余志 淡春鵬 聶寧 姚燕妮（華中農(nóng)業(yè)大學園藝林學學院/園藝植物生物學教育部重點實驗室，武漢 430070）

?

檀香“紅茶”多糖提取工藝優(yōu)化與抗氧化活性初探

余志 淡春鵬 聶寧 姚燕妮
（華中農(nóng)業(yè)大學園藝林學學院/園藝植物生物學教育部重點實驗室，武漢 430070）

[摘 要]本實驗以檀香“紅茶”為原料，通過正交實驗優(yōu)化了檀香紅茶茶多糖的提取工藝，提出了一種檀香茶多糖的提取方式；研究了物料比、提取時間、提取溫度、提取方式對檀香茶多糖提取的影響。測定檀香茶多糖的中性糖的含量、蛋白質(zhì)含量、糖醛酸含量、抗氧化活性。結果表明：檀香“紅茶”具有良好的抗氧化活性。

[關鍵詞]檀香；多糖；提取工藝；抗氧化活性

檀香樹，又名檀香，屬檀香目檀香科檀香屬，半寄生性常綠喬木，枝圓柱狀，帶灰褐色，小枝細長，淡綠色，節(jié)間稍腫大。檀香葉四季常青，具有開發(fā)成飲品的潛在價值。檀香已在廣東、廣西等地大面積種植，但檀香人工林經(jīng)營周期較長，傳統(tǒng)經(jīng)營方式產(chǎn)生的大量檀香葉卻被遺棄，如果能加以應用可產(chǎn)生可觀的經(jīng)濟效益。目前對檀香的研究多集中在芯材方面。近年來，檀香葉的開發(fā)利用逐步開始引起人們關注，有研究者采用熱解-氣相色譜/質(zhì)譜技術研究發(fā)現(xiàn)檀香葉抽提物中富含生物活性成分，可作為名貴生物醫(yī)藥和香料的來源[1,2]。印尼、澳大利亞等國家的一些科學家也正實驗利用檀香葉生產(chǎn)保健食品或飲料，國內(nèi)也開始把檀香葉制成具有一定功效的保健茶產(chǎn)品，秦明芳等研究發(fā)現(xiàn)檀香茶葉的水提醇沉液具有強心作用及一定的抗疲勞作用[3-6]。本課題組自2012年開始與廣東云浮縣檀香種植園合作，進行檀香葉資源開發(fā)，并開發(fā)出系列檀香茶產(chǎn)品。在研究過程中，檀香茶多糖作為一類重要的內(nèi)含成分，有必要進行深入研究。

本試驗選用本課題組在廣東云浮縣仁仁生物科技有限公司檀香林基地采摘的檀香茶葉加工而成的檀香紅茶作為實驗原料。采用乙醇沉淀法沉淀分離茶多糖，設立正交實驗，比較不不同提取條件檀香紅茶和檀香青茶茶多糖中多蛋白質(zhì)、糖醛酸含量、中性糖含量等物理指標的高低，以及清除DPPH自由基和O2-自由基能力的抗氧化活性的差異。優(yōu)化檀香茶提取工藝，對其抗氧化活性進行初步研究。

1 實驗方法

1.1 正交實驗設計

設計四因素三水平表：選擇提取時間、提取溫度、提取方式、料液比、提取時間為實驗因素。采用正交實驗設計，將得到的不同處理下的粗多糖分別測定其理化指標與活性，對比優(yōu)化出檀香紅茶和青茶的工藝條件。

表1 正交試驗設計表〔L9(34)〕

1.2 檀香茶多糖的提取

多糖的提取方法有很多種，本實驗選擇醇沉淀法提取檀香茶多糖。正交實驗的四個因素：提取時間、提取溫度、提取方式、料液比。對應的三水平：（1）提取時間：1h、1.5h、2h；（2）提取溫度：40℃、55℃、70℃；（3）提取方式：常規(guī)水浴提取、轉(zhuǎn)子提取、超聲波提??；（4）料液比：1:20、1:30、1:40。實驗過程：稱取50g檀香茶粉，用2000ml的超純水在55℃水浴鍋中攪拌浸提2h。用紗布過濾，去除茶渣，得到茶湯。將茶湯用天平配平后放入離心機4000r/min離心10min，取其上清液。得到上清液后放入旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀中濃縮，轉(zhuǎn)速為4000r/min，溫度為55℃。當濃縮后液體到原來體積的五分之一，加入體積比為濃縮液:乙醇=1:3的95%乙醇進行沉淀1h。去除上清液，將沉淀進行離心，轉(zhuǎn)速4000r/min，時間10min。離心完成后將沉淀分裝至小燒杯中，放入-4℃的冰箱中冷凍，最后在冷凍干燥機干燥得到粗多糖。

1.3 測定方法

茶多酚含量采用國標法測定（GB/T 8313-2008）。中性糖含量采用硫酸－蒽酮比色法測定[7]。蛋白質(zhì)含量采用考馬斯亮藍G-250法測定[7]。糖醛酸含量采用硫酸－咔唑法測定[7]。

多糖清除·OH自由基能力測定采用D-脫氧核糖-鐵體系法[8]。TPS清除O2-·自由基能力測定采用黃嘌呤氧化酶法，用南京建成試劑盒測定，多糖溶液濃度為1mg/ml。

1.4 數(shù)據(jù)處理方法

利用SPSS軟件對實驗數(shù)據(jù)進行方差分析，默認為0.05，當P值小于0.05時，說明各個因子間存在顯著性差異，當P值小于0.01時，說明各個因子間存在極顯著性差異。分析結果各表中的數(shù)據(jù)為3次重復的平均值。

2 結果與分析

2.1 檀香紅茶茶多糖理化活性成分分析

對檀香紅茶茶多糖提取條件的處理獲得的多糖中理化活性成分進行了分析，結果見表2。處理1、處理9的條件下中性糖含量最低，處理2、處理4、處理5測得的中性糖含量較高；處理5、處理6、處理7蛋白質(zhì)含量較高，其它處理組測定的蛋白質(zhì)含量較小，但差異不顯著；處理2、處理4、處理6條件下測定的糖醛酸含量較高，處理5、處理7條件下糖醛酸含量較低。多糖抗氧化活性的測定結果從表3可以得知，多糖的DPPH自由基清除率基本上都在85%以上，說明清除效率較高。處理5、處理8、處理9較其它組相對較低；多糖的總SOD活力的測定結果相差較大，處理1、處理3處理5和處理7的總SOD的活力偏低，處理4、處理6、處理9的總SOD活力較高。

表2 檀香紅茶正交試驗樣的主要理化指標及抗氧化活性

表3 檀香紅茶正交試驗樣的主要理化活性成分方差分析

表4 檀香紅茶正交試驗樣的主要理化活性成分方差分析的多重比較

2.2 檀香紅茶茶多糖提取條件對中性糖的影響

從表3可知，料液比、提取時間、提取溫度和提取方式都對中性糖含量呈極顯著的影響。從表4可知，從料液比來看，中性糖的含量呈先上升后下降的趨勢。在料液比達到1:30的時候達到最高，在料液比達到1:40的時候中性糖的含量基本上不會增加或者增加很少，說明溶劑水對中性糖含量的影響不是很大，且三種料液比之間存在極顯著差異。從提取方式來看，轉(zhuǎn)子提取的方式中性糖含量最高，且三種提取方式之間存在極顯著差異。從提取時間來看，檀香紅茶中性糖的含量呈現(xiàn)遞增的趨勢，但增加的趨勢不是很大。提取時間1.5h與提取時間2h之間不存在極顯著差異，但存在顯著性差異，說明提取時間1.5h到提取時間2h中性糖的提取量增加的不是很明顯。從提取溫度來看，中性糖的含量呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢，且提取溫度之間在40℃與55℃之間存在極顯著差異。提取溫度在55℃到70℃不存在極顯著差異，但存在顯著性差異。因此對中性糖含量而言，檀香紅茶茶多糖提取的最佳條件為A2B2C2D2。即料液比1:30、轉(zhuǎn)子方式提取、提取時間2h、提取溫度55℃，有利于檀香紅茶茶多糖中中性糖的提取。

2.3 檀香紅茶茶多糖提取條件對蛋白質(zhì)的影響

從表3可知，料液比為1:20到1:30，蛋白質(zhì)提取量呈現(xiàn)增加的趨勢，且二者之間存在極顯著差異。液料比1:30到1:40，蛋白質(zhì)的量基本上維持穩(wěn)定，且二者之間不存在顯著性差異，對檀香紅茶茶多糖中蛋白質(zhì)的含量無顯著性影響。提取方式對蛋白質(zhì)含量存在顯著性差異。從表4可知，常規(guī)水浴、轉(zhuǎn)子提取及超聲波提取這三種方式之間存在極顯著差異，超聲波提取對茶葉中茶多糖含量有增加作用。從提取時間來看，檀香紅茶茶多糖中蛋白質(zhì)含量在提取時間1h和提取時間1.5h之間存無顯著性差異，在提取時間2h存在極顯著性差異。從提取溫度來看，提取溫度為55℃，蛋白質(zhì)含量最高。

因此，對蛋白質(zhì)含量而言，檀香紅茶茶多糖提取的最佳條件為A1B3C3D2，即料液比1:30、提取時間2h、提取方式超聲波、提取溫度55℃。

2.4 檀香紅茶茶多糖提取條件對糖醛酸的影響

從表3可知，料液比和提取溫度對糖醛酸的含量沒有極顯著差異，存在顯著性差異。提取方式對糖醛酸的含量無明顯差異。提取時間對糖醛酸的含量有極顯著性差異。從表4可知，料液比1:20和1:30存在顯著性差異，料液比從1:20到1:40呈先上升后遞減的趨勢，存在顯著差異。分析這種現(xiàn)象的原因可能因為糖醛酸在劇烈的長時間的水解條件下，很容易發(fā)生脫羧反應，在茶多糖提取去雜過程中損失了。提取溫度在40℃ 至提取溫度為70℃糖醛酸含量呈現(xiàn)遞增趨勢，且提取溫度為40℃和55℃無顯著性差異，提取溫度為55℃和70℃之間無顯著性差異。料液比為1:30，提取溫度為55℃或者70℃。因此，對糖醛酸含量而言，檀香紅茶茶多糖的最佳條件為：A2B2C1D3或A2B2C1D2，即料液比為1:30、提取溫度為55℃或者70℃、轉(zhuǎn)子提取方式、提取時間1h。

2.5 檀香紅茶茶多糖提取條件對多糖抗氧化活性的影響

由表3可知，料液比、提取時間、提取溫度對DPPH清除自由基清除率具有極顯著的影響，提取方式對DPPH清除自由基清除率沒有顯著性影響。由表4可知料液比及提取時間對DPPH清除自由基清除率呈遞減趨勢。提取時間1h及1.5h對DDPH清除自由基清除率無顯著性影響。提取溫度對DDPH清除自由基清除率呈先上升后下降的趨勢。因此，對于DPPH清除自由基清除率而言。檀香紅茶茶多糖提取的最佳條件為A1C1D2,即料液比為1:20、提取時間為1h、提取溫度為55℃。

由表3、表4可知，料液比對總SOD活力無顯著性差異。轉(zhuǎn)子提取和超聲波提取之間沒用明顯差異，與常規(guī)水浴提取之間存在極顯著差異。從提取時間來看，提取時間1h與1.5h之間存在極顯著差異，提取時間1h與2h之間存在顯著性差異，不存在極顯著差異，且在提取時間為1.5h測定的茶多糖總SOD活力較高，提取時間1h到1.5h茶多糖的總SOD活力呈現(xiàn)遞增趨勢。提取時間1.5h到2h，呈現(xiàn)遞減趨勢。對于提取溫度而言，提取溫度之間存在極顯著差異，且提取溫度在40℃到55℃之間茶多糖總SOD活力存在增加趨勢，提取溫度在55℃到70℃呈現(xiàn)遞減趨勢。因此，對于茶多糖總SOD活力而言，檀香紅茶茶多糖的最佳提取工藝組合為B1C2D2或者B2C2D2,即提取條件為：常規(guī)或者轉(zhuǎn)子提取、提取溫度為55℃、提取時間為1.5h。

3 結論

本實驗優(yōu)化檀香紅茶提取工藝，參考的主要指標為蛋白質(zhì)含量、中性糖含量、糖醛酸含量及兩個抗氧化活性指標，實驗結果表明提取條件對檀香茶多糖組成成分以及抗氧化活性都有一定的影響。通過正交試驗研究優(yōu)化出檀香紅茶茶多糖的最佳提取工藝為提取液料比為1:30、轉(zhuǎn)子的提取方式、提取時間為1.5h、提取溫度為55℃為較優(yōu)提取工藝參數(shù)。

檀香屬于常青樹種，其葉片生長量大，且在廣東已有一定栽培面積。從資源利用角度看，檀香除傳統(tǒng)用材樹種之外，大量枝葉資源的開發(fā)利用是一種有效方式。除借鑒茶葉加工技術加工成檀香茶這一常規(guī)途徑之外，深入研究檀香葉片的功能成分能夠為其開發(fā)利用奠定良好的基礎。本實驗優(yōu)化出的多糖提取工藝，以及粗多糖的抗氧化活性，旨在為檀香資源合理利用開發(fā)提供借鑒。

參考文獻

[1]黃娟娟,楊艷,林奕云等.檀香葉提取物抗氧化及抗菌活性初步研究[J].食品工業(yè)科技,2012,09:123-126.

[2]楊艷,賀麗蘋,高向陽.檀香葉中的γ-氨基丁酸的HPLC測定研究[J].林產(chǎn)化學與工業(yè),2013,02:134-138.

[3]秦明芳,謝金鮮,周紅海等.檀香茶葉水提醇沉液對心血管的作用及抗疲勞的實驗研究[J].基因組學與應用生物學,2010,29(5):962-968.

[4]顏仁梁,林勵.檀香的研究進展[J].中藥新藥與臨床理,2003,14(3):218-220.

[5]閆沖,林勵,劉紅菊等.檀香葉黃酮類化學成分研究[J].中國中藥志,2011,36(22):3130-3133.

[6]張寧南,王衛(wèi)文,徐大平等.印度檀香葉苯/醇抽提物生物活性成分的Py-GC/MS分析[J].中南林業(yè)科技大學學報,2009,29(4):70-73.

[7]鐘蘿主編.茶葉品質(zhì)理化分析[M].上海:上海科學技術出版社,1989,268-260.

[8]Bitter T,Muir HM.A modified uronic acid carbazole reaction[J].Anal Biochem,1962,(4):330-334.