郭晉霞，何云鳳，范　開

(1.重慶理工大學(xué) 藥學(xué)與生物工程學(xué)院，重慶　400054;

2.重慶富進(jìn)生物醫(yī)藥有限公司，重慶　400050)

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熒光定量PCR法檢測重組畢赤酵母工程菌的外源基因拷貝數(shù)

郭晉霞1，何云鳳1，范開2

(1.重慶理工大學(xué) 藥學(xué)與生物工程學(xué)院，重慶400054;

2.重慶富進(jìn)生物醫(yī)藥有限公司，重慶400050)

摘要：提出了重組畢赤酵母工程菌pPICZ-DT30/GS115基因組中外源基因DT30拷貝數(shù)的實(shí)時(shí)熒光定量PCR方法。該重組工程菌用來表達(dá)人胰島素前體(PI-DT30)，其表達(dá)量的高低、菌種穩(wěn)定性對(duì)工藝研究及整體項(xiàng)目成本等有重大影響。外源基因拷貝數(shù)是檢測表達(dá)量的一個(gè)重要指標(biāo)。該方法中，利用畢赤酵母的看家基因GAP(Glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase)為內(nèi)參，分別建立含GAP基因和DT30基因的雙標(biāo)準(zhǔn)曲線。將工程菌基因組進(jìn)行熒光定量PCR，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線和Ct值計(jì)算目的基因DT30在重組畢赤酵母工程菌中的拷貝數(shù)，結(jié)果為7個(gè)。

關(guān)鍵詞：熒光定量PCR; 表達(dá); 胰島素前體; 基因拷貝數(shù)

糖尿病是一種嚴(yán)重危害人類健康的代謝性疾病。根據(jù)國際糖尿病聯(lián)盟(International Diabetes Federation)數(shù)據(jù)，預(yù)計(jì)到2030年全世界糖尿病患者人數(shù)將接近5億[1]。重組人胰島素類似物是目前治療糖尿病的首選藥物之一，具有廣闊的市場前景。重組人胰島素在生產(chǎn)過程中通常有兩種工藝，其中利用酵母為表達(dá)體系，先得到重組人胰島素原再生產(chǎn)胰島素成品的占70 %左右的市場份額[2]。本研究中檢測的重組酵母工程菌pPICZ-DT30/GS115即可用于重組人胰島素原(PI-DT30)的生產(chǎn)。

畢赤酵母表達(dá)系統(tǒng)是目前廣受歡迎的外源蛋白表達(dá)系統(tǒng)之一。外源基因在畢赤酵母中通常會(huì)以同源重組的方式整合到宿主菌基因組上，且可插入多個(gè)拷貝。而高拷貝的外源基因通常會(huì)導(dǎo)致其在畢赤酵母中的高表達(dá)量[3]。在研究重組工程菌表達(dá)量的工作中，對(duì)于外源基因拷貝數(shù)的監(jiān)測可以起到指示作用。另外，在菌種傳代過程中，拷貝數(shù)是否降低也可以表征菌種是否有質(zhì)粒丟失。

Wesblum等[4]根據(jù)瓊脂糖電泳過程中不同DNA其遷移速度不同的原理和放射性標(biāo)記來測定拷貝數(shù)。Projan等[5]用熒光標(biāo)記DNA，從而擴(kuò)大了這一方法的應(yīng)用范圍。Genthner[6]用HPLC-HPHT(羥基磷灰石柱)法測定E.coli HB101中的pBR322拷貝數(shù)為29，與冷泉港實(shí)驗(yàn)室報(bào)道的30個(gè)相差不大。還有報(bào)道用毛細(xì)管電泳法[7]、間接測定酶活法[8]等方法檢測質(zhì)?？截悢?shù)。目前運(yùn)用最多的方法為Southern blot 法[9]，該方法的優(yōu)點(diǎn)是準(zhǔn)確性高，但是需要大量的DNA，操作要求高，且容易產(chǎn)生假陽性結(jié)果。實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù) (real-time fluores-cence quantitative PCR，RTFQ PCR)是1996年由美國Applied Biosystems公司推出的一種新定量試驗(yàn)技術(shù)[10]，具有快速、靈敏、特異性強(qiáng)、高通量等優(yōu)點(diǎn)，已在DNA和RNA的定量檢測方面有較多應(yīng)用[11-13]。

本研究利用畢赤酵母中的看家基因GAP(Glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase)為內(nèi)參，采用雙標(biāo)準(zhǔn)曲線方法，提出了一種對(duì)pPICZ-DT30/GS115 工程菌中DT30拷貝數(shù)的快速、準(zhǔn)確的SYBR Green熒光定量PCR檢測方法。

1材料與方法

1.1主要試劑及儀器

GoTaq qPCR MasterMix(SYBR Green)，購自promega公司；Realplex實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀，購自德國Eppendorf公司；大腸桿菌質(zhì)粒小量快速抽提試劑盒、酵母基因組提取試劑盒，均購自美國Omega公司；微量核酸定量儀，購自Gene Company Limited。

1.2菌種及質(zhì)粒

pPICZ-DT30/GS115 工程菌、pPICZ-DT30/Top10菌由重慶富進(jìn)生物醫(yī)藥有限公司提供；大腸桿菌Top10、畢赤酵母GS115均購自Invitrogen公司； pMD19-T Simple載體體系購自TaKaRa公司。

1.3培養(yǎng)基

LB液體培養(yǎng)基：1% Trptone，0.5% Yeast Extraction，1% NaCl；藍(lán)白斑篩選培養(yǎng)基：1% Trptone，0.5% Yeast Extraction，0.5% NaCl，100 mg/mL Amp,40 μg/mL X-gal，24 μg/ mL IPTG，1.5% Agar；YPD培養(yǎng)基：1% Yeast Extraction,2% Polypetone，2% Dexotrose。

1.4引物設(shè)計(jì)

根據(jù)NCBI數(shù)據(jù)庫公布的畢赤酵母GAP基因序列(U62648)設(shè)計(jì)GAP引物(GAP-1，GAP-2)，根據(jù)待測目的基因DT30序列設(shè)計(jì)DT30擴(kuò)增引物(DT30-1，DT30-2)，結(jié)果見表1。

表1　DT30和GAP引物序列

1.5標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒構(gòu)建

接種GS115，抽提GS115基因組；接種pPICZ-DT30/Top10，抽提pPICZ-DT30質(zhì)粒。以GS115基因組為模板， GAP -1和GAP-2為引物，PCR擴(kuò)增GAP基因；以pPICZ-DT30質(zhì)粒為模板，DT30-1和DT30-2為引物，擴(kuò)增DT30目的基因片段?；厥誈AP和DT30片段，在16 ℃下分別與載體PMD19-T vector連接過夜，連接液轉(zhuǎn)化大腸桿菌Top10，涂布藍(lán)白斑篩選平板，37℃培養(yǎng)過夜。挑選白色單菌落接種LA液體培養(yǎng)基培養(yǎng)，37 ℃培養(yǎng)過夜。抽提質(zhì)粒，對(duì)抽提得到的重組質(zhì)粒進(jìn)行PCR鑒定，分別將鑒定正確的陽性克隆送大連寶生物公司測序，將測序正確的質(zhì)粒分別命名為T-GAP和T-DT30，作為實(shí)時(shí)定量PCR的標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒。

用微量核酸定量儀測定標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒濃度(ng/μL)。根據(jù)以下公式計(jì)算GAP和DT30的拷貝數(shù)：

copies/u=(6.02×1023) × (ng/μL×10-9)/ (DNA length×660)

1.6待測樣品處理

接種pPICZ-DT30/GS115 工程菌于YPD液體培養(yǎng)基中，30 ℃培養(yǎng)過夜。第2天抽提基因組，并用微量核酸定量儀測定其濃度(ng/μL)及純度。

1.7實(shí)時(shí)定量PCR體系及反應(yīng)程序

在前期的實(shí)驗(yàn)過程中完成了對(duì)PCR反應(yīng)體系的優(yōu)化。PCR反應(yīng)體系和時(shí)間程序如表2、3所示。

表2　實(shí)時(shí)定量PCR反應(yīng)體系

表3　實(shí)時(shí)定量PCR時(shí)間程序

注：其中第2步到第4步重復(fù)40個(gè)循環(huán)。

1.8標(biāo)準(zhǔn)曲線建立

將已計(jì)算拷貝數(shù)的標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒T-GAP和T-DT30分別梯度稀釋至108,107,106,105,104,103copies/μL，分別以GAP-1和GAP-2、DT30-1和DT30-2為引物進(jìn)行熒光定量PCR。每個(gè)梯度重復(fù)測定3次，以驗(yàn)證標(biāo)準(zhǔn)曲線的重復(fù)性。以Realplex PCR儀軟件給出的Ct值作為縱坐標(biāo)、以起始模板拷貝數(shù)作為橫坐標(biāo)建立標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.9DT30拷貝數(shù)測定

取抽提的pPICZ-DT30/GS115基因組樣品，將其依次進(jìn)行10倍稀釋，得到原液、10-1、10-2、10-3四個(gè)梯度。同樣分別以GAP-1和GAP-2、DT30-1和DT30-2為引物進(jìn)行熒光定量PCR。每個(gè)梯度重復(fù)測定3次。

GAP基因在畢赤酵母中以單拷貝的形式存在[14]，因此用GAP基因的拷貝數(shù)可以表征模板中基因組的起始拷貝數(shù)。DT30基因的拷貝數(shù)與GAP基因的拷貝數(shù)的比值即為DT30基因在畢赤酵母基因組中的起始拷貝數(shù)。

2結(jié)果與分析

2.1標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒構(gòu)建

經(jīng)PCR鑒定結(jié)果和測序結(jié)果表明，已成功構(gòu)建了T-GAP和T-DT30質(zhì)粒。微量核酸定量儀測定T-GAP濃度為276.1 ng/μL(OD260/OD280=1.91)，T-DT30濃度為198.1 ng/μL(OD260/OD280=1.93)，計(jì)算得T-GAP和T-DT30的拷貝數(shù)分別為1.14×1011copies/μL,0.821×1011copies/μL。

2.2標(biāo)準(zhǔn)曲線建立

T-GAP和T-DT30的擴(kuò)增曲線及標(biāo)準(zhǔn)曲線如圖1,2所示。由實(shí)驗(yàn)結(jié)果可知：曲線光滑平穩(wěn)，有明顯的指數(shù)增長期，擴(kuò)增效率較高，符合定量檢測要求。T-GAP的標(biāo)準(zhǔn)方程為y=-3.468x+35.30(R2=0.994)，T-DT30的標(biāo)準(zhǔn)方程為y=-3.711x+37.66(R2=0.998)，根據(jù)兩條曲線的斜率可以算出兩標(biāo)準(zhǔn)曲線的擴(kuò)增效率，分別為0.90和0.94，比較接近。另外，從表4中可以看出，標(biāo)準(zhǔn)曲線Ct值的標(biāo)準(zhǔn)偏差在0.02～0.16之間，變異系數(shù)在0.07%～1.4%之間，說明建立的標(biāo)準(zhǔn)曲線精密度及重復(fù)性良好。

熔解曲線如圖3所示，為T-GAP和T-DT30 108～103copies/μL共6個(gè)梯度的實(shí)時(shí)定量PCR熔解曲線，可以看出：所有濃度下均可檢測到明顯的特異峰值，且無非特異性擴(kuò)增的雜峰及引物二聚體的低矮小峰出現(xiàn)，證明引物特異性好。

2.3重組酵母工程菌中DT30拷貝數(shù)檢測

重組酵母工程菌pPICZ-DT30/GS115中DT30拷貝數(shù)檢測結(jié)果見表5和6。基因組樣品稀釋為4個(gè)梯度，熒光定量PCR得到的Ct值重復(fù)性良好，標(biāo)準(zhǔn)偏差都在0.12以下，且變異系數(shù)低于0.68%。由擴(kuò)增曲線及熔解曲線(圖4、5)可知擴(kuò)增效率好。測定的拷貝數(shù)數(shù)值在6.16～8.36之間，為消除系統(tǒng)誤差取平均值，則重組酵母工程菌pPICZ-DT30/GS115中DT30拷貝數(shù)為7。

圖1　標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒的擴(kuò)增曲線

圖2　標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒的標(biāo)準(zhǔn)曲線

圖3　標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒的熔解曲線

標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)?？截悢?shù)(copies/μL)Ct值第1次第2次第3次Ct平均值T-GAPT-DT30T-GAPT-DT30T-GAPT-DT30T-GAPT-DT30標(biāo)準(zhǔn)偏差(SD)T-GAPT-DT30變異系數(shù)(CV%)T-GAPT-DT301088.528.728.588.818.498.798.538.770.050.120.451.4010710.3011.3510.2811.1810.4411.0510.3411.190.050.060.340.5110613.7814.7913.7914.8513.7714.7813.7814.810.030.060.150.3910517.8918.9717.8718.8517.8918.7617.8818.860.030.020.120.1210421.6023.0221.6523.1121.6222.9921.6223.040.090.020.310.0710325.2426.9325.3126.7725.0926.8025.2126.830.160.050.520.17

圖4　待測基因組樣品的擴(kuò)增曲線

DNA量Ct值1次2次3次GAP基因DT30基因GAP基因DT30基因GAP基因DT30基因標(biāo)準(zhǔn)偏差(SD)GAP基因DT30基因變異系數(shù)(CV%)GAP基因DT30基因原液11.028.3510.988.4310.968.420.030.040.280.5210-114.1612.1114.0512.0414.1712.070.070.040.470.2910-217.6515.6917.7915.7417.5515.730.120.030.680.1710-322.2320.2322.2720.3022.2220.260.030.040.120.17

表6　實(shí)時(shí)熒光定量PCR法檢測 pPICZ-DT30/GS115中DT30拷貝數(shù)結(jié)果

3討論

本研究利用GAP和DT30雙標(biāo)準(zhǔn)曲線提出了一種檢測重組酵母工程菌pPICZ-DT30/GS115中DT30拷貝數(shù)的實(shí)時(shí)熒光定量PCR法。這種方法只需要盡量保證待測基因和內(nèi)參基因的PCR擴(kuò)增效率相近即可。本研究前期對(duì)該方法的穩(wěn)定性、精密度進(jìn)行了大量的研究實(shí)驗(yàn)，為本研究奠定了堅(jiān)實(shí)的基礎(chǔ)。GAP、DT30標(biāo)準(zhǔn)曲線檢測范圍為108～103copies/uL，相關(guān)系數(shù)好，Ct值標(biāo)準(zhǔn)偏差低于0.2，變異系數(shù)低于1.4%。有文獻(xiàn)報(bào)道[15]，一般單個(gè)樣品的擴(kuò)增反應(yīng)的Ct值標(biāo)準(zhǔn)偏差低于0.3可認(rèn)為可精確測定樣品的拷貝數(shù)，說明建立的標(biāo)準(zhǔn)曲線精密度及重復(fù)性良好。

目前關(guān)于QPCR法檢測酵母基因工程菌質(zhì)?？截悢?shù)的報(bào)道很少。SYBR Green熒光定量PCR法快速、經(jīng)濟(jì)、方便、準(zhǔn)確度高，且可高通量篩選，引物設(shè)計(jì)合理，較少出現(xiàn)假陽性。GAP 基因?yàn)楫叧嘟湍缚醇一?，故此方法同樣適用于其他畢赤酵母菌株如X33、SMD1163等外源基因拷貝數(shù)的檢測。經(jīng)后續(xù)實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證，該方法還可應(yīng)用在菌種保藏、發(fā)酵過程、傳代過程中監(jiān)測拷貝數(shù)的變化方面，對(duì)菌種穩(wěn)定性的考察有重要意義。

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(責(zé)任編輯何杰玲)

Detection of Restructuring of Transgenic Copy Number of Pichia Engineering Bacteria with Fluorescence Quantitative PCR Method

GUO Jin-xia1, HE Yun-feng1, FAN Kai2

(College of Pharmacy and Bidogical Engineering, Chongqing University of Technology,Chongqing 400054, China; 2.Chongqing Fujin Biological Pharmacentical Co.,Ltd.,Chongqing 400050, China)

Abstract:A method for the reconstruction of the copy number of foreign gene DT30 in genome of the recombinant engineered yeast pPICZ-DT30/GS115 by real-time fluorescent quantitative PCR was developed. The yeast was used to express human insulin precursor(PI-DT30), and its expression and stability have largely impact on both the process research and the overall cost. The copy number of foreign gene is always an important indicator in detecting expression quantity. In this study, GAP gene, the housekeeping gene in Pichia pastoris, was used as a reference, and the double standard curves of GAP gene and DT30 gene were generated respectively. Then the genome of pPICZ-DT30/GS115 was analyzed by real-time fluorescent quantitative PCR, and the copy number of DT30 was calculated with the standard curves and Ct value. The results have seven.

Key words：fluorescent quantitative PCR; expression; pro-insulin; copy number

文章編號(hào)：1674-8425(2016)02-0077-07

中圖分類號(hào)：Q39

文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A

doi:10.3969/j.issn.1674-8425(z).2016.02.014

作者簡介：郭晉霞(1989—)，女，山西人，碩士，主要從事基因工程藥物研究。

收稿日期：2015-10-22

引用格式：郭晉霞，何云鳳，范開.熒光定量PCR法檢測重組畢赤酵母工程菌的外源基因拷貝數(shù)[J].重慶理工大學(xué)學(xué)報(bào)(自然科學(xué)版)，2016(2):77-83.

Citation format：GUO Jin-xia, HE Yun-feng, FAN Kai.Detection of Restructuring of Transgenic Copy Number of Pichia Engineering Bacteria with Fluorescence Quantitative PCR Method[J].Journal of Chongqing University of Technology(Natural Science)，2016(2):77-83.