鄧蒂斯，徐曉娟，姚莉娟，王張，黃立華，李宛靜，何蘊(yùn)良

(成都中醫(yī)藥大學(xué)，成都610075)

模擬腎虛痰濕特征信息PCOS大鼠模型中GDF-9、BMPR-2的表達(dá)研究?

鄧蒂斯，徐曉娟△，姚莉娟，王張，黃立華，李宛靜，何蘊(yùn)良

(成都中醫(yī)藥大學(xué)，成都610075)

目的:探討生長分化因子-9(GDF-9)及骨形態(tài)發(fā)生蛋白受體-2(BMPR-2)在有腎虛痰濕特征信息的肥胖多囊卵巢綜合征(PCOS)大鼠模型的卵巢顆粒細(xì)胞中的表達(dá)。方法:分別在來曲唑(Letrozole)和脫氫表雄酮(DHEA)造?；A(chǔ)上加用高脂乳劑，建立肥胖PCOS動(dòng)物模型，結(jié)合陰道脫落細(xì)胞涂片、大鼠體質(zhì)量增加幅度、血脂水平和卵巢形態(tài)學(xué)的改變進(jìn)行模型驗(yàn)證，選用免疫組化法檢測大鼠模型卵巢組織卵泡顆粒細(xì)胞中GDF-9、BMPR-2的表達(dá)。結(jié)果:模型建立成功，Letrozole模型組、Letrozole肥胖模型組GDP-9積分光密度總和均顯著低于高脂模型組。此外，Letrozole肥胖模型組GDP-9平均灰度均值低于高脂模型組，DHEA模型組和DHEA肥胖模型組GDF-9積分光密度總和均顯著高于空白對照組，Letrozole模型組BMPR-2積分光密度總和均顯著高于高脂模型組，DHEA模型組BMPR-2積分光密度總和顯著高于高脂模型組。結(jié)論:推測GDF-9、BMPR-2在肥胖PCOS大鼠模型卵巢的卵泡顆粒細(xì)胞中表達(dá)降低可能是肥胖PCOS發(fā)生發(fā)展的重要原因。

生長分化因子-9;骨形態(tài)發(fā)生蛋白受體-2;腎虛痰濕特征信息;肥胖PCOS大鼠模型;顆粒細(xì)胞

多囊卵巢綜合征(polycystic ovarian syndrome， PCOS)是涉及多器官、多系統(tǒng)的以排卵障礙、高雄激素血癥和(或)胰島素抵抗(IR)為特征的內(nèi)分泌紊亂性疾病，臨床表現(xiàn)可見高度多樣化，其病理機(jī)制尚無定論［1］。李琴華等［2］指出，38%～88%的PCOS患者都伴有體質(zhì)量超標(biāo)或肥胖，肥胖型PCOS患者伴有代謝綜合征的風(fēng)險(xiǎn)明顯高于非肥胖型PCOS患者。最近研究表明，卵巢病理改變的重要原因是卵巢局部微環(huán)境紊亂和細(xì)胞因子表達(dá)及功能異常，卵母細(xì)胞分泌的生長分化因子-9(GDF-9)與卵泡生長發(fā)育密切相關(guān)，推測GDF-9表達(dá)發(fā)生變化也許是導(dǎo)致本病患者卵泡發(fā)育異常的原因之一［3-4］。骨形態(tài)發(fā)生蛋白受體-2(BMPR-2)主要表達(dá)于顆粒細(xì)胞和卵泡膜細(xì)胞，主要通過與GDF-9結(jié)合起作用［5］。GDF-9和BMPR-2都是卵泡生長發(fā)育和卵巢功能的重要調(diào)節(jié)因子，均經(jīng)由自分泌和旁分泌機(jī)制對卵巢局部細(xì)胞的分化、增殖和其他功能進(jìn)行調(diào)節(jié)，從而達(dá)到對優(yōu)勢卵泡形成和卵母細(xì)胞成熟的調(diào)控［6-7］。本研究系對GDF-9和BMPR-2在肥胖PCOS動(dòng)物模型卵丘顆粒細(xì)胞的蛋白表達(dá)進(jìn)行探索性研究，旨在探討卵源性因子在PCOS卵泡發(fā)育異常機(jī)制中的作用。

1 材料與方法

1.1 動(dòng)物與試劑

6周齡清潔級SD雌性大鼠36只，體質(zhì)量100～120 g，購于成都達(dá)碩生物科技有限公司(生產(chǎn)許可證號SCXK(川)2013-24，生產(chǎn)批號0018284)。飼養(yǎng)條件:環(huán)境溫度為20℃～24℃，濕度40%～70%，每天陽光下照射10 h，自由飲水，進(jìn)食顆粒飼料。來曲唑(Letrozole)購于江蘇恒瑞醫(yī)藥股份有限公司(生產(chǎn)批號14030657)，脫氫表雄酮(DHEA)購于美國IL公司，注射用油購于天津市北辰方正試劑廠(生產(chǎn)批號201407)，膽固醇購自河南興源化工產(chǎn)品有限公司(20140524)。兔抗鼠GDP-9多克隆抗體(BA1288，生產(chǎn)批號59000)和兔抗鼠BMPR-2多克隆抗體(BA2820-1，生產(chǎn)批號D-B1-08E07A)購于博士德生物有限公司。

1.2 分組與建立改良PCOS動(dòng)物模型采用隨機(jī)數(shù)字表法將大鼠分為空白對照組、高脂模型組、Letrozole模型組、Letrozole聯(lián)合高脂模型組(簡稱Letrozole肥胖模型組)、DHEA模型組和DHEA聯(lián)合高脂模型組(簡稱DHEA肥胖模型組)6組各6只，分籠喂養(yǎng)。造模方法:空白對照組大鼠行頸部皮下注射生理鹽水0.2 ml，同時(shí)灌胃濃度10 mg/ml的羧甲基纖維素溶液(CMC)13 ml/kg·d;高脂模型組大鼠灌胃高脂乳劑(豬油+膽固醇，豬油∶膽固醇=10∶3)15 ml/kg·d;Letrozole模型組大鼠灌胃Letrozole1 ml/kg·d;Letrozole肥胖模型組大鼠灌胃Letrozole1 ml/kg·d及灌胃高脂乳劑15 ml/kg·d;DHEA模型組大鼠皮下注射DHEA 60 ml/kg·d;DHEA肥胖模型組大鼠皮下注射DHEA 60 ml/kg·d及灌胃高脂乳劑15 ml/kg·d。連續(xù)21 d于早上9時(shí)開始造模處理。

1.3 大鼠動(dòng)情周期檢測

自造模處理第10天起，各組每天開始進(jìn)行陰道涂片，用生理鹽水浸泡消毒棉拭子放入大鼠陰道逆時(shí)針旋轉(zhuǎn)，取出后涂片。涂片自然風(fēng)干后行巴氏染色法染色。鏡下連續(xù)觀察動(dòng)情周期的變化2個(gè)周期，1個(gè)動(dòng)情周期為5 d。

1.4 卵巢標(biāo)本處理

造模處理第22天以苯巴比妥鈉麻醉大鼠。取出雙側(cè)卵巢，左側(cè)用福爾馬林、醋酸、酒精固定液(FAA)固定48 h，逐級酒精脫水，后用二甲苯透明、浸臘，以卵巢最大平面為待測面，常規(guī)石蠟包埋，制成4 μm厚切片，在Mias-2000圖形分析系統(tǒng)(四川大學(xué)圖像圖形研究所)下定量觀察。將右側(cè)卵巢迅速置入－80℃保存。

1.5 體質(zhì)量與血脂檢測

測量體質(zhì)量，股動(dòng)脈取血分離血清。采用全自動(dòng)生化分析儀檢測甘油三酯(TG)、膽固醇(TC)后，頸椎脫臼處死大鼠。

1.6 免疫組織化學(xué)檢測

將左側(cè)卵巢冷藏后進(jìn)行石蠟切片脫蠟至水。室溫條件下孵育10 min，去除內(nèi)源性過氧化物酶活性。蒸餾水沖洗，PBS浸泡5 min。用PBS稀釋的10%正常山羊血清封閉，室溫條件下孵育10 min。傾去血清，滴加稀釋的一抗(稀釋倍數(shù)1∶100)，4℃過夜。PBS沖洗3×5 min，滴加生物素標(biāo)記的二抗工作液，室溫30 min，PBS3×5 min。滴加辣根酶標(biāo)記鏈霉卵白素工作液，室溫孵育30 min，PBS 3×5 min，DAB顯色。自來水充分沖洗、復(fù)染、封片。一抗由PBS代替為陰性對照，卵巢組織顆粒細(xì)胞呈現(xiàn)棕黃色顆粒為陽性信號。每張切片隨機(jī)選定5個(gè)區(qū)域，分別測定陽性細(xì)胞的平均灰度，再取平均值分別反映該卵巢組織中GDF-9和BMPR-2蛋白質(zhì)表達(dá)水平。取10ul PCR產(chǎn)物，用2%瓊脂糖凝膠行電泳，應(yīng)用凝膠圖像分析處理系統(tǒng)掃描并計(jì)算積分光密度。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用PEMS 3.1統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，計(jì)量數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(±s)表示，多組間比較采用單因素方差分析，P＜0.01，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 動(dòng)情周期變化

表1顯示，空白對照組大鼠陰道涂片均保持規(guī)律的4 d動(dòng)情周期的變化。高脂模型組大鼠陰道涂片示動(dòng)情前期、動(dòng)情期及間期交替出現(xiàn)。Letrozole模型組大鼠動(dòng)情周期紊亂，陰道涂片示持續(xù)4 d處于動(dòng)情間期。DHEA模型組和DHEA肥胖模型組大鼠失去正常動(dòng)情周期，陰道涂片示持續(xù)處于動(dòng)情前期和動(dòng)情期。

2.2 體質(zhì)量增長幅度變化

表2顯示，高脂模型組大鼠的體質(zhì)量增長幅度顯著高于空白對照組(P＜0.05)。Letrozole模型組、Letrozole肥胖模型組、DHEA模型組和DHEA肥胖模型組大鼠的體質(zhì)量增長幅度均極顯著高于空白對照組和高脂模型組(P＜0.01)。Letrozole模型組的體質(zhì)量增長幅度低于Letrozole肥胖模型組大鼠，DHEA模型組大鼠的體質(zhì)量增長幅度低于DHEA肥胖模型組，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。

表1 大鼠動(dòng)情周期及排卵情況

2.3 血脂水平

表2顯示，Letrozole肥胖模型組大鼠的TC極顯著高于空白對照組、高脂模型組和Letrozole模型組(P＜0.01)。Letrozole模型組大鼠的TG顯著高于空白對照組。Letrozole肥胖模型組大鼠的TG顯著高于空白對照組、高脂模型組和Letrozole模型組(P＜0.05)。DHEA模型組TC、TG顯著高于空白對照組(P＜0.01)。DHEA肥胖模型組大鼠的TC極顯著高于空白對照組、高脂模型組和DHEA模型組(P＜0.01)。DHEA肥胖模型組大鼠的TG極顯著高于空白對照組，高于高脂模型組和DHEA模型組(P＜0.05)。

表2 大鼠體質(zhì)量增加幅度和血脂水平表(±s)

表2 大鼠體質(zhì)量增加幅度和血脂水平表(±s)

注:與空白對照組比較:*P＜0.05，＊＊P＜0.01;與高脂模型組比較:△P＜0.05，△△P＜0.01;與Letrozole模型組比較:▲P＜0.05，▲▲P＜0.01;與DHEA模型組比較:#P＜0.05

組別鼠數(shù)體質(zhì)量增加幅度(g)TC(mmol/L)TG(mmol/L) 54.12±10.23 1.42±0.22 0.75±0.19高脂模型組6 67.87±9.71*1.54±0.14 0.81±0.10 Letrozole模型組6 83.45±9.65＊＊△△1.63±0.18 0.98±0.15＊＊Letrozole肥胖模型組6 85.78±11.86＊＊△△2.01±0.23＊＊△△▲▲1.09±0.09＊△▲DHEA模型組6 80.42±9.80＊＊△△1.91±0.10＊＊0.93±0.08＊＊DHEA肥胖模型組6 82.59±9.73＊＊△△2.31±0.31＊＊△△▲▲1.05±0.17＊＊△#空白對照組6

2.4 卵巢HE染色

空白對照組大鼠卵巢表面較紅，HE染色后在光鏡下觀察到發(fā)育時(shí)期各不相同的初級卵泡、次級卵泡、成熟卵泡、黃體和白體。其余各造模組大鼠卵巢表面蒼白，HE染色后在光鏡下觀察，高脂模型組大鼠可見閉鎖卵泡和囊狀卵泡數(shù)量增多，同時(shí)可見少量的黃體和白體。Letrozole模型組、Letrozole肥胖模型組、DHEA模型組、DHEA肥胖模型組分別行HE染色法，光鏡下大鼠卵巢的次級卵泡數(shù)量減少，而囊狀卵泡和閉鎖卵泡增多，未見排卵前的成熟卵泡，同時(shí)可見黃體和白體明顯減少。

2.5 GDF-9及BMPR-2在PCOS卵巢中表達(dá)

圖1、2顯示，GDF-9免疫組化法檢測顯示，空白對照組大鼠卵巢結(jié)構(gòu)完整，正常的初級卵泡、次級卵泡是GDF-9主要表達(dá)的部位。其余各模型組卵巢組織結(jié)構(gòu)紊亂，可見大量閉鎖卵泡及囊狀擴(kuò)張的卵泡，在顆粒細(xì)胞層中可見少許GDF-9分布。BMPR-2免疫組化法檢測顯示，空白對照組BMPR-2主要表達(dá)于發(fā)育正常的始基卵泡、初級卵泡和小竇卵泡中。其余各模型組BMPR-2在始基卵泡、初級卵泡表達(dá)降低，同樣在小竇卵泡達(dá)到較高水平。

圖1 卵巢組織GDF-9蛋白的免疫組織化學(xué)染色結(jié)果(×100)

Letrozole模型組和Letrozole肥胖模型組GDF-9積分光密度總和顯著低于高脂模型組(P＜0.05)。Letrozole肥胖模型組GDF-9平均灰度均值均低于高脂模型組(P＜0.05)。DHEA模型組和DHEA肥胖模型組GDF-9積分光密度總和顯著高于空白對照組(P＜0.05)。DHEA模型組和DHEA肥胖模型組GDF-9平均灰度均值低于空白對照組和高脂模型組，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。Letrozole造模法可致肥胖PCOS大鼠積分光密度總和降低，DHEA造模法則發(fā)現(xiàn)肥胖PCOS大鼠積分光密度總和升高。然而所有的PCOS大鼠平均灰度均值均降低，表明GDF-9在肥胖PCOS動(dòng)物模型中的表達(dá)降低。Letrozole模型組BMPR-2積分光密度總和顯著高于高脂模型組(P＜0.05)。Letrozole模型組和Letrozole肥胖模型組BMPR-2平均灰度均值低于空白對照組和高脂模型組，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。DHEA模型組BMPR-2積分光密度總和顯著高于高脂模型組(P＜0.05)。DHEA模型組和DHEA肥胖模型組BMPR-2平均灰度均值均低于空白對照組和高脂模型組，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。Letrozole造模法、DHEA造模法可致PCOS大鼠積分光密度總和升高，平均灰度均值均降低，表明BMPR-2在PCOS動(dòng)物模型中表達(dá)降低。

圖2 卵巢組織BM PR-2蛋白的免疫組織化學(xué)染色結(jié)果(×100)

表3 GDF-9及BM PR-2在肥胖PCOS動(dòng)物模型中的表達(dá)(±s)

表3 GDF-9及BM PR-2在肥胖PCOS動(dòng)物模型中的表達(dá)(±s)

注:與空白對照組比較:*P＜0.05;與高脂模型組比較:△P＜0.05

組GDF-9 BMPR-2別鼠數(shù)積分光密度總和平均灰度均值積分光密度總和平均灰度均值空白對照組6 15558.84±3119.70 116.68±8.06 18997.81±26 114.99±6.25 26816.42±8641.28 101.93±7.91 28.27 108.31±4.25高脂模型組6 18085.17±4407.14 116.55±3.40 14645.58±4019.42 106.93±3.49 Letrozole模型組6 12721.82±3980.68△110.73±3.98 22687.59±5037.26△102.41±7.55 Letrozole肥胖模型組6 12577.38±2154.50△109.06±3.10△18510.97±5097.50 105.69±3.73 DHEA模型組6 23586.88±5446.42*113.67±4.70 31012.49±16751.53△105.56±10.86 DHEA肥胖模型組6 21332.98±4380.13*

3 討論

課題組前期研究發(fā)現(xiàn)，DHEA造模、芳香化酶抑制劑造模均可出現(xiàn)體質(zhì)量增加，卵巢質(zhì)量、卵巢體積增加，促黃體生成素、促卵泡生成素、睪酮升高，胰島素抵抗及卵巢呈現(xiàn)多囊樣改變。DHEA造模卵巢無論是組織形態(tài)學(xué)還是激素水平的變化，均與PCOS患者接近。但由于介入外源性的雄激素，為排除外源性雄激素造成的干擾，故造模時(shí)同時(shí)采用芳香化酶抑制劑。芳香化酶抑制劑所造腎虛痰濕特征信息PCOS大鼠模型與人類疾病相似，可作為DHEA造模的對比。本研究加用高脂乳劑造模大鼠模擬前述近似腎虛痰濕證型患者的多項(xiàng)特征生化信息，此改良造模方法在課題組前期研究中已有論述［8］。Letrozole肥胖模型組大鼠的體質(zhì)量增加幅度高于Letrozole模型組，TC及TG極顯著高于空白對照組、高脂模型組和Letrozole模型組。DHEA肥胖模型組大鼠的TC及TG極顯著高于空白對照組、高脂模型組和DHEA模型組。大鼠處死時(shí)體質(zhì)量增加幅度明顯升高，血脂TC、TG增高，成功建立肥胖PCOS模型。PCOS的病理特點(diǎn)為卵泡發(fā)育過程中卵泡募集亢進(jìn)，優(yōu)勢化選擇受阻和卵泡閉鎖退化失調(diào)，造成小卵泡的集聚，無優(yōu)勢卵泡形成。卵母細(xì)胞和卵泡發(fā)生是一個(gè)協(xié)同過程，卵母細(xì)胞的生長和卵泡發(fā)育與卵母細(xì)胞和體細(xì)胞的相互交流有著重要的聯(lián)系。研究表明，卵母細(xì)胞分泌的GDF-9和BMPR-2對調(diào)節(jié)卵巢功能、卵泡發(fā)育過程中卵泡膜細(xì)胞增殖與分化具有重要作用，推測GDF-9參與了肥胖PCOS發(fā)病的病理生理過程。由卵子分泌的GDF-9和BMPR-2可直接調(diào)節(jié)顆粒細(xì)胞的增生、分化、代謝、黃素化和凋亡，顆粒細(xì)胞的分泌信號也通過顆粒細(xì)胞間的縫隙連接調(diào)節(jié)卵子的生長和發(fā)育［9-10］。

本研究結(jié)果表明，Letrozole模型組、Letrozole肥胖模型組、DHEA模型組和DHEA肥胖模型組GDF-9表達(dá)降低，可以推測GDF-9在腎虛痰濕特征信息PCOS大鼠模型的卵巢卵泡顆粒細(xì)胞中表達(dá)的降低，可能是影響卵母細(xì)胞形成及質(zhì)量的原因之一，而卵巢發(fā)育的異常又會(huì)影響GDF-9的分泌，從而形成惡性循環(huán)。Letrozole模型組、Letrozole肥胖模型組、DHEA模型組和DHEA肥胖模型組BMPR-2平均灰度均值均低于空白對照組。BMPR-2表達(dá)水平的降低也可能是影響卵母細(xì)胞形成及質(zhì)量的原因之一，GDF-9與BMPR-2結(jié)合才能發(fā)揮作用，BMPR-2表達(dá)的降低將進(jìn)一步導(dǎo)致GDF-9信號通路異常，從而影響卵母細(xì)胞的形成及質(zhì)量。有臨床研究也顯示，PCOS不排卵患者GDF-9 mRNA的表達(dá)降低并延遲［11］。

綜上所述，具有近似中醫(yī)臨床腎虛痰濕證型特征信息的肥胖PCOS動(dòng)物模型顆粒細(xì)胞中GDF-9、BMP-2蛋白表達(dá)水平低下可能影響卵母細(xì)胞質(zhì)量，形成大量的閉鎖卵泡和囊狀卵泡，無排卵前的成熟卵泡，最終導(dǎo)致肥胖PCOS形成。因此對GDF-9和BMPR-2的深入研究，對治療腎虛痰濕證肥胖型PCOS具有臨床指導(dǎo)意義，二者之間的相互作用尚有待進(jìn)一步的研究。

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Expression Research on GDF-9，BMPR-2 in the PCOS Rat Models Simulate the Feature Information of Kidney Deficiency and Phlegm-dampness Stagnation

DENG Di-si，XU Xiao-juan△，YAO Li-juan，WANG Zhang，HUANG Li-hua，LI Wang-jing，HE Yun-liang
(Chengdu University of Chinese Medicine，Chengdu 610075，China)

Objective: To study the expression of Growth differentiation factor 9 (GDF-9) and Bone morphogenetic protein receptor type 2 (BMPR-2) in the ovarian granular cells of the obese Polycystic Ovary Syndrome(PCOS) rat models which has the characteristics of the deficiency of kidney and the stagnation of phlegm-dampness．Method: The obesity PCOS rat models were built respectively with high fat emulsion on the basis of Letrozole and DHEA(Dehydroepiandrosterone) models．The models were verified by the smears of vaginal exfoliated cells，the weight growth rate when rats were killed，the lipid levels and the morphological changes of ovarian．Immunohistochemical method was chosen to detect the expression of GDF-2，BMPR-2 in the ovarian tissue granulosa cells of rat models．Results: Models were set up successfully．The GDP-9 integral optical density in Letrozole group and Letrozole obese group were both significantly lower than high fat emulsion group．Besides，the GDP-9 average grayscale valuein Letrozole obese group was lower than high fat emulsion group; the GDP-9 integral optical density in DHEA group and DHEA obese group were significantly higher than the blank control group; the BMPR-2 integral optical density in Letrozole group was significantly higher than high fat emulsion group; the BMPR-2integral optical density in DHEA group was significantly higher than high fat emulsion group，the differences were statistically significant．Conclusion: It can be inferred that the expression of GDF-9 and BMPR-2 reduced in the ovarian follicle granulosa cells of the obese PCOS rat models were likely to be the important reasons for occurrence and development of the obese PCOS．

GDF-9;BMPR-2;Characteristics Of the Deficiency of Kidney And the Stagnation Of Phlegm-dampness; the Obese PCOS Rat Model;Granular Cells

R285.5

:B

:1006-3250(2016)05-0621-05

2015-09-14

國家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(81470199)-經(jīng)APN信號通路探討補(bǔ)腎化痰法調(diào)控肥胖型PCOS卵泡發(fā)育機(jī)制研究;成都中醫(yī)藥大學(xué)科技發(fā)展基金項(xiàng)目(ZRMS201307)-PCOS動(dòng)物模型中腎虛痰濕型診斷要素的信息挖掘研究

鄧蒂斯(1990-)，女，四川成都人，在讀碩士，從事中藥對女性生殖內(nèi)分泌調(diào)控的臨床與研究。

△通訊作者:徐曉娟(1969-)，女，江蘇鎮(zhèn)江人，副研究員，醫(yī)學(xué)博士，碩士研究生導(dǎo)師，從事補(bǔ)腎中藥對女性生殖內(nèi)分泌調(diào)控的臨床與研究，Tel:13980971928，E-mail:847956379@ qq.com。