王晗，姚敏，楊君伶，潘劉翃，閆輝，韓靜，岳明，姚登福

（1南通大學(xué)附屬醫(yī)院臨床醫(yī)學(xué)研究中心，江蘇南通226001；2復(fù)旦大學(xué)附屬中山醫(yī)院；3中國人民解放軍150中心醫(yī)院；4南京醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院）

Wnt通路關(guān)鍵分子Wnt3a表達對肝癌診斷與鑒別診斷價值*

王晗1,2，姚敏1，楊君伶1，潘劉翃1，閆輝3，韓靜3，岳明4，姚登福1

（1南通大學(xué)附屬醫(yī)院臨床醫(yī)學(xué)研究中心，江蘇南通226001；2復(fù)旦大學(xué)附屬中山醫(yī)院；3中國人民解放軍150中心醫(yī)院；4南京醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院）

目的：分析Wnt通路關(guān)鍵信號分子Wnt3a表達對HCC的診斷價值。方法：收集80例肝癌、53例肝硬化及慢乙肝患者和40例健康對照血清，用ELISA檢測Wnt3a水平,與AFP比較評估Wnt3a診斷價值;以免疫組化法分析80例肝癌及癌周組織Wnt3a表達。結(jié)果：肝癌患者血Wnt3a水平顯著高于各良性肝病組(P＜0.001),與肝硬化、HBV感染、TNM分期顯著相關(guān)(P＜0.05)；如以800 ng/L為正常上限,診斷肝癌敏感度、特異度、準確度、陽性和陰性預(yù)測值分別為92.5%、94.3%、93.2%、96.1%和89.3%,與AFP聯(lián)檢敏感度達96.3%,ROC下面積為0.994高于AFP的0.710(P＜0.001)。癌組織Wnt3a定位于胞漿和細胞膜上,陽性率96.2%顯著高于癌周組46.3%(P＜0.001);癌組織Wnt3a高表達(3～6分)占71.3%,癌旁組僅13.8%。Wnt3a高表達與分化等級、肝硬化、HBV感染、TNM分期顯著相關(guān)(P＜0.01)。結(jié)論：Wnt通路關(guān)鍵信號分子Wnt3a表達是良、惡性肝病診斷與鑒別的特異標志物。

肝細胞性肝癌；Wnt3a；診斷；信號通路

肝細胞性肝癌（Hepatocellular carcinoma，HCC）是最常見的惡性腫瘤之一。HCC患者治療以手術(shù)為主，非手術(shù)為輔助，雖有多種激酶抑制劑如索拉非尼能延長HCC患者生存期，但其發(fā)現(xiàn)較晚，預(yù)后不佳[1-2]。HCC發(fā)生發(fā)展是復(fù)雜的多階段過程，涉及基因突變、染色體畸變、表觀遺傳學(xué)改變以及多種相關(guān)信號通路的調(diào)節(jié)異常[3]。Wnt通路激活與肝癌發(fā)生和進展相關(guān)，經(jīng)典通路關(guān)鍵信號分子Wnt3a位于染色體17q21，胚胎發(fā)育早期被激活，在細胞更新和分化過程中起重要作用。近來，發(fā)現(xiàn)Wnt3a經(jīng)硫酸酯酶-2和磷脂酰肌醇蛋白多糖-3（glypican-3，GPC-3）激活Wnt經(jīng)典通路[4-5]，促進肝癌細胞增殖和裸鼠皮下移植瘤生長，可能是HCC細胞重要調(diào)節(jié)分子，然而在肝病進展過程中Wnt3a表達規(guī)律與臨床價值尚未見報道。為此，本文通過檢測HCC組織和血Wnt3a表達，以評估Wnt3a對良、惡肝病的診斷和鑒別診斷價值。

1 材料與方法

1.1 外周血標本收集

隨機選取南通大學(xué)附屬醫(yī)院2013年12月至2014年12月收治的80例原發(fā)性肝細胞性肝癌患者，53例慢性乙型肝炎患者，53例肝硬化患者。另隨機選取40例健康人作為正常對照組?；颊叩募{入及排除標準包括：①經(jīng)病理證實為原發(fā)性肝細胞性肝癌；②有完整的臨床病理資料；③未經(jīng)手術(shù)，放化療、內(nèi)分泌及生物治療?；颊叩南嚓P(guān)臨床資料收集自其病例記錄，另選取的對照組標本來源和時間同肝癌組。以上226例血液標本收集后經(jīng)3 000 r/min離心5～10 min，分離血清，-80℃低溫冰箱凍存，供檢測用。

1.2 肝癌組織標本

80例肝細胞性肝癌組織標本取材自南通大學(xué)附屬醫(yī)院2006～2008年肝癌手術(shù)切除標本，所選取的標本均符合以下標準：①經(jīng)病理證實為原發(fā)性肝細胞性肝癌；②有完整的臨床病理資料及隨訪數(shù)據(jù)；③手術(shù)之前均未接受過任何治療。根據(jù)Edmondson分級系統(tǒng)進行組織分化等級評定，將肝癌病例分為高分化（Ⅰ），中分化（Ⅱ+Ⅲ）和低分化（Ⅳ）三組。根據(jù)臨床影像學(xué)和術(shù)中探查結(jié)果綜合判斷門靜脈癌栓的有無，兩者皆提示存在門靜脈癌栓則視為有門靜脈癌栓。另選取80例癌旁組織標本作為正常對照。TNM分期結(jié)果根據(jù)國際抗癌聯(lián)盟第六版TNM分期標準分為Ⅰ～Ⅳ期。所有病例均有完整隨訪資料，符合全國肝癌防治協(xié)作組制定的標準核實診斷[6]，隨訪從手術(shù)日起至死亡日或最后隨訪日期為止，隨訪日期截止至2013年10月。

1.3 酶聯(lián)免疫吸附試驗(ELISA)檢測血Wnt3a濃度

Wnt3a ELISA試劑盒購自武漢優(yōu)爾生科技有限公司；按Elisa試劑盒操作說明進行檢測。操作步驟如下：加樣：標準孔，待測孔和空白孔每孔各100 μL；37℃溫育2 h；甩干，加檢測液A每孔100 μL；37℃溫育1 h；甩干，每孔用350 μL洗滌液洗滌3遍；每孔加檢測液B100 μL；37℃溫育30 min；甩干，每孔用350 μL洗滌液洗滌5遍；每孔加顯色液90 μL；37℃溫育25 min；每孔加終止液50 μL；用酶標儀在450 nm波長依次測量各孔的吸光度A值，并繪制標準曲線，根據(jù)標準曲線計算樣品標本中蛋白質(zhì)濃度。

1.4 組織芯片及免疫組織化學(xué)染色

所有標本組織用10%中性福爾馬林液固定，石蠟包埋，常規(guī)石蠟切片，厚度4 μm，備用。常規(guī)脫蠟，水化，雙氧水阻斷內(nèi)源性過氧化物酶，高壓加熱法修復(fù)抗原，用正常動物血清封閉非特異性結(jié)合。滴加鼠抗人Wnt3a抗體（ab81614;Abcam,UK），1∶50稀釋，室溫靜置1 h，PBST漂洗5 min×3次，滴加羊抗鼠IgG二抗（A21010;Abcam,UK），1∶5 000稀釋，室溫靜置30 min，PBST漂洗5 min×3次。DAB顯色5 min，蒸餾水沖洗5 min。蘇木素復(fù)染，鹽酸乙醇分色，蒸餾水沖洗5 min。依此用75%、85%、95%、100%乙醇脫水，二甲苯透明，中性樹膠封片。芯片通過日本Olympus公司BX50光學(xué)顯微鏡進行觀察及攝片。用0.01 mol/L PBS(pH=7.5)替代第一抗體、第二抗體作為陰性對照。

1.5 免疫組化分級標準

根據(jù)染色結(jié)果分為四級，深棕色且可見粗大有色顆粒者為+++，記3分，棕黃色且可見細小有色顆粒者為++，記2分，淺黃色未見明顯有色顆粒者為+，記1分，不著色者為（-），記0分[7]。記錄陽性染色細胞占所在切片中癌細胞的百分數(shù)，同樣分四級：0%記0分，0%～33%記1分，33%～66%記2分，67%～100%記3分。兩者之和為總得分，0～2為低表達，3～6為高表達。

1.6 統(tǒng)計學(xué)分析

采用SPSS 21.0統(tǒng)計軟件進行數(shù)據(jù)處理，定性資料采用χ2分析，等級資料采用曼惠特尼-U檢驗。定量數(shù)據(jù)以均數(shù)±標準差±s)表示，兩個樣本均數(shù)的比較采用t檢驗，P＜0.05表示差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。Graphpad Prism 5.0和Medcalc軟件分別繪制散點圖和ROC曲線。

2 結(jié)果

2.1 肝癌組織Wnt3a表達與胞內(nèi)分布特征

肝癌及癌周組織中Wnt3a表達及免疫組化分析見圖1。染色根據(jù)程度分為棕黃色或棕褐色，主要定位于細胞漿中和細胞膜上。肝癌組織Wnt3a表達陽性率為96.3%（77/80，圖1A和B）顯著高于自身對照的癌周組織46.3%(37/80，圖1C和D）χ2=48.818，P＜0.001。Wnt3a在肝癌組織和癌周組織的陽性表達率及其程度分級見表1。兩組染色評分差異有統(tǒng)計學(xué)意義（Z=8.144，P＜0.001）。HCC組織中Wnt3a陽性高表達（3～6分）為71.3%（57/80），而癌旁組織僅為13.8%。

圖1 肝癌組織和癌周組織Wnt3a表達的免疫組化分析

表1 肝癌和癌旁組織Wnt3a表達率及頻度的比較

2.2 肝癌組織Wnt3a表達與HCC臨床分期關(guān)系

Wnt3a表達和HCC臨床分期之間的關(guān)系見圖2。根據(jù)IUAC臨床分期標準，80例癌組織中I期9例（11.3%，38/80），II期27例（33.8%，27/80），III期38例（47.5%，38/80），IV期6例（7.5%，6/80）。在各臨床分期中Wnt3a高表達和低表達率分別是I期22.2%（2/9）和77.8%(7/9)，II期51.9%（14/27）和48.1%（13/27），III期94.7%（36/38）和5.3%（2/38），IV期83.3%（5/6）和16.7%（1/6）。這表明臨床分期越晚，Wnt3a陽性表達率越高。

圖2 Wnt3a表達與臨床分期的關(guān)系

2.3 肝癌組織Wnt3a表達的臨床病理學(xué)特征

根據(jù)Wnt3a在HCC中表達的平均評分為3分，將其分為高表達組（3～6分）和低表達組（0～2分）。肝癌組織Wnt3a高表達（n=57）和臨床病理學(xué)特征之間的關(guān)系見表2。統(tǒng)計結(jié)果顯示，Wnt3a高表達與分化等級（P=0.001），肝硬化（P=0.004），HBV感染（P＜0.001），TNM分期(P＜0.001)顯著相關(guān)。但與患者年齡、性別、AFP、腫瘤大小，門靜脈癌栓間差異無統(tǒng)計學(xué)意義。

表2 肝癌Wnt3a的表達和臨床病理因素之間的關(guān)系

2.4 血Wnt3a診斷肝癌及其評價

HCC、肝硬化、慢性肝病及正常對照組血Wnt3a表達見表3。HCC組血Wnt3a平均水平顯著高于其他慢性肝病組（P＜0.001）,分別是肝硬化4.0倍，慢性肝炎9.2倍，正常對照26.7倍。如以Wnt3a＞800 ng/L，AFP＞50 ng/mL為界，診斷HCC陽性率為92.5%和61.3%，肝硬化5.7%和30.2%，慢性肝炎0和9.4%，正常對照組未見陽性，良性肝病中僅3例肝硬化患者陽性；如Wnt3a以＞1 000 ng/L，良性肝病組未見陽性；將AFP調(diào)至100 ng/mL，良性肝病組仍有陽性病例占15.1%。Wnt3a和AFP對HCC診斷的ROC曲線(圖3)，Wnt3a為0.994，AFP為0.710（CI：0.625～0.786，P＜0.001）。如表4所示，Wnt3a的診斷敏感度、特異度、準確度、陽性和陰性預(yù)測值均在90%左右，明顯高于AFP。兩者聯(lián)檢敏感度會提至96.3%。

表3 慢性肝病患者循環(huán)血Wnt3a及AFP水平

圖3 血清Wnt3a和AFP數(shù)值散點圖及ROC曲線圖

表4 肝癌患者血清Wnt3a和AFP診斷價值評估

3 討論

Wnt家族是一類富含半胱氨酸的分泌型糖蛋白，已有19種家族成員。目前研究發(fā)現(xiàn)在人類多種腫瘤存在Wnt家族成員異常表達，可能參與激活Wnt信號通路[8]。體外研究發(fā)現(xiàn)Wnt家族成員Wnt3a在HCC細胞生長過程中是重要的分子，和SULF2和GPC-3結(jié)合后能誘導(dǎo)激活經(jīng)典Wnt信號通路，移植瘤研究發(fā)現(xiàn)Wnt3a增加HCC細胞增殖能力[9]。然而目前沒有研究報道Wnt3a表達和HCC診斷的關(guān)系。本文分析了慢性肝病患者循環(huán)血、肝癌以及癌旁組織Wnt3a的表達，探索Wnt3a作為HCC診斷標志物的應(yīng)用價值。

本研究顯示，HCC組織Wnt3a免疫組化染色呈棕色,分布于癌細胞的胞質(zhì)和細胞膜，癌旁組織僅見少量陽性表達。統(tǒng)計結(jié)果表明，HCC組織Wnt3a陽性率顯著高于癌旁組織，TNMⅣ期患者的癌組織Wnt3a染色呈強陽性，并且Wnt3a的表達與HCC發(fā)生和進展相關(guān)。盡管血AFP是肝癌最常用的標記物，但敏感性和特異性均不高，假陰性率或陽性率高。肝癌細胞表達Wnt3a并分泌入血，血Wnt3a陽性率(>800 ng/L)為92.5%，良性肝病僅3例肝硬化陽性。臨床資料分析結(jié)果顯示，Wnt3a表達與HBV、分化程度、TNM分期相關(guān)。比較ROC曲線下面積，Wnt3a明顯優(yōu)于AFP，聯(lián)合Wnt3a及AFP提升診斷敏感度至96.3%，表明血Wnt3a可作為診斷HCC的特異標記，并有助于良、惡性肝病的鑒別診斷[10]。

肝癌和血清Wnt3a水平與臨床病理特征之間的關(guān)系均表明高表達Wnt3a與分化等級，HBV感染，肝硬化及TNM分級顯著相關(guān)，提示W(wǎng)nt3a參與HBV慢性感染進展過程；肝硬化，HBV感染和Wnt3a高表達是HCC患者不良預(yù)后的獨立預(yù)測因素。HCC組織Wnt3a表達明顯高于癌旁組織，外周血Wnt3a過表達，聯(lián)合檢測Wnt3a與AFP有助于HCC診斷；癌組織Wnt3a高表達與HCC患者生存期密切相關(guān)。盡管Wnt3a在HCC中過表達分子機制尚不完全清楚，但其作為具有潛在價值的HCC診斷及鑒別分子標志，具有良好應(yīng)用價值；對其深入研究，有望成為早期診斷和預(yù)后指標或有效的治療靶點[11-12]。

1.Bruix J,Gores GJ,Mazzaferro V.Hepatocellular carcinoma:clinical frontiers and perspectives[J].Gut,2014,63(5): 844-885.

2.El-Serag HB.Hepatocellular carcinoma[J].N Engl J Med, 2011,365(12):1118-1127.

3.Thorgeirsson SS,Grisham JW.Molecular pathogenesis of human hepatocellular carcinoma[J].Nat Genet,2002,31 (4):339-346.

4.Tong Hv,Bock CT,Velavan TP.Genetic insights on host and hepatitis B virus in liver diseases[J].Mutat Res Rev Mutat Res,2014,762(1):65-75.

5.Vilchez V,Turcios L,Marti F,et al.Targeting Wnt/βcatenin pathway in hepatocellular carcinoma treatment[J]. World J Gastroenterol,2016,22(2):823-832.

6.中華人民共和國衛(wèi)生部.原發(fā)性肝癌診治標準[J].中華肝臟病雜志,2012,(20):419-426.

7.Zhang HJ,Yao DF,Yao M,et al.Annexin A2 silencing inhibits invasion,migration,and tumorigenic potential of hepatoma cells[J].World J Gastroenterol,2013，19(24): 3792-3801.

8.Duchartre Y,Kim YM,Kahn M.The Wnt signaling pathway in cancer[J].Crit Rev Oncol Hematol,2016,99 (1):141-149.

9.Lai JP,Oseini AM,Moser CD,et al.The oncogenic effect of sulfatase 2 in human hepato-cellular carcinoma is mediated in part by glypican 3-dependent Wnt activation[J]. Hepatology,2010,52(5):1680-1689.

10.Wang L,Yao M,Dong ZZ,et al.Circulating specific biomarkers in diagnosis of hepato-cellular carcinoma and its metastasis monitoring[J].Tumor Biol,2014,35(1):9-20.

11.Pez F,Lopez A,Kim M,et al.Wnt signaling and hepatocarcinogenesis:Molecular targets for the development of innovative anticancer drugs[J].J Hepatol,2013,59(5): 1107-1117.

12.Yu DD,Dong ZZ,Yao M,et al.Targeted glypican-3 gene transcription inhibited the proliferation of human hepatoma cells by specific short hairpin RNA[J].Tumor Biol,2013,34(2):661-668.

（2016-07-29收稿）

Diagnostic and differential values of key signal molecule Wnt3a expressed in the Wnt pathway for hepatocellular carcinoma

Wang Han1，2,Yao Min1,Yang Junling1,Pan Liuhong1,Yan Hui3,Han Jing3,Yue Ming4，Yao Dengfu11Research Center of Clinical Medicine,the Affiliated Hospital of Nantong University,Nantong,Jiangsu Province,226001；2Zhongshan Hospital of Fudan University;3150th Central Hospital of PLA;41st Hospital of Nanjing Medical University,China

Objective:To explore the diagnostic values of the key signal molecule Wnt3a expression for hepatocellular carcinoma(HCC).Methods:Circulating Wnt3a levels were determined in a total of 186 patients (80 HCC,53 liver cirrhosis and 53 chronic hepatitis)and 40 controls by ELISA,and were compared with levels of AFP to evaluate their diagnostic and differential diagnostic values for hepatocellular carcinoma.The expression of Wnt3a in 80 HCC and their surrounding tissues was analyzed by IHC for clinicopathological features.Results:The average levels of serum Wnt3a expression were significantly higher(P＜0.001)in the HCC group than those in any other groups of benign liver diseases.Wnt3a expression in HCC patients were closely related(P＜0.05)to liver cirrhosis,HBV infection,poor differentiation,and TNM staging.The sensitivity,specificity,accuracy,positive predictive value and negative predictive values of Wnt3a were 92.5,94.3,93.2,96.1 and 89.3%respectively when Wnt3a of 800 ng/L was used as the cutoff value for diagnosis of HCC.When Wnt3a and AFP were combined,the sensitivity rose to 96.3%,and the area under curve in Wnt3a(0.994)was higher than in AFP(0.710)with the ROC curve.The positive Wnt3a with brown staining particles were mainly distributed in cytosol and membrane ofhepatocytes.Higher Wnt3 expression was seen in 71.3%cancerous and 13.8%surrounding tissues,and associated with poor differentiation,cirrhosis,HBV,and high TNM stage(P＜0.01).Conclusion:As a key molecule in the Wnt signaling pathway,Wnt3a may be used as a specific marker for HCC diagnosis and differential diagnosis.

Hepatocellular carcinoma,Wnt3a；Diagnosis；Signaling pathway

R735.7

A

10.3969/j.issn.1000-2669.2016.05.009

*國家國際科技合作項目(2013DFA32150)；江蘇省六大人才高峰項目(2014-YY-028)

王晗（1992-），男，碩士生。

姚登福，教授，博士生導(dǎo)師。E-mail：yaodf@ahnmc.com