楊敏，徐桂華

(南京中醫(yī)藥大學(xué)護(hù)理學(xué)院，南京210000)

·綜述·

蛋白質(zhì)組學(xué)在腰椎間盤突出癥中的研究進(jìn)展

楊敏，徐桂華

(南京中醫(yī)藥大學(xué)護(hù)理學(xué)院，南京210000)

腰椎間盤突出癥(LDH)是骨科常見(jiàn)病與多發(fā)病，其機(jī)制的初步探明已為L(zhǎng)DH的診斷與治療提供了重要信息，但更深層次的分子機(jī)制尚不明了。蛋白質(zhì)組學(xué)注重參與特定生理或病理狀態(tài)下的所有蛋白質(zhì)，為篩選疾病特異性生物標(biāo)記物，探索發(fā)病機(jī)制與治療靶點(diǎn)提供了新途徑。蛋白質(zhì)組學(xué)的常用技術(shù)包括蛋白質(zhì)分離技術(shù)、蛋白質(zhì)鑒定技術(shù)、生物信息學(xué)技術(shù)以及相對(duì)和絕對(duì)定量同位素標(biāo)記技術(shù)等，其在研究LDH中醫(yī)證型診斷，神經(jīng)根損傷、坐骨神經(jīng)痛以及腰椎退行性變發(fā)病機(jī)制中的應(yīng)用已經(jīng)比較明確，且取得了一定進(jìn)展。

腰椎間盤突出癥；蛋白質(zhì)組學(xué)；蛋白質(zhì)分離技術(shù)；神經(jīng)根損傷；腰椎退行性變

腰椎間盤突出癥(LDH)是指腰椎間盤各部分發(fā)生退行性變后，在外力因素的作用下，纖維環(huán)部分或全部破裂，單獨(dú)或連同髓核、軟骨終板向外突出，導(dǎo)致竇椎神經(jīng)和神經(jīng)根遭受刺激或壓迫，從而引起以腰腿痛為主要癥狀的一種疾病。LDH為骨科常見(jiàn)病和多發(fā)病，占門診腰痛患者的10%～15%，占骨科腰腿痛住院患者的25%～40%[1]。近年來(lái)LDH的發(fā)病率呈升高趨勢(shì)[2]。蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)的研究對(duì)象是生命活動(dòng)的最終執(zhí)行者——蛋白質(zhì)，該技術(shù)可篩選出與疾病相關(guān)的特異性生物標(biāo)記物，有助于探索發(fā)病機(jī)制與治療靶點(diǎn)，為L(zhǎng)DH的深入研究提供新思路。

1 蛋白質(zhì)組學(xué)的常用技術(shù)

蛋白質(zhì)組的概念由澳大利亞學(xué)者Wilkins和Williams于1994年提出，是指一個(gè)細(xì)胞或一個(gè)組織基因組所表達(dá)的全部蛋白質(zhì)[3]。由其引申出的蛋白質(zhì)組學(xué)則是從整體角度出發(fā)，分析細(xì)胞內(nèi)動(dòng)態(tài)變化的蛋白質(zhì)組成成分、表達(dá)水平和修飾狀態(tài)，了解蛋白質(zhì)之間相互作用和聯(lián)系，使人們能夠在分子水平上定量、動(dòng)態(tài)、整體探討生命活動(dòng)的規(guī)律和生命現(xiàn)象的本質(zhì)[4]。目前，蛋白質(zhì)組學(xué)的常用技術(shù)包括蛋白質(zhì)分離技術(shù)、蛋白質(zhì)鑒定技術(shù)、生物信息學(xué)技術(shù)及相對(duì)和絕對(duì)定量同位素標(biāo)記技術(shù)。

1.1 蛋白質(zhì)分離技術(shù) 該技術(shù)主要包括雙向凝膠電泳(2-DE)、雙向熒光差異電泳以及液相色譜(LC)技術(shù)等，其中2-DE為最經(jīng)典、最成熟的蛋白質(zhì)組學(xué)分離技術(shù)，它依據(jù)蛋白質(zhì)等電點(diǎn)與相對(duì)分子質(zhì)量的不同而實(shí)現(xiàn)蛋白高通量的分離。2-DE技術(shù)在第一向IPG 膠條的制備和第二向凝膠的處理方面都有了很大提高，已廣泛應(yīng)用于醫(yī)學(xué)研究。Qian等[5]運(yùn)用該技術(shù)發(fā)現(xiàn)了與膽固醇結(jié)石形成有關(guān)的4種蛋白質(zhì)；Ayyub等[6]憑借該技術(shù)發(fā)現(xiàn)了可能對(duì)肺癌早期診斷有價(jià)值的蛋白生物標(biāo)記物。

1.2 蛋白質(zhì)鑒定技術(shù) 目前最普遍的蛋白質(zhì)鑒定技術(shù)為生物質(zhì)譜分析技術(shù)，質(zhì)譜可先將分析物離子化，隨后質(zhì)荷比不同的帶電粒子在空間或時(shí)間上分離并排列成圖譜，根據(jù)所形成的圖譜對(duì)分析物進(jìn)行檢測(cè)鑒定[7]。常用的一級(jí)質(zhì)譜技術(shù)有基質(zhì)輔助激光解析飛行時(shí)間質(zhì)譜(MALDI-TOF-MS)、電噴射離子井飛行時(shí)間質(zhì)譜以及表面增強(qiáng)激光解析電離飛行時(shí)間質(zhì)譜(SELDI-TOF-MS)等。除此以外，二級(jí)質(zhì)譜即同時(shí)將兩個(gè)一級(jí)質(zhì)譜連在一起構(gòu)成的串聯(lián)質(zhì)譜(MS/MS)，因具有較高的特異性與靈敏性，且所需樣本量少，逐漸受到研究者的青睞。如串聯(lián)質(zhì)譜技術(shù)作為新生兒遺傳代謝疾病的初篩手段，大大提高了疾病檢出率，有助于疾病的早期診斷和治療，從而降低病死率，改善預(yù)后[8]。

1.3 生物信息學(xué)技術(shù) 經(jīng)過(guò)分離與鑒定，還需對(duì)蛋白質(zhì)的功能和結(jié)構(gòu)進(jìn)行分析。蛋白質(zhì)的功能分析一般采用Mascot搜索Swiss-prot、PIR等常用的蛋白質(zhì)序列數(shù)據(jù)庫(kù)，將樣品蛋白質(zhì)與已知蛋白質(zhì)序列進(jìn)行比較以了解其功能；也可通過(guò)蛋白質(zhì)的物理性質(zhì)進(jìn)行預(yù)測(cè)，或者與保守基序和圖形數(shù)據(jù)庫(kù)比較，以判斷其功能。相比蛋白質(zhì)功能的測(cè)定，蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)的測(cè)定則困難許多。雖然在PDB等數(shù)據(jù)庫(kù)中可檢測(cè)到蛋白質(zhì)高級(jí)結(jié)構(gòu)的同源性，但蛋白質(zhì)的折疊過(guò)程仍不清晰。蛋白質(zhì)三維結(jié)構(gòu)的預(yù)測(cè)是目前最困難、最復(fù)雜的預(yù)測(cè)技術(shù)，目前采用的方法有同源模建、threadin算法等[9]。

1.4 相對(duì)和絕對(duì)定量同位素標(biāo)記(iTRAQ)技術(shù) iTRAQ技術(shù)是美國(guó)應(yīng)用生物系統(tǒng)公司在2004年推出的一項(xiàng)新的體外同位素標(biāo)記技術(shù)，具有高通量、高靈敏的特點(diǎn)，它的出現(xiàn)促使比較蛋白質(zhì)組學(xué)向定量蛋白質(zhì)組學(xué)升級(jí)發(fā)展[10]。iTRAQ技術(shù)的流程如下：將樣品酶分解為肽段后，分別用iTRAQ試劑進(jìn)行差異標(biāo)記、混合，最后用液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜(LC-MS/MS)技術(shù)進(jìn)行分析。該技術(shù)可對(duì)同一實(shí)驗(yàn)下的8個(gè)樣品同時(shí)進(jìn)行相對(duì)量化，大大降低實(shí)驗(yàn)過(guò)程中的技術(shù)誤差，因此很多醫(yī)學(xué)研究者用此技術(shù)尋找疾病狀態(tài)下的特異表達(dá)蛋白，以發(fā)現(xiàn)治療藥物的新靶點(diǎn)。Ran等[11]通過(guò)對(duì)15例胃癌患者的胃組織進(jìn)行iTRAQ技術(shù)分析，發(fā)現(xiàn)包括嗅質(zhì)蛋白4在內(nèi)的4種蛋白質(zhì)表達(dá)上調(diào)，且體外研究發(fā)現(xiàn)抑制嗅質(zhì)蛋白4的表達(dá)后，胃癌細(xì)胞的轉(zhuǎn)移、侵襲與增殖也受到抑制。因此，抑制嗅質(zhì)蛋白4的表達(dá)可能成為未來(lái)抗癌藥物研制的方向之一。

2 蛋白質(zhì)組學(xué)在LDH中的應(yīng)用

2.1 在LDH中醫(yī)證型診斷中的應(yīng)用 蛋白質(zhì)組學(xué)是研究生物信息學(xué)在整體水平上的相互作用，與中醫(yī)的整體觀念不謀而合，并且其客觀的研究結(jié)果可彌補(bǔ)傳統(tǒng)中醫(yī)辨證指標(biāo)主觀性強(qiáng)的缺點(diǎn)[12]。蛋白質(zhì)組學(xué)運(yùn)用于LDH的中醫(yī)證型診斷為研究其辨證規(guī)律提供了新思路。許建文等[13]應(yīng)用SELDI-TOF-MS技術(shù)對(duì)LDH血瘀證患者、LDH非血瘀證患者和健康人血清蛋白質(zhì)組學(xué)進(jìn)行了比較研究，發(fā)現(xiàn)了11個(gè)差異蛋白質(zhì)點(diǎn)；其采用Biomarker Patterns軟件構(gòu)建LDH血瘀證的血清學(xué)診斷模型，結(jié)果顯示LDH血瘀證患者ROC曲線下面積為0.984，說(shuō)明該血清學(xué)診斷模型的診斷價(jià)值較高。趙偉等[14]采用SELDI-TOF-MS技術(shù)及蛋白質(zhì)芯片技術(shù)檢測(cè)壯族LDH血瘀證患者、漢族LDH血瘀證患者、壯族LDH非血瘀證患者和漢族LDH非血瘀證患者的血清樣本，共找出13個(gè)表達(dá)顯著差異的蛋白質(zhì)點(diǎn)，并由此構(gòu)建出壯族LDH血瘀證的血清學(xué)診斷模型；經(jīng)盲法驗(yàn)證，該模型陽(yáng)性預(yù)測(cè)值達(dá)到94.44%，表明由13個(gè)差異表達(dá)蛋白構(gòu)成的診斷模型可區(qū)分壯族與其他民族LDH血瘀證及其他中醫(yī)證型。以上研究為應(yīng)用生物標(biāo)志物進(jìn)行LDH的中醫(yī)辨證奠定基礎(chǔ)。

2.2 在神經(jīng)根損傷發(fā)病機(jī)制研究中的應(yīng)用 神經(jīng)根受壓是LDH的主要病理特征之一，除了單純的機(jī)械作用，突出的髓核可能引起神經(jīng)根的生化與免疫反應(yīng)，從而引起LDH的一系列臨床癥狀。Liu等[15]采集觀察組(LDH引起的脊神經(jīng)根損傷患者)與對(duì)照組(椎間盤正?；颊?的腦脊液，使用2-DE結(jié)合LC-IT-MS技術(shù)分析腦脊液蛋白質(zhì)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)兩組間存在15個(gè)表達(dá)差異的蛋白質(zhì)點(diǎn)，其中9個(gè)在觀察組腦脊液中水平升高，包括胱抑蛋白C、載脂蛋白A-IV、維生素D結(jié)合蛋白、神經(jīng)微絲的3種L蛋白、四連接素、免疫球蛋白G和血紅蛋白，并通過(guò)ELISA法證實(shí)了這些蛋白質(zhì)表達(dá)的改變可能與LDH引起的脊神經(jīng)根損傷有關(guān)。有研究建立了大鼠背根神經(jīng)節(jié)持續(xù)受壓(CCD)模型，28天后處死大鼠，提取蛋白，先通過(guò)雙向電泳分離蛋白，找出差異表達(dá)蛋白質(zhì)點(diǎn)后運(yùn)用MALDI-TOF-MS技術(shù)進(jìn)行鑒定，分析所得肽指紋圖譜，發(fā)現(xiàn)共15種差異表達(dá)的蛋白；其中7種蛋白在CCD組表達(dá)上調(diào)(其中1種蛋白只存在于CCD組)，并推測(cè)膜聯(lián)蛋白A2、p11和蛋白激酶Ce蛋白表達(dá)的上調(diào)可能參與了神經(jīng)性疼痛的發(fā)生[16, 17]。

2.3 在坐骨神經(jīng)痛發(fā)病機(jī)制研究中的應(yīng)用 LDH是導(dǎo)致坐骨神經(jīng)痛的主要原因之一，但其機(jī)制尚未明確；椎間盤源性痛目前主要依賴經(jīng)驗(yàn)推測(cè)，無(wú)法通過(guò)臨床診斷證實(shí)[18]，而蛋白質(zhì)組學(xué)有可能成為該病最有效的生物標(biāo)記物追蹤技術(shù)。Xie等[19]借助2-DE結(jié)合MALDI-TOF-MS技術(shù)，分析了30例由LDH引起坐骨神經(jīng)痛患者與30位健康志愿者的血清樣本，發(fā)現(xiàn)了6種差異蛋白質(zhì)，包括表達(dá)升高的載脂蛋白-L1與兩種血清白蛋白前體，以及表達(dá)降低的載脂蛋白M、四連接素與免疫球蛋白輕鏈；并通過(guò)ELISA法進(jìn)行反向驗(yàn)證，結(jié)果表明載脂蛋白-L1、載脂蛋白M、四連接素以及免疫球蛋白輕鏈這4種蛋白質(zhì)可能是與LDH引起的坐骨神經(jīng)痛相關(guān)的生物標(biāo)志物。

2.4 在腰椎退行性變研究中的應(yīng)用 腰椎退行性變是LDH發(fā)生的致病基礎(chǔ)，因此腰椎退行性變后的蛋白質(zhì)組學(xué)研究也成為L(zhǎng)DH蛋白質(zhì)組學(xué)研究的重要方向[20]。馮皓宇等[21]采用2-DE聯(lián)合MALDI-TOF-MS對(duì)人正常椎間盤纖維環(huán)和髓核細(xì)胞外基質(zhì)分子蛋白進(jìn)行鑒定，發(fā)現(xiàn)了19種相同的蛋白質(zhì)，為進(jìn)一步研究這些蛋白質(zhì)在椎間盤退變過(guò)程中的變化打下基礎(chǔ)。呂志德等[22]通過(guò)2-DE和MALDI-TOF-MS技術(shù)確定了正常和退變腰椎間盤組織中的6種差異蛋白質(zhì)，有助于深入研究這些蛋白質(zhì)在腰椎退行性變過(guò)程中的作用及其機(jī)制。Ye等[23]通過(guò)對(duì)椎間盤退行性變患者與正常患者的纖維環(huán)細(xì)胞蛋白質(zhì)表達(dá)進(jìn)行分析，找到了10種差異表達(dá)的蛋白質(zhì)，認(rèn)為這些蛋白質(zhì)與椎間盤退行性變的發(fā)病有關(guān)，并可作為其生物標(biāo)志物。Yee等[24]采用iTRAQ標(biāo)記LC-MS/MS技術(shù)，發(fā)現(xiàn)退變椎間盤組織中Ⅰ型膠原蛋白、纖連蛋白與HTRA1等蛋白表達(dá)上調(diào)，這種變化在年輕椎間盤退化患者的纖維環(huán)組織中亦能觀察到，證實(shí)椎間盤細(xì)胞外基質(zhì)的改變與其衰老和退化有關(guān)。以上研究可為腰椎退行性變生物特異性標(biāo)記物的確定及靶向藥物的研發(fā)提供參考。

綜上所述，與傳統(tǒng)技術(shù)注重研究單一蛋白質(zhì)不同，蛋白質(zhì)組學(xué)注重研究參與特定生理或病理狀態(tài)下的所有蛋白質(zhì)，這樣的優(yōu)勢(shì)使其在多個(gè)醫(yī)學(xué)領(lǐng)域被廣泛研究與應(yīng)用。LDH的早期防治與發(fā)病機(jī)制的闡明是目前醫(yī)學(xué)的難點(diǎn)和重點(diǎn)，但蛋白質(zhì)組學(xué)的興起為該問(wèn)題的解決帶來(lái)了新的希望。盡管與骨科其他經(jīng)典的檢驗(yàn)技術(shù)相比，蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)尚不成熟，如2-DE技術(shù)檢測(cè)敏感性與分辨率較低，質(zhì)譜技術(shù)對(duì)低分子量蛋白質(zhì)的鑒定效果欠佳等。但是，隨著現(xiàn)有技術(shù)的不斷完善和更多新技術(shù)的產(chǎn)生，蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)會(huì)為闡明LDH的發(fā)病機(jī)制、識(shí)別早期病變、明確診斷等做出更大的貢獻(xiàn)。目前，運(yùn)用蛋白質(zhì)組學(xué)闡明LDH發(fā)病機(jī)制的研究正在開(kāi)展，但是尚缺乏運(yùn)用該技術(shù)探討蛋白質(zhì)變化與治療效果之間關(guān)系的研究，今后可從蛋白質(zhì)組層面闡述LDH的治療手段。

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國(guó)家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(81473791)；江蘇省基礎(chǔ)研究計(jì)劃自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(BK20141464)；江蘇省第四期“333工程”培養(yǎng)基金資助項(xiàng)目。

徐桂華(E-mail: xgh88@126.com)

10.3969/j.issn.1002-266X.2016.16.037

R681.5

A

1002-266X(2016)16-0095-03

2015-11-26)