龍洪清，向　赟，張　振，鄭　義

(1.湖北科技學(xué)院臨床醫(yī)學(xué)院腫瘤學(xué)與核醫(yī)學(xué)教研室，湖北 咸寧 437100；

2.武漢市婦幼兒童健康中心檢驗科；3.南方醫(yī)科大學(xué)附屬廣州花都區(qū)人民醫(yī)院中心實(shí)驗室)

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HPV16E6對Hippo途徑的效應(yīng)分子YAP的影響*

龍洪清1，向赟2，張振2，鄭義3

(1.湖北科技學(xué)院臨床醫(yī)學(xué)院腫瘤學(xué)與核醫(yī)學(xué)教研室，湖北 咸寧 437100；

2.武漢市婦幼兒童健康中心檢驗科；3.南方醫(yī)科大學(xué)附屬廣州花都區(qū)人民醫(yī)院中心實(shí)驗室)

摘要：目的 研究HPV16E6和Hippo途徑的效應(yīng)分子YAP的相關(guān)性。方法 用Western Blot、Real-Time qRT-PCR和激光掃描共聚焦顯微鏡觀察Caski細(xì)胞HPV16E6過表達(dá)或被敲減后YAP的表達(dá)和定位及其直接作用的下游基因結(jié)締組織生長因子(CTGF)的表達(dá)。結(jié)果 Caski細(xì)胞HPV16E6被敲減或過表達(dá)時,YAP相應(yīng)地表達(dá)減少或增加，磷酸化YAP增加或減少，YAP下游分子CTGF的mRNA表達(dá)相對應(yīng)減少或升高。YAP主要定位于胞漿或胞核胞漿中，磷酸化YAP主要定位于胞漿，非磷酸化YAP主要定位于胞核。結(jié)論 HPV16E6誘導(dǎo)Hippo途徑失常，胞核YAP表達(dá)升高，CTGF表達(dá)相應(yīng)增多，提升HPV16E6的致癌性。Hippo途徑可能是治療高危性HPV16感染相關(guān)疾病的候選藥物作用途徑之一。

關(guān)鍵詞：人乳頭瘤病毒；E6蛋白；Hippo信號途徑；YAP

高危型人乳頭瘤病毒(hr-HPV)持續(xù)感染引起多種疾病，如宮頸癌、口咽癌。Ghittoni R等[1]認(rèn)為高危型HPV感染致宮頸癌是一個復(fù)雜的過程，絕大部分高危型HPV感染后能自動消退而不產(chǎn)生任何病變，HPV持續(xù)感染常常導(dǎo)致發(fā)生宮頸內(nèi)鱗狀上皮瘤(CINI-III)，甚至發(fā)展惡化為侵襲性宮頸癌，這一步與宿主細(xì)胞累積染色體受損、癌基因激活和抑癌基因失活有關(guān)。Liu等[2]認(rèn)為宮頸癌細(xì)胞中HPV呈整合狀態(tài)，E6、E7基因表達(dá)的早期癌蛋白在細(xì)胞周期調(diào)控及凋亡調(diào)節(jié)中發(fā)揮重要作用，其持續(xù)表達(dá)是腫瘤細(xì)胞發(fā)生惡性轉(zhuǎn)化和維持惡性特征所必需。Park等[3]認(rèn)為Hippo細(xì)胞信號途徑與細(xì)胞不對稱分裂、腫瘤干細(xì)胞、器官大小的調(diào)控、細(xì)胞接觸抑制、細(xì)胞極性和上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化(EMT)等密切相關(guān)。YAP(Yes-associated protein)是Hippo信號途徑中的下游效應(yīng)分子，是一個重要的人原癌基因。

高危型HPV病毒感染粘膜上皮細(xì)胞后，如何通過Hippo途徑及其效應(yīng)分子發(fā)揮致癌作用，是我們一直關(guān)注的焦點(diǎn)。本實(shí)驗研究試圖探討HPV16E6如何通過Hippo途徑的效應(yīng)分子YAP提升其致癌性，旨在進(jìn)一步明確高危型HPV16病毒感染致癌的發(fā)病機(jī)制，為腫瘤治療提供新靶點(diǎn)尋找依據(jù)。

1材料與方法

1.1質(zhì)粒和siRNAHPV16E6的siRNA：5′-TTATGCATAGTATATAGAGgaagcttgCTCTATATACT

ATG CATAA-3′由上海吉瑪生物科技有限公司合成。質(zhì)粒pCDNA3.1(+)HPV16E6為深圳研究生院分子生物學(xué)實(shí)驗室，經(jīng)測序證明該質(zhì)粒的準(zhǔn)確性。

1.2細(xì)胞培養(yǎng)Caski細(xì)胞(人宮頸癌上皮細(xì)胞，含有完整HPV-16和HPV-18相關(guān)序列，每個細(xì)胞內(nèi)HPV-16大約600個拷貝)購自武漢普諾賽(Procell)生命科技有限公司。用含10%胎牛血清(FBS)、50U/ml青霉素和50μg/ml的鏈霉素的DMEM(Dulbecco's modied Eagle medium)培養(yǎng)。比對腫瘤細(xì)胞C33A細(xì)胞(一種沒有HPV病毒感染的宮頸癌細(xì)胞系)，購自武漢大學(xué)典型物種保存中心。

1.3轉(zhuǎn)染Caski細(xì)胞以細(xì)胞密度為1×105細(xì)胞接種到6孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，待細(xì)胞有80%以上匯合時，轉(zhuǎn)染試劑FuGene6(Roche)加入HPV16E6-siRNA(0.5μg/ml),mock-siRNA(0.5μg/ml)，48h后收集細(xì)胞，用Western Blot和Real-Time qRT-PCR進(jìn)行分析，并用激光掃描共聚焦免疫熒光顯微鏡(Laica公司)觀察YAP蛋白的定位。

C33A細(xì)胞以1×105細(xì)胞接種到6孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，細(xì)胞匯合超過85%時，用轉(zhuǎn)染試劑FuGene6(Roche)和pCDNA3.1(+)HPV16E6(1.5μg/ml)混合(操作按照試劑說明書)轉(zhuǎn)染，轉(zhuǎn)染后48h收獲細(xì)胞，用Western Blot和Real-Time qRT-PCR分析HPV16E6、YAP和CTGF的表達(dá)。

1.4Western Blot分析用細(xì)胞裂解液(深圳研究生院分子生物學(xué)實(shí)驗室配置)于冰上分別裂解轉(zhuǎn)染Caski細(xì)胞和C33A細(xì)胞30min，4℃12000×g離心15min。分別取總蛋白10μg，進(jìn)行Western Blot分析。一抗為鼠抗HPV16E6單克隆抗體(上海研盟生物科技有限公司)(1∶2000)、YAP抗體、抗p-YAP單抗、抗GAPDH單抗，二抗為HRP標(biāo)記的羊抗鼠抗體(1∶500)。

1.5Real-Time qRT-PCR用總RNA提取試劑盒Trizol分別提取Caski細(xì)胞和C33A細(xì)胞總RNA，操作按照試劑說明書進(jìn)行。cDNA合成和PCR擴(kuò)增用RevertAid First Strand cDNA Synthesis Kit試劑盒(MBI Fermentas,St.Leon-Rot,德國)。Real-Time qRT-PCR用DyNAmo Flash SYBR Green qPCR試劑盒(Finnzymes Oy,Espoo,Finland，芬蘭)操作。HPV16E6正向引物序列5′-AATGTTTCAGGACCCTACGG-3′，反向引物5′-TCAGGACACAGTGGCTTTTG-3′；CTGF正向引物5′-CGTGCCGGTGCCCGGACGAG-3′，反向引物5′-GGCCGGGGAGCCGAAGTCAC-3′；β-actin內(nèi)參正向引物5′-GTGGGGCGCCCCAGGCACCA-3′，反向引物5′-CTCCTTAATGTCACGCACGATTTC-3′。用Real-Time qRT-PCR儀檢測SYBR Green熒光值，計算mRNA表達(dá)水平，并與β-actin歸一化。

2結(jié)果

2.1HPV16E6 siRNA對YAP表達(dá)的影響HPV16E6 siRNA轉(zhuǎn)染Caski細(xì)胞后，用Western Blot分析HPV16E6、YAP和p-YAP的表達(dá)。結(jié)果HPV16E6的表達(dá)明顯減少，總YAP的表達(dá)變化不明顯，然而p-YAP顯著增加。見圖1。

質(zhì)粒pCDNA3.1(+) HPV16E6轉(zhuǎn)染C33A細(xì)胞后，結(jié)果HPV16E6蛋白表達(dá)明顯，YAP表達(dá)明顯增加，p-YAP表達(dá)明顯減少，與未轉(zhuǎn)染質(zhì)粒C33A細(xì)胞和轉(zhuǎn)染陰性質(zhì)粒C33A細(xì)胞比較。見圖2。

圖1Si-C為陰性對照，GAPDH為內(nèi)參蛋白。Si-E6為HPV16E6 siRNA轉(zhuǎn)染，E6明顯減少，總YAP變化不明顯，磷酸化YAP明顯增加

圖2Lane 1為未行質(zhì)粒轉(zhuǎn)染，Lane 2和Lane 3為分別轉(zhuǎn)染質(zhì)粒pCDNA3.1(+)(1.5μg/ml)和pCDNA3.1(+)HPV16E6(1.5μg/ml)。GAPDH為內(nèi)參蛋白

2.2HPV16E6 siRNA對YAP蛋白細(xì)胞定位的影響用激光共聚焦熒光顯微鏡觀察Caski細(xì)胞被siRNA敲減HPV16E6后YAP蛋白的定位。Caski細(xì)胞陰性對照中，胞漿和胞核內(nèi)均能見到明顯YAP。當(dāng)HPV16E6被siRNA敲減后，胞核中的YAP明顯減少，胞漿中YAP與陰性對照比較無明顯變化，見圖3(封二)。

2.3HPV16E6 siRNA對YAP直接靶基因CTGF表達(dá)的影響YAP-TAZ的直接靶基因為結(jié)締組織生長因子(Connective tissue growth factor，CTGF)。用HPV16E6siRNA敲減Caski細(xì)胞中E6表達(dá)后，用Real-Time qRT-PCR檢測CTGF的mRNA水平。結(jié)果6孔Caski細(xì)胞HPV16E6siRNA敲減后CTGF的mRNA初始拷貝數(shù)水平為0.25±0.01，未敲除細(xì)胞為1.01±0.07，siRNA敲減后mRNA水平顯著減少(P<0.01)。6孔C33A細(xì)胞轉(zhuǎn)染pCDNA3.1(+)HPV16E6后CTGF的mRNA水平為2.8±0.18，對照細(xì)胞mRNA水平為0.92±0.08，轉(zhuǎn)染HPV16E6后CTGF的mRNA水平顯著增高(P<0.01)。 Caski細(xì)胞與C33A細(xì)胞比較，Caski細(xì)胞CTGF的mRNA水平顯著減少(P<0.01)，見圖4。

圖4用Real-Time qRT-PCR分析Caski細(xì)胞轉(zhuǎn)染HPV16E6siRNA后與C33A細(xì)胞轉(zhuǎn)染pCDNA3.1(+)HPV16E6后，CTGF的mRNA水平變化

3討論

高危型HPV如HPV16、18、31、45等是宮頸癌和其它一些癌癥的主要致病源。高危型HPV病毒感染黏膜上皮細(xì)胞，常常導(dǎo)致細(xì)胞極性的破壞。Martin-BelmonteF等[4]介紹了這些細(xì)胞極性蛋白復(fù)合物與Hippo信號途徑組成的部分反饋環(huán)路。

Hippo信號通路是一個進(jìn)化上高度保守的信號通路，包括YAP,Lasts1/2,Mob,Mst1/2,Sav,Merlin,Ex1/2和Fat4，通過調(diào)節(jié)細(xì)胞增殖、凋亡和干細(xì)胞再生來控制器官大小。此外，Hippo信號通路的調(diào)節(jié)異常將導(dǎo)致癌癥發(fā)生。Pan D等[5]認(rèn)為Hippo通路的核心是一個激酶級聯(lián)反應(yīng)，Mst1/2(果蠅中Hippo的同源物)激酶和Sav1形成復(fù)合物從而磷酸化并激活LATS1/2，LATS1/2激酶磷酸化和抑制轉(zhuǎn)錄共激活因子YAP和TAZ，YAP和TAZ是Hippo通路的兩個主要下游效應(yīng)分子。當(dāng)YAP/TAZ去磷酸化時，它們轉(zhuǎn)運(yùn)至細(xì)胞核內(nèi)，并與TEAD1-4和其他轉(zhuǎn)錄因子相互作用，從而誘導(dǎo)促進(jìn)細(xì)胞增殖和抑制凋亡的基因表達(dá)。趙修民等[6]認(rèn)為YAP是一個致癌基因，許多腫瘤細(xì)胞都高表達(dá)YAP mRNA。YAP以多種形式存在，末端去磷酸化和磷酸化，分別發(fā)揮不同作用。在本實(shí)驗研究中，用HPV16E6 siRNA轉(zhuǎn)染Caski細(xì)胞后，Western Blot檢測結(jié)果顯示Caski細(xì)胞內(nèi)HPV16E6表達(dá)減少，YAP表達(dá)略有減少，但磷酸化YAP增加。說明E6表達(dá)減少后，通過調(diào)節(jié)Hippo通路，減少YAP表達(dá)、增加磷酸化YAP表達(dá)，達(dá)到抑制腫瘤細(xì)胞的作用。用質(zhì)粒pCDNA3.1(+)HPV16E6轉(zhuǎn)染C33A細(xì)胞后，檢測結(jié)果顯示HPV16E6蛋白表達(dá)明顯時，YAP表達(dá)明顯增加，p-YAP表達(dá)明顯減少。說明E6表達(dá)增加后，通過調(diào)節(jié)Hippo通路，增加YAP表達(dá)、減少磷酸化YAP，達(dá)到促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的作用。說明磷酸化YAP抑制腫瘤，去磷酸化YAP促進(jìn)腫瘤。本實(shí)驗研究結(jié)果進(jìn)一步證明Pan D[5]和趙修民[6]的觀點(diǎn)。同時，進(jìn)一步說明HPV16E6蛋白與Hippo信號通路以及其下游效應(yīng)分子YAP具有密切關(guān)聯(lián)性。

趙修民等[6]認(rèn)為YAP基因是Hippo通路的核心，Mob,Mst1/2,Sav,Merlin,Ex1/，Lasts1/2等轉(zhuǎn)錄因子位于YAP上游，為腫瘤抑制因子，通過磷酸化和促進(jìn)細(xì)胞質(zhì)/細(xì)胞核轉(zhuǎn)位對YAP起負(fù)性調(diào)節(jié)作用。Lasts1/2與YAP直接相互作用，能有效抑制YAP。本實(shí)驗用激光共聚焦免疫熒光顯微鏡觀察，發(fā)現(xiàn)陰性對照中，Caski細(xì)胞胞漿和胞核內(nèi)均能見到明顯YAP，胞核中含量更高。表明HPV16E6表達(dá)不減少或表達(dá)較多時，通過調(diào)節(jié)Hippo信號途徑，使胞核中高含量YAP以促進(jìn)腫瘤細(xì)胞。觀察Caski細(xì)胞被siRNA敲減沉默HPV16E6后，胞核中YAP明顯減少，胞漿中存在明顯YAP。表明HPV16E6被siRNA敲減沉默后，E6表達(dá)減少，通過調(diào)節(jié)Hippo信號途徑，使胞核中YAP明顯減少，胞漿中YAP明顯具有一定含量，達(dá)到共同抑制腫瘤細(xì)胞的作用。結(jié)合HPV16E6 siRNA轉(zhuǎn)染Caski細(xì)胞后YAP表達(dá)略有減少、但磷酸化YAP增加，可推知Caski細(xì)胞被siRNA敲減沉默 HPV16E6后，胞漿中存在明顯YAP即為磷酸化YAP，胞核中為去磷酸化YAP。進(jìn)一步推知核內(nèi)去磷酸化YAP具有促發(fā)腫瘤的作用，胞漿中磷酸化YAP具有抑制腫瘤作用。更說明HPV16E6蛋白與Hippo信號通路的下游效應(yīng)分子YAP具有密切關(guān)聯(lián)性。依據(jù)Pan D等[5]和趙修民等[6]的觀點(diǎn)以及本實(shí)驗研究結(jié)果，推測HPV16E6蛋白可能通過Hippo信號通路作用于Lasts1/2，使其表達(dá)下降，負(fù)性調(diào)節(jié)YAP使其增加表達(dá)，高表達(dá)YAP促進(jìn)上皮細(xì)胞發(fā)生腫瘤轉(zhuǎn)化。

結(jié)締組織生長因子(CTGF)為YAP/TAZ的直接靶基因。左錢飛等[7]認(rèn)為YAP/TAZ是Hippo信號通路下游的主要效應(yīng)分子，廣泛分布于各種組織器官之中。YAP/TAZ與TEAD家族轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合，上調(diào)眾多生長因子的表達(dá)，如CCN家族分泌性蛋白結(jié)締組織生長因子(CTGF)，它是轉(zhuǎn)錄共激活子TAZ和轉(zhuǎn)錄因子TEAD的下游直接靶基因。CTGF具有促細(xì)胞增殖、遷移及分化等作用。本實(shí)驗用HPV16E6 siRNA敲減Caski細(xì)胞中E6的表達(dá)后，Caski細(xì)胞CTGF的mRNA水平顯著減少(P<0.01)。說明Caski細(xì)胞中E6的表達(dá)減少后，通過Hippo途徑使YAP表達(dá)減少，YAP/TAZ與TEAD結(jié)合量減少，下調(diào)CTGF的mRNA，下調(diào)CTGF表達(dá)水平，減弱Caski腫瘤細(xì)胞增殖活性。用能表達(dá)HPV16E6的質(zhì)粒轉(zhuǎn)染C33A細(xì)胞后，結(jié)果C33A細(xì)胞CTGF的mRNA水平表達(dá)顯著增高(P<0.01)。說明C33A細(xì)胞中E6表達(dá)增加后，通過Hippo途徑讓YAP表達(dá)增加，YAP/TAZ與TEAD結(jié)合增加，上調(diào)CTGF，增強(qiáng)C33A腫瘤細(xì)胞增殖活性。

總之，本實(shí)驗結(jié)果進(jìn)一步表明HPV16E6通過作用于Hippo信號途徑，調(diào)節(jié)下游分子YAP讓其表達(dá)增加，并作用于YAP/TAZ的直接靶基因結(jié)締組織生長因子(CTGF)，上調(diào)CTGF，增強(qiáng)腫瘤細(xì)胞增殖活性。這可能是HPV16E6通過Hippo途徑作用于YAP誘導(dǎo)腫瘤的機(jī)制之一。

HPV16E6如何調(diào)節(jié)Hippo信號通路的上游分子和中游分子來影響下游效應(yīng)分子YAP，還需要進(jìn)一步深入研究。高危型HPV病毒感染粘膜上皮細(xì)胞，如何導(dǎo)致上皮細(xì)胞極性改變與破壞，極性蛋白復(fù)合物如何影響調(diào)節(jié)Hippo信號通路分子，都需要進(jìn)一步深入研究。

參考文獻(xiàn)：

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[6]趙修民，王德林.YAP基因表達(dá)與腫瘤的關(guān)系[J].廣東醫(yī)學(xué)，2011，32(12):1628

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The Effect of HPV16E6 Protein on Effector Molecule YAP of the Hippo Pathway

LONG Hong-qing,XIANG Yun,ZHANG Zhen,et al

(DepartmentofOncologyandNuclearMedicine,ClinicalMedicineCollege,HubeiUniversityofScienceandTechnology,XianningHubei437100,China)

ABSTRACT：Objective To explore the correlation between the effect of HPV16E6 and the molecular YAP of Hippo pathway. Methods The expression and localization of YAP and its downstream connective tissue growth factor (CTGF) were analyzed by using Western blot,Real-Time qRT-PCR or laser scanning confocal microscope after HPV16E6 overexpression or knockdown in the Caski cell.Results When HPV16E6 was knocked down or over expressed, the corresponding expression of YAP or phosphorylation of YAP decreased or increased. The mRNA expression of CTGF, a YAP downstream molecule, aslo decreased or increased correspondly. The phosphorylation of YAP was mainly localized in the cytoplasm, and the non phosphorylated YAP was mainly localized in the nucleus.Conclusion HPV16E6 induces Hippo pathway deregulation,YAP overexpression and CTGF mRNA expression. HPV16E6 induced disorders of Hippo pathway and increased nuclear YAP expression,which enhanced CTGF expression and promoted the carcinogenicity of HPV16E6.They might promote HPV16E6 pathogenesis,implying that Hippo pathway might be candidate drug target of hr-HPV infection-induced diseases.Hippo pathway may be one of the candidate pathway for the drug treatment of high risk HPV16 infection related diseases

KEY WORDS：Human papillomavirus (HPV);E6 protein;Hippo signal pathway;Yes-associated protein(YAP)

(收稿日期：2015-10-27)

DOI:10.16751/j.cnki.2095-4646.2016.01.0001

中圖分類號：R730.2

文獻(xiàn)標(biāo)識碼：A

文章編號：2095-4646(2016)01-0001-04

*基金項目：湖北省衛(wèi)生廳科研一般項目(JX6B97)