劉登榜，鄧江

(1遵義醫(yī)學(xué)院，遵義563000；遵義醫(yī)學(xué)院第三附屬醫(yī)院)

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TGF-β3在關(guān)節(jié)軟骨組織工程的研究進(jìn)展

劉登榜，鄧江

(1遵義醫(yī)學(xué)院，遵義563000；遵義醫(yī)學(xué)院第三附屬醫(yī)院)

骨關(guān)節(jié)炎目前尚無有效治療方法。轉(zhuǎn)化生長因子-β3(TGF-β3)是轉(zhuǎn)化生長因子超家族蛋白之一，可與生物支架聯(lián)合誘導(dǎo)細(xì)胞成軟骨分化，可誘導(dǎo)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞、軟骨細(xì)胞、脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞、滑膜間充質(zhì)干細(xì)胞等種子細(xì)胞成軟骨分化，可與成纖維細(xì)胞生長因子、胰島素樣生長因子、骨形態(tài)發(fā)生蛋白等其他生長因子聯(lián)合促進(jìn)軟骨細(xì)胞生長，在骨關(guān)節(jié)的軟骨生長和重建中起著關(guān)鍵性的作用。

轉(zhuǎn)化生長因子-β3；關(guān)節(jié)軟骨；骨關(guān)節(jié)炎；成軟骨分化

骨關(guān)節(jié)炎以關(guān)節(jié)軟骨退行性病變?yōu)橹饕R床特點(diǎn)，以往臨床主要采用軟骨下骨鉆孔方法來修復(fù)軟骨[1]，但效果較差。目前自體或異體軟骨、骨膜移植及干細(xì)胞治療是骨關(guān)節(jié)炎的研究熱點(diǎn)。轉(zhuǎn)化生長因子-β3(TGF-β3)是細(xì)胞因子中TGF家族的主要成員之一，可促進(jìn)軟骨細(xì)胞的增殖分化、促進(jìn)細(xì)胞外基質(zhì)形成，抑制IL-1、MMPs 和TNF-α等多種炎性介質(zhì)的活性，降低機(jī)體免疫反應(yīng)，在創(chuàng)傷修復(fù)方面發(fā)揮重要作用，尤其在軟骨的生長和重建中起關(guān)鍵作用[2，3]，在骨關(guān)節(jié)炎關(guān)節(jié)軟骨的修復(fù)中具有廣闊的應(yīng)用前景。以往臨床常使用自體軟骨移植術(shù)修復(fù)損傷軟骨，但取材有限。近年研究發(fā)現(xiàn)，體外增殖誘導(dǎo)干細(xì)胞培養(yǎng)可作為補(bǔ)充軟骨缺損的有效方法[4]。TGF-β3可誘導(dǎo)細(xì)胞成軟骨分化，誘導(dǎo)分化培養(yǎng)差別可能與細(xì)胞種類、種植密度和細(xì)胞代數(shù)等選擇有關(guān)聯(lián)。目前用于體外培養(yǎng)的細(xì)胞很多，主要包括有來源于骨髓、軟骨、脂肪、滑膜、肌肉、胚胎等多能干細(xì)胞。本文就近年來國內(nèi)外對TGF-β3修復(fù)骨關(guān)節(jié)軟骨的研究進(jìn)行綜述。

1　TGF-β3的生物學(xué)結(jié)構(gòu)功能及其分布

TGF-β有3個亞型分別為TGF-β1、TGF-β2、TGF-β3。TGF-β是一類多功能蛋白質(zhì)，可以影響多種細(xì)胞的生長分化、細(xì)胞凋亡及免疫調(diào)節(jié)等功能。TGF-β的3種亞型均是以同型二聚體形式、分子量約75 kDa的前體蛋白組裝合成[5]，在pH降低、酸化、蛋白酶催化等情況下被催化裂解出兩部分。一部分是由二硫鍵連接的二聚體前體肽，又稱作前體相關(guān)蛋白(LAP)；另一部分是從LAP羧基端裂解下來的成熟TGF-β3，分子質(zhì)量大小約24 kDa，由兩個結(jié)構(gòu)相同、分子質(zhì)量約12 kDa的單體通過二硫鍵交聯(lián)組成。裂解前的TGF-β3前體蛋白呈非活性狀態(tài)，與LAP之間由高親和力的非共價鍵連接，LAP起著保持TGF-β非活性狀態(tài)作用，只有兩者分離后，TGF-β3才發(fā)揮生物學(xué)活性。TGF-β3分泌后，形成大的潛在復(fù)合物(LLC)以共價鍵連接并儲存于細(xì)胞外基質(zhì)(ECM)，該復(fù)合物包括潛在TGF-β3結(jié)合蛋白(LTBP)、mTGF-β3前體蛋白、LAP三部分。

TGF-β3被機(jī)體多種細(xì)胞表達(dá)，在胎盤、脂肪組織、胚胎、肝臟、骨及骨髓、腫瘤等中都有其分布，以自分泌和旁分泌的形式分泌至胞外。TGF-β3在胞外作為配體，通過結(jié)合到細(xì)胞膜表面的絲氨酸/蘇氨酸激酶受體介導(dǎo)，再通過胞內(nèi)SMAD信號通路激活轉(zhuǎn)錄因子Smad2/Smad3，激活Smad4并與之結(jié)合成為復(fù)合體，后者移位至細(xì)胞核，調(diào)控下游TGF-β3基因轉(zhuǎn)錄表達(dá)，行使其生物學(xué)功能。

2　TGF-β3在誘導(dǎo)軟骨分化中的作用

2.1TGF-β3與生物支架目前,用于替代向軟骨生長的類軟骨基質(zhì)主要分為非人工合成材料(自體或異體軟骨、脫鈣骨基質(zhì)DBM、膠原蛋白、透明質(zhì)酸、藻酸鹽等)和人工合成材料。自體軟骨無免疫性，但取材少，對軟骨缺損面積較大的修復(fù)較困難。異體軟骨能解決大面積缺損，但免疫反應(yīng)強(qiáng)，修復(fù)效果差。目前人工合成的組織材料逐步發(fā)展成熟，主要是模擬軟骨基質(zhì)成分，通過離心沉淀、冷凍干燥等理化方法構(gòu)建的軟骨組織工程支架，旨在提供體內(nèi)外干細(xì)胞黏附增殖和干細(xì)胞向軟骨分化、再生的微環(huán)境，達(dá)到在生化結(jié)構(gòu)和物理力學(xué)性能方面與正常生長軟骨相近的組織材料，支架材料主要有羥基磷灰石(n-HA)、殼聚糖(cs)、絲素蛋白(SF)、聚乳酸(PLA)等。但是，人工支架材料存在生物組織相容性、機(jī)械力學(xué)、免疫排斥等不足。有學(xué)者[6]分別將TGF-β3和人脫鈣骨基質(zhì)(DBM)植入動物關(guān)節(jié)軟骨缺損模型中，發(fā)現(xiàn)TGF-β3轉(zhuǎn)染后的骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(BMSC)能顯著的增加DBM上的軟骨生成量，同時還大大增加了COL(Ⅱ)，COL(X)和Aggrecan的產(chǎn)生。TGF-β3與上述材料向成軟骨分化，研究從解剖學(xué)證實(shí)較滿意地修復(fù)了軟骨缺損，而在組織學(xué)上與正常的軟骨組織還是有差別，修復(fù)組織呈纖維軟骨改變，最終軟骨細(xì)胞終末分化，修復(fù)效果不佳[7,8]。Pei等[9]從軟骨組織中提取脫細(xì)胞軟骨基質(zhì)(DECM)作為體外細(xì)胞生長所需的立體微環(huán)境，用于干細(xì)胞的增殖分化培養(yǎng)，更近似地向軟骨形成。DECM來源于自身軟骨組織，更接近其軟骨細(xì)胞表型，所含膠原、蛋白聚糖等成分幾乎沒改變，成分量較正常軟骨基質(zhì)稍少。作為干細(xì)胞黏附的載體，可被認(rèn)為是一種具有發(fā)展前景的理想組織支架。單純使用細(xì)胞生長因子、體外生物支架及干細(xì)胞誘導(dǎo)分化來促使軟骨細(xì)胞增殖及表達(dá)，脫離了正常軟骨形成分化的過程，研究還需從類似軟骨形成的自身微環(huán)境出發(fā)。

2.2TGF-β3與種子細(xì)胞臨床早期使用自體軟骨移植術(shù)修復(fù)軟骨，但取材有限。研究發(fā)現(xiàn)，體外增殖誘導(dǎo)培養(yǎng)干細(xì)胞可解決大面積軟骨缺損來源。種子細(xì)胞來源豐富，一定條件下具有成軟骨分化潛能的特性，均能表達(dá)蛋白聚糖及Ⅱ型膠原成分，對軟骨的修復(fù)具有重要作用。然而隨著細(xì)胞的傳代，細(xì)胞向肥大增生及去分化方向發(fā)展，修復(fù)的軟骨呈纖維樣軟骨改變[7,10]?？赡芘c細(xì)胞分化的發(fā)生發(fā)育以及細(xì)胞因子的多因素調(diào)控有關(guān)。誘導(dǎo)干細(xì)胞成軟骨分化的細(xì)胞因子很多。TGF-β3可誘導(dǎo)細(xì)胞成軟骨分化，誘導(dǎo)方法分為外源性誘導(dǎo)和內(nèi)源性誘導(dǎo)。誘導(dǎo)分化培養(yǎng)差別可能與細(xì)胞種類、種植密度和細(xì)胞代數(shù)等選擇有關(guān)聯(lián)。目前用于體外分化培養(yǎng)的細(xì)胞很多，主要包括有來源于骨髓、軟骨、脂肪、滑膜、肌肉、胚胎等多能干細(xì)胞。

2.2.1BMSCBMSC是一類運(yùn)用較廣泛的多潛能干細(xì)胞，取材方便，具有良好的多向誘導(dǎo)分化潛能，不同條件下可分別向成軟骨細(xì)胞、成骨細(xì)胞、成脂肪細(xì)胞分化，是目前研究最多的種子細(xì)胞。但骨髓中BMSC含量極少，不足0.01%[11]。通過體外傳代培養(yǎng)，純化增殖干細(xì)胞。至今尚未發(fā)現(xiàn)BMSC其特異性表面抗原標(biāo)志物[12]，現(xiàn)常見分離純化方法主要包括貼壁篩選法和密度梯度離心篩選法。也有從外周血提取間充質(zhì)干細(xì)胞的報道[13]。胰島素樣生長因子、成纖維細(xì)胞生長因子、TGF-β家族等均具有促進(jìn)骨髓干細(xì)胞成軟骨分化。早期實(shí)驗(yàn)認(rèn)為,TGF-β1在BMSC成軟骨細(xì)胞誘導(dǎo)方面起著重要的作用[14];Barry等[15]研究發(fā)現(xiàn),TGF-β3、TGF-β2較TGF-β1成軟骨誘導(dǎo)作用更佳。使用BMSC成軟骨分化的實(shí)驗(yàn)研究已屢見不鮮，然而針對其培養(yǎng)基、血清濃度及誘導(dǎo)成分目前沒有一個較統(tǒng)一的要求，成軟骨細(xì)胞標(biāo)志物表達(dá)也不相互一致。BMSC成軟骨分化是一個復(fù)雜的過程，很多因素決定其轉(zhuǎn)歸，主要包括高密度細(xì)胞培養(yǎng)和球團(tuán)培養(yǎng)。但是，目前BMSC仍是研究最成熟的種子細(xì)胞。

2.2.2軟骨細(xì)胞軟骨細(xì)胞是最早用于軟骨組織工程的種子細(xì)胞[16],優(yōu)點(diǎn)是來源于人體，無免疫排斥反應(yīng)。但軟骨細(xì)胞的培養(yǎng)較其他干細(xì)胞取材不便，獲取細(xì)胞少,體外培養(yǎng)困難。隨著傳代培養(yǎng)，細(xì)胞易去分化肥大化，表達(dá)Ⅱ型膠原、蛋白聚糖等軟骨標(biāo)志物較少。臨床上采用自體軟骨細(xì)胞移植技術(shù)修復(fù)軟骨，但由于軟骨細(xì)胞獲取困難，需對患者兩次行創(chuàng)傷性手術(shù)及供體部位病變等因素受到限制。有研究表明，共同培養(yǎng)軟骨細(xì)胞和間充質(zhì)干細(xì)胞能夠增強(qiáng)軟骨表型和TGF-β3的敏感性[17]?；谲浌羌?xì)胞的起源提出了軟骨前體干細(xì)胞的假說，研究表明軟骨前體干細(xì)胞能向軟骨表型系譜分化[18]，并持續(xù)到成年期，但需要進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)闡釋。國內(nèi)丁然等[19]證實(shí),TGF-β3較TGF-β1、TGF-β2對于誘導(dǎo)前軟骨干細(xì)胞的增殖和成軟骨分化的正向調(diào)節(jié)作用更為顯著。TGF-β3還可以調(diào)節(jié)TGF-β1與TGF-β2的比例,抑制成纖維細(xì)胞的增生,減緩細(xì)胞纖維化進(jìn)程[20]。

2.2.3脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞脂肪來源間充質(zhì)干細(xì)胞來源于中胚層，可以多向誘導(dǎo)分化，具有易獲得，來源豐富、增殖能力強(qiáng)等優(yōu)點(diǎn),逐漸成為組織工程領(lǐng)域研究熱點(diǎn)。有學(xué)者認(rèn)為，脂肪干細(xì)胞較骨髓來源干細(xì)胞易取材、培養(yǎng)，更接近向軟骨細(xì)胞表型分化[21]。但是也有研究觀點(diǎn)與其相悖[22～24]，認(rèn)為脂肪干細(xì)胞向軟骨細(xì)胞分化的能力弱，分泌軟骨基質(zhì)及Ⅱ型膠原的能力低于BMSC。有學(xué)者發(fā)現(xiàn)，TGF-β3與骨形態(tài)發(fā)生蛋白(BMP)-6聯(lián)合培養(yǎng)更能增加脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞向軟骨細(xì)胞分化的潛能[25,26]。作者認(rèn)為，脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞已屬干細(xì)胞二級分化，多向脂肪分化轉(zhuǎn)歸，較BMSC成軟骨分化的潛能弱。

2.2.4滑膜間充質(zhì)干細(xì)胞有研究證實(shí)，體外培養(yǎng)滑膜間充質(zhì)干細(xì)胞相比BMSC、骨膜細(xì)胞、脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞等有更好的增殖活性和成軟骨能力[27]。更為重要的是，理論上滑膜間充質(zhì)干細(xì)胞來源的軟骨細(xì)胞和關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞具有相似的基因表達(dá)譜。軟骨的形成起于骨干兩端骺軟骨的第二骨化中心，滑膜間充質(zhì)干細(xì)胞分泌的細(xì)胞外基質(zhì)可以推遲軟骨細(xì)胞去分化衰老，并可以增強(qiáng)其向軟骨細(xì)胞再分化能力[28]?；らg充質(zhì)干細(xì)胞與多層軟骨細(xì)胞片共培養(yǎng)后植入兔骨軟骨缺損，研究顯示能夠有效地修復(fù)軟骨[29]。Li等[30]結(jié)合缺氧條件，在含有成纖維生長因子-2作為誘導(dǎo)的組織特異性細(xì)胞外基質(zhì)中培養(yǎng)滑膜間充質(zhì)干細(xì)胞可高效促進(jìn)其增殖，并且可以下調(diào)肥大增生標(biāo)記基因的表達(dá)，在體外三維微環(huán)境下基于干細(xì)胞的軟骨缺損的修復(fù)提供了高質(zhì)量的干細(xì)胞。

3　TGF-β3與其他生長因子

細(xì)胞因子是軟骨發(fā)生發(fā)育中必不可少的成分。除了TGF-β3可調(diào)節(jié)關(guān)節(jié)軟骨的生長發(fā)育，成纖維細(xì)胞生長因子、胰島素樣生長因子，BMP家族等。胰島素樣生長因子是第一個被發(fā)現(xiàn)的可以調(diào)控軟骨形成的多肽，促進(jìn)干細(xì)胞向軟骨細(xì)胞分化，增加軟骨細(xì)胞外基質(zhì)的合成，減慢基質(zhì)降解并抑制軟骨細(xì)胞的凋亡[31]。早期的細(xì)胞成軟骨分化，不是由單個因子所控制的，而是多個細(xì)胞因子共同參與促進(jìn)其向軟骨表達(dá)。有研究表明添加BMP-2能明顯促進(jìn)體外TGF-β3誘導(dǎo)培養(yǎng)滑膜間充質(zhì)干細(xì)胞向軟骨細(xì)胞分化[32]。聯(lián)合轉(zhuǎn)染多種成軟骨分化的生長因子的研究也在一定程度上修復(fù)了軟骨缺損，但最終避免不了軟骨的退化。活化T細(xì)胞核因子(NFAT)被發(fā)現(xiàn)于T細(xì)胞內(nèi)一種與人IL-2啟動子相結(jié)合，依賴Ca2+/鈣調(diào)神經(jīng)磷酸酶(CaN)的核轉(zhuǎn)錄因子,包括NFATc1、NFATc2、NFATc3、 NFATc4及TonEBP共5個亞型[33]。CaN是絲氨酸/蘇氨酸蛋白磷酸酶家族成員。CaN主要表達(dá)于細(xì)胞質(zhì)中,組織分布廣泛，通過使底物NFAT去磷酸化和核內(nèi)轉(zhuǎn)位，調(diào)劑下游基因的轉(zhuǎn)錄和表達(dá)。在免疫細(xì)胞的免疫應(yīng)答中對細(xì)胞因子的基因和其他基因的轉(zhuǎn)錄發(fā)揮重要的作用。非免疫系統(tǒng)通過去磷酸化和核內(nèi)轉(zhuǎn)位發(fā)揮功能調(diào)節(jié)作用。大量研究表明，CaN/NFAT信號通路不僅參與多種免疫系統(tǒng)疾病的發(fā)生發(fā)展，調(diào)控腫瘤發(fā)生過程的基因轉(zhuǎn)錄表達(dá)，介導(dǎo)心肌肥大的病理生理過程，還參與破骨細(xì)胞的分化。最近有研究表明，NFAT在調(diào)控關(guān)節(jié)軟骨合成代謝和分解代謝的平衡和抑制軟骨細(xì)胞過度增生肥大化方面起著關(guān)鍵性的作用[34]。

4　展望

目前，TGF-β3介導(dǎo)基因表達(dá)的機(jī)制已有多種途徑的報道，被大部分學(xué)者接受的是胞內(nèi)SMAD通路上調(diào)其靶向基因表達(dá)，再通過旁分泌和自分泌蛋白修復(fù)關(guān)節(jié)軟骨損傷。而研究NFAT依賴CaN磷酸化后再經(jīng)過核轉(zhuǎn)位和其他蛋白共同調(diào)節(jié)下游靶基因TGF-β3的表達(dá)，促進(jìn)軟骨基質(zhì)合成分泌，同時抑制促軟骨分解的炎性因子對軟骨進(jìn)一步的損害。因此，在SMAD信號通路和NFAT之間可能存在有一定的共同聯(lián)系，有待進(jìn)一步證實(shí)研究。臨床上用于關(guān)節(jié)軟骨損傷修復(fù)的方法均有不同程度的局限性，國內(nèi)外TGF-β3治療軟骨已奠定了一定的基礎(chǔ)，在此基礎(chǔ)上優(yōu)化軟骨組織支架，篩選出組織特異性的種子細(xì)胞，結(jié)合基因工程研究，相信對組織工程修復(fù)軟骨將帶來新的希望。

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貴州省科技計劃(黔科合SY字2013-3047號)。

鄧江(E-mail: DJ30666@126.com)

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2015-12-15)