetis,2011,43 (2): 101-108.

70 Tangphatsornruang S,Uthaipaisanwong P,Sangsrakru D,et al. Characterization of the complete chloroplast genome of Hevea brasiliensis reveals genome rearrangement,RNA editing sites and phylogenetic relationships. Gene,2011,475 (2): 104-112.

71 Shulaev V,Sargent D J,Crowhurst R N,et al. The genome of woodland strawberry ( Fragaria vesca ). Nat Genet,2011,43 (2): 109-16.

72 Sato S,Hirakawa H,Isobe S,et al. Sequence analysis of the genome of an oil-bearing tree,Jatropha curcas L. DNA Res,2011,18 (1): 65-76.

73 楊曉玲,施蘇華,唐恬. 新一代測序技術(shù)的發(fā)展及應(yīng)用前景. 生物技術(shù)通報,2010 (10): 76-81.

74 熊麗東. 紅花轉(zhuǎn)錄組測序分析及其油體蛋白全長的獲得. 長春:吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)碩士學(xué)位論文,2011: 4-5.

75 Dinger M E,Pang K C,Mercer T R,et al. Differentiating protein-coding and noncoding RNA: Challenges and ambiguities. PLos Computational Biology,2008,4(11): e1000176.1-e1000176.5.

76 Landgraf P,Rusu M,Sheridan R,et al. A mammalian microRNA expression atlas based on small RNA library sequencing. Cell,2007,129(7): 1401-1414.

77 Ponting C P,Oliver P L,Reik W. Evolution and functions of long noncoding RNAs. Cell,2009,136(4): 629–641.

78 Dunoyer P,Schott G,Himber C,et al. Small RNA duplexes function as mobile silencing signals between plant cells. Science,2010,328(5980): 912-916.

79 Lakatos L,Csorba T,Pantaleo V,et al. Small RNA binding is acommon strategy to suppress RNA silencing by several viral suppressors. Embo Journal,2006,25(12): 2768-2780.

80 葛安靜. 利用高通量測序發(fā)現(xiàn)草莓中保守的和新的microRNAs. 園藝學(xué)報,2011,38 (增刊): 2519.

81 Baker M. Long noncoding RNAs: the search for function. Nature Methods,2011,8(5): 379-383.

82 Guttman M,Amit I,Garber M,et al. Chromatin signature reveals over a thousand highly conserved large non-coding RNAs in mammals. Nature,2009,458(7235): 223-227.

83 Khalil A M,Guttman M,Huarte M,et al. Many human large intergenic noncoding RNAs associate with chromatin-modifying complexes and affect gene expression. Proceedings of the National Academy of Sciences USA,2009,106(28): 11667-11672.

84 Wilusz J E,Sunwoo H,Spector D L. Long noncoding RNAs: functional surprises from the RNA world. Genes & Development,2009,23(13): 1494-1504.

Research Progress on the Secondary Metabolism in Astragalus

Zhang Kaixue,Liu Zhenpeng,Yan Song,Ren Weichao,Liu Xiubo,Ma Wei
(College of Pharmaceutical Sciences,Heilongjiang University of Chinese Medicine,Harbin 150040,China)

Belonging to leguminous plants,Astragalus contained a variety of biological active ingredients with different pharmacological effects. However,endophytic fungi of astragalus were seldom reported,it was a preliminary research in this study. The plant secondary metabolism network was complex,referring to using specific metabolic pathways of plant secondary metabolites production to improve yield through elicitors,and regulation of biosynthetic pathways. Elicitor included biological elicitor and abiotic inducer. So far,there has only been a preliminary hypothesis over the mechanism of the inducer,lacking of related guidances. The process of screening was slapdash. For eliminating the ambient noise in the test,soilless cultivation in the research of endophytic fungi and rhizosphere microorganisms was utilized,all at once,to eliminate the impact of soil bacteria.With the emergence of new courses and technologies,omics technologies and updating sequencing technology were produced and widely applied in various fields.

Astragalus,secondary metabolism,elicitor,soilless cultivation,omics technologies,updating omics technology

10.11842/wst.2016.05.025

R282.2

A

（責(zé)任編輯：馬雅靜，責(zé)任譯審：朱黎婷）

2016-11-06

修回日期：2016-11-16

＊ 國家自然科學(xué)基金委面上項(xiàng)目（81274010）：黃芪三萜皂苷類生物合成分子機(jī)制調(diào)控的研究，負(fù)責(zé)人：馬偉；黑龍江省科技廳杰出青年基金項(xiàng)目（JC201101）：黃芪SQS基因的克隆、亞細(xì)胞定位和功能研究，負(fù)責(zé)人：馬偉；黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)“優(yōu)秀創(chuàng)新人才支持計劃”（2012001）：黃芪SQS基因的克隆、亞細(xì)胞定位和功能研究，負(fù)責(zé)人：馬偉；哈爾濱市科技廳優(yōu)秀學(xué)科帶頭人基金項(xiàng)目（2014RFXXJ122）：誘導(dǎo)調(diào)控黃芪次生代謝有效成分途徑及轉(zhuǎn)錄組學(xué)研究，負(fù)責(zé)人：馬偉。

＊＊ 通訊作者：馬偉，研究員，主要研究方向：藥用植物生物工程。