闞金慶，司端濤，高忠禮，楊玉寶

(1臨沂市人民醫(yī)院，山東臨沂276000；2山東醫(yī)學(xué)高等?？茖W(xué)校附屬醫(yī)院；3吉林大學(xué)中日聯(lián)誼醫(yī)院)

壞死股骨頭、股骨粗隆間及正常骨組織中VEGF表達(dá)比較

闞金慶1，司端濤2，高忠禮3，楊玉寶2

(1臨沂市人民醫(yī)院，山東臨沂276000；2山東醫(yī)學(xué)高等?？茖W(xué)校附屬醫(yī)院；3吉林大學(xué)中日聯(lián)誼醫(yī)院)

目的 比較血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(VEGF)在壞死股骨頭、股骨粗隆間及正常骨組織中的表達(dá)變化，為股骨頭缺血性壞死(ONFH)發(fā)病機(jī)制的研究提供依據(jù)。方法 選擇需行人工關(guān)節(jié)置換術(shù)的股骨粗隆間骨折患者10例，術(shù)中取其正常股骨頭組織和股骨粗隆間骨組織；需行人工關(guān)節(jié)置換術(shù)的ONFH患者10例，術(shù)中取其壞死股骨頭組織。采用Real-time PCR法檢測(cè)各組織中VEGF mRNA相對(duì)表達(dá)量。結(jié)果 正常股骨頭組織、股骨粗隆間骨組織及壞死股骨頭組織中VEGF mRNA相對(duì)表達(dá)量分別為0.55±0.28、0.51±0.38、0.43±0.43，正常股骨頭組織及粗隆間骨組織VEGF mRNA相對(duì)表達(dá)量均明顯高于壞死股骨頭組織(P均<0.05)，正常股骨頭組織與粗隆間骨組織VEGF mRNA相對(duì)表達(dá)量比較無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05)。結(jié)論 壞死股骨頭組織VEGF表達(dá)低于股骨粗隆間及正常骨組織，骨組織VEGF表達(dá)降低可能與ONFH的發(fā)病有關(guān)。

血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子；股骨頭缺血壞死性；聚合酶鏈反應(yīng)；骨組織

股骨頭缺血性壞死(ONFH)致殘率高，多數(shù)患者就診時(shí)已進(jìn)展至股骨頭塌陷，因此不得不行人工關(guān)節(jié)置換。隨著大量骨生長(zhǎng)因子的不斷研究及臨床應(yīng)用，其在ONFH的治療方面有了比較肯定的療效。血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(VEGF)是骨生長(zhǎng)因子中的一種，是血管內(nèi)皮細(xì)胞的促細(xì)胞分裂劑和血管生成誘導(dǎo)劑，能特異性作用于內(nèi)皮細(xì)胞，促進(jìn)其增殖和血管形成，與骨的再生和血管化密切相關(guān)，但是其與ONFH的關(guān)系鮮見報(bào)道。本研究對(duì)壞死股骨頭、股骨粗隆間及正常骨組織中的VEGF表達(dá)進(jìn)行比較，為探討ONFH的發(fā)病機(jī)制提供依據(jù)。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 選擇2012年10月～2014年5月臨沂市人民醫(yī)院收治、需行人工關(guān)節(jié)置換術(shù)的患者20例，其中股骨粗隆間骨折患者10例，均為男性，年齡58～79(63.56±6.28)歲；ONFH患者10例，均為男性，年齡56～77(62.34±5.67)歲。均經(jīng)臨床表現(xiàn)及輔助檢查確診，排除兒童、高血壓、糖尿病及免疫系統(tǒng)疾病患者。<65歲者行全髖人工關(guān)節(jié)置換術(shù)，>65歲者行人工股骨頭置換術(shù)。股骨粗隆間骨折患者及ONFH患者的性別、年齡具有可比性。本研究通過醫(yī)院倫理委員會(huì)審查，并獲得患者及其家屬的知情同意。

1.2 骨組織VEGF mRNA表達(dá)檢測(cè) 股骨粗隆間骨折患者術(shù)中采用骨刀切取正常股骨頭組織和股骨粗隆間骨組織各2～3 g，ONFH患者術(shù)中取壞死股骨頭組織2～3 g；將采集到的骨組織保存于液氮中備用。采用Real-time PCR法檢測(cè)骨組織VEGF mRNA表達(dá)：TaKaRa RNAiso Reagent試劑盒提取骨組織總RNA，逆轉(zhuǎn)錄后按照試劑盒說明書進(jìn)行PCR反應(yīng)。VEGF引物序列：上游引物：5′-TTGCTGCTCTACCTCCACCA-3′，下游引物5′-CACTTCGTGGGGTTTATTGTCTC-3′。以GAPDH為內(nèi)參，上游引物：5′- TCGTCCTCCTCTGGTGCTCT-3′，下游引物：5′-TGTTGCCATCAATGACCCCTT-3′。PCR反應(yīng)條件：94 ℃預(yù)變性2 min、變性20 s，50～65 ℃退火30 s，72 ℃延伸60 s，35個(gè)循環(huán)；VEGF退火溫度為55 ℃，GAPDH退火溫度為57 ℃。Real-time PCR相關(guān)試劑及試劑盒均由北京博奧有限責(zé)任公司提供。VEGF mRNA相對(duì)表達(dá)量以2-ΔΔCt表示。

2 結(jié)果

正常股骨頭組織、股骨粗隆間骨組織及壞死股骨頭組織中VEGF mRNA相對(duì)表達(dá)量分別為0.55±0.28、0.51±0.38、0.43±0.43，正常股骨頭組織及股骨粗隆間骨組織VEGF mRNA相對(duì)表達(dá)量均明顯高于壞死股骨頭組織(P均<0.05)，正常股骨頭組織與股骨粗隆間骨組織VEGF mRNA相對(duì)表達(dá)量比較無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05)。

3 討論

ONFH是骨科領(lǐng)域的疑難雜癥，其發(fā)病機(jī)制至今尚未完全明確，臨床上缺乏有效的治療方法。研究發(fā)現(xiàn)，VEGF能促進(jìn)動(dòng)脈、靜脈及淋巴管的內(nèi)皮細(xì)胞生長(zhǎng)，還能增加血管的通透性，使血漿蛋白滲出血管外，導(dǎo)致纖維蛋白在血管外凝結(jié)，形成血管生成的臨時(shí)基質(zhì)[1]。這種基質(zhì)既可促進(jìn)血管生成，又可促使一些間質(zhì)細(xì)胞進(jìn)一步形成成熟的血管基質(zhì)。此外，VEGF還可刺激骨髓細(xì)胞，對(duì)造血功能產(chǎn)生影響。VEGF與血管內(nèi)皮細(xì)胞上酪氨酸激酶受體的細(xì)胞外結(jié)合域結(jié)合后，使兩個(gè)單體受體分子在膜上形成二聚體，并導(dǎo)致受體細(xì)胞內(nèi)結(jié)合域尾部酪氨酸殘基發(fā)生磷酸化，進(jìn)而激活不同信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)，發(fā)揮一系列生物學(xué)效應(yīng)[1，2]。VEGF可在不影響細(xì)胞黏附活性和細(xì)胞骨架的情況下，促進(jìn)破骨細(xì)胞形成[3]。

VEGF受體(VEGFR)家族有3種亞型，即VEGFR-1、VEGFR-2和VEGFR-3，在成骨細(xì)胞和血管內(nèi)皮細(xì)胞中主要存在VEGFR-1和VEGFR-2，VEGF水平上調(diào)后與其受體結(jié)合，啟動(dòng)VEGF下游通路，調(diào)控組織血管新生[4]。在破骨細(xì)胞和骨髓基質(zhì)干細(xì)胞中則主要存在VEGFR-2，壞死骨組織的血管重建主要是通過與VEGFR-2結(jié)合而介導(dǎo)的[5，6]。VEGF不僅對(duì)股骨頭血管再生具有重要的調(diào)控作用，還可以調(diào)節(jié)成骨細(xì)胞在股骨頭壞死區(qū)域的遷移、分化、增殖，促進(jìn)股骨頭壞死組織的修復(fù)[7～13]。缺血缺氧是ONFH發(fā)展的關(guān)鍵環(huán)節(jié)[14]，可啟動(dòng)VEGF相關(guān)信號(hào)通路，上調(diào)VEGF表達(dá)，使VEGF與其受體結(jié)合，激活下游通路，從而促進(jìn)成細(xì)胞的遷移、增殖、分化以及血管通透性增加等一系列細(xì)胞水平的活動(dòng)，最終促進(jìn)新血管的生成和壞死組織的修復(fù)。因此，VEGF及其相關(guān)信號(hào)通路在ONFH的發(fā)生及修復(fù)過程中發(fā)揮至關(guān)重要的作用[15，16]。

本研究結(jié)果表明，正常股骨頭組織及股骨粗隆間骨組織VEGF mRNA相對(duì)表達(dá)量均明顯高于壞死股骨頭組織，正常股骨頭組織與股骨粗隆間骨組織VEGF mRNA相對(duì)表達(dá)量比較無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。說明股骨頭組織VEGF表達(dá)降低可使ONFH患者股骨頭內(nèi)血管損害加重，從而加速ONFH的進(jìn)展。關(guān)于VEGF在ONFH治療中的作用仍需進(jìn)一步研究。

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山東省衛(wèi)生廳科技發(fā)展計(jì)劃項(xiàng)目(2013WS0074)。

楊玉寶(E-mail: yangyubaoyanji@sina.com)

10.3969/j.issn.1002-266X.2016.16.022

R363

B

1002-266X(2016)16-0062-02

2015-10-18)