儲(chǔ)小飛 趙舒怡 崔明 路璐 張俊玲 孟慶慧 樊賽軍

300192天津，中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院放射醫(yī)學(xué)研究所，天津市放射醫(yī)學(xué)與分子核醫(yī)學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室（儲(chǔ)小飛、趙舒怡、崔明、路璐、張俊玲、樊賽軍）；20097 Washington DC, Department of Oncology,Lombardi Comprehensive Cancer Center,Georgetown University（孟慶慧）

吲哚-3-甲醇酸性代謝產(chǎn)物輻射防護(hù)作用的研究

儲(chǔ)小飛 趙舒怡 崔明 路璐 張俊玲 孟慶慧 樊賽軍

300192天津，中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院放射醫(yī)學(xué)研究所，天津市放射醫(yī)學(xué)與分子核醫(yī)學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室（儲(chǔ)小飛、趙舒怡、崔明、路璐、張俊玲、樊賽軍）；20097 Washington DC, Department of Oncology,Lombardi Comprehensive Cancer Center,Georgetown University（孟慶慧）

目的探討吲哚-3-甲醇（I3C）酸性代謝產(chǎn)物的輻射損傷防護(hù)作用。方法采用細(xì)胞克隆形成實(shí)驗(yàn)檢測細(xì)胞的存活分?jǐn)?shù)；采用Western Blot方法檢測蛋白表達(dá)水平。結(jié)果采用正常纖維上皮細(xì)胞184A1，發(fā)現(xiàn)7種I3C酸性代謝產(chǎn)物表現(xiàn)出不同的輻射損傷防護(hù)效果，其中CTET（1 μmol/L）、LTET（1 μmol/L）、HI-IM（1 μmol/L）和3，3'-二吲哚甲烷（DIM）（0.3 μmol/L）4種代謝產(chǎn)物在細(xì)胞γ-射線照射前24 h預(yù)處理細(xì)胞均不同程度地提高了輻照細(xì)胞的存活分?jǐn)?shù)，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05，P＜0.01），而CT（1 μmol/L）、LTr-1（1 μmol/L）和ICZ（1 μmol/L）3種代謝產(chǎn)物則對(duì)輻照細(xì)胞存活分?jǐn)?shù)無影響（P＞0.05）。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)CTET、LTET、HI-IM和DIM可導(dǎo)致ATM、BRCA1和NBS1蛋白磷酸化水平的改變。同樣，CT、LTr-1和ICZ對(duì)這些蛋白的磷酸化水平不產(chǎn)生影響。另外，HI-IM可明顯降低輻射損傷誘導(dǎo)的細(xì)胞壞死和細(xì)胞凋亡。結(jié)論CTET、LTET、HI-IM和DIM 4種I3C酸性代謝產(chǎn)物可明顯降低184A1細(xì)胞的輻射敏感性，即具有輻射防護(hù)作用，其機(jī)制可能與其調(diào)節(jié)DNA損傷與修復(fù)蛋白磷酸化和細(xì)胞凋亡有關(guān)。

吲哚-3-甲醇酸性代謝產(chǎn)物；輻射損傷；DNA損傷修復(fù)；細(xì)胞凋亡

Fund program:Research Institute of Technology Development and Research Projects of Special Funds from the Ministry of Science and Technology of China(2014EG150134);National Natural Science Foundation of China (81172127,81572969);Key Technology Research and Development Program of Tianjin(14ZCZDSY00001); Development Fund of Institute of Radiation Medicine,Chinese Academy of Medical Sciences(1559,1549)

0 引言

據(jù)世界衛(wèi)生組織統(tǒng)計(jì)，目前惡性腫瘤的治愈率在45%左右，其中通過手術(shù)途徑治愈者占22%，放射治療（簡稱放療）占18%，化學(xué)藥物治療（簡稱化療）占5%。在惡性腫瘤治療過程中，70%~80%的患者在不同程度上均需接受放療，一部分腫瘤通過放療達(dá)到治愈目的，而相當(dāng)一部分患者通過放療減輕癥狀，延長生存期。因此，放療是惡性腫瘤治療中不可缺少的治療手段之一。

然而，在采用放療治療惡性腫瘤的同時(shí)，由于電離輻射的非特異性以及目前照射技術(shù)和條件的限制，高能量電離輻射照射也導(dǎo)致了腫瘤相關(guān)和周邊、乃至全身正常組織和器官的急性輻射損傷。例如，在進(jìn)行腫瘤根治性放療時(shí)，對(duì)腫瘤區(qū)域給以根治大劑量的照射，由于照射范圍較大，照射劑量也高，周邊和全身正常組織的損傷也就越大。因此，雖然放療是一種非常有效的治療手段，但治療同時(shí)對(duì)正常組織和細(xì)胞的急性輻射損傷所引起的不良反應(yīng)也大大限制了放療在惡性腫瘤治療中的廣泛應(yīng)用。為了減輕腫瘤放療中電離輻射對(duì)正常組織及人體的危害，研究輻射損傷的防治手段，特別是積極尋找有效的輻射防護(hù)藥物，提高腫瘤放療療效，降低正常組織和細(xì)胞的輻射損傷是腫瘤放療研究中迫切需要解決的問題和熱門研究課題之一[1-2]。腫瘤放療的輻射防護(hù)藥物是指腫瘤患者受到放療照射前或照射后早期能防護(hù)或減輕電離輻射照射所帶來的組織和細(xì)胞損傷的化合物（或藥物）的總稱。針對(duì)性的輻射防護(hù)藥物應(yīng)用是防護(hù)電離輻射造成急性輻射損傷的最有效和直接的手段之一。筆者所在課題組的研究工作發(fā)現(xiàn)，吲哚-3-甲醇（indole-3-carbinol,I3C）的一種酸性代謝產(chǎn)物3，3'-二吲哚甲烷（3,3'-diindolylmethane，DIM）表現(xiàn)出非常好的輻射損傷防護(hù)效果[3]。本研究旨在探討I3C的其他酸性代謝產(chǎn)物是否具有同樣的輻射損傷防護(hù)作用。

1 材料與方法

1.1 主要材料與儀器

人正常纖維上皮184A1細(xì)胞（美國Georgetown大學(xué)組織細(xì)胞服務(wù)中心），辣根過氧化物酶（HRP）偶聯(lián)的羊抗兔IgG和HRP偶聯(lián)的羊抗鼠IgG（武漢三鷹生物科技有限公司），BCA蛋白定量試劑盒（北京康為生物科技有限公司），細(xì)胞裂解液、十二烷基硫酸鈉（sodium dodecyl sulfate,SDS）加樣緩沖液、封閉液、TBST（Tris緩沖鹽溶液+吐溫20）（中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院放射醫(yī)學(xué)研究所自制）。CTET、LTET、HI-IM、DIM、CT、LTr-1和ICZ共7種酸性代謝產(chǎn)物均由美國Georgetown大學(xué)化學(xué)合成并提供，所有化合物均溶解于二甲基亞砜中，并存于-20℃，使用前用培養(yǎng)液稀釋。FACScan流式細(xì)胞儀（美國BD公司），細(xì)胞輻射照射采用USD Autocell40137Cs γ射線輻射源（加拿大原子能有限公司）產(chǎn)生的射線（250 cGy/min）輻照完成。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng)

人正常纖維上皮184A1細(xì)胞系單層貼壁生長，采用含體積分?jǐn)?shù)為10%血清、105U/L青霉素、質(zhì)量濃度為100 mg/L鏈霉素的DMEM培養(yǎng)基，于5%CO2、37℃培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)。

1.2.2 克隆形成實(shí)驗(yàn)

實(shí)驗(yàn)組人正常纖維上皮184A1細(xì)胞在照射前24 h分別用7種I3C代謝產(chǎn)物預(yù)處理（除DIM采用0.3μmol/L濃度處理外，其他代謝產(chǎn)物均采用1μmol/L濃度處理），同時(shí)設(shè)對(duì)照組（不進(jìn)行預(yù)處理）。細(xì)胞接受不同劑量（0、2、4、6、8、10 Gy）的γ-射線照射，按不同的照射劑量接種不同數(shù)量的細(xì)胞到60 mm培養(yǎng)皿中。細(xì)胞連續(xù)培養(yǎng)3周后用甲醇固定，加姬姆薩應(yīng)用液染色30 min，流水洗凈，計(jì)數(shù)細(xì)胞數(shù)≥50的克隆個(gè)數(shù)。按以下公式計(jì)算克隆形成率和存活分?jǐn)?shù)

1.2.3 Western Blot法

收集上述受到照射的實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞與未受到照射的對(duì)照組細(xì)胞，離心，懸浮于裂解液中，并置冰上裂解細(xì)胞2 h，10 000 r/min離心10 min，取上清液。采用BCA蛋白定量試劑盒測定蛋白濃度，調(diào)整蛋白至相同濃度。向樣品中加入等體積2×SDS加樣緩沖液，沸水煮沸5 min，經(jīng)SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳（PAGE）后轉(zhuǎn)膜；封閉液封閉2 h；加一抗（用封閉液稀釋），4℃孵育過夜；TBST洗3次，每次15 min；加相應(yīng)的二抗（封閉液稀釋），室溫孵育1 h，TBST洗3次，每次15 min；用ECL發(fā)光法檢測蛋白表達(dá)。

1.2.4 膜聯(lián)蛋白V-異硫氰酸熒光素/碘化丙啶流式檢測法

實(shí)驗(yàn)共設(shè)4組：空白對(duì)照組（不做任何處理），單獨(dú)γ-射線照組（僅進(jìn)行γ-射線照射），單獨(dú)HI-IM處理組（僅采用HI-IM處理）和γ-射線照射+HI-IM組（既進(jìn)行γ-射線照射，又采用HI-IM處理）。將收集的細(xì)胞（0.5～1）×106個(gè)用磷酸鹽緩沖液（phosphate buffered saline,PBS）洗2次，加入100 μl固定緩沖液和10 μl異硫氰酸熒光素標(biāo)記的膜聯(lián)蛋白V（Annexin V-FITC）（20 μg/ml），室溫避光30 min；再加入5 μl碘化丙啶（propidium iodide，PI）（50 μg/ml），避光反應(yīng)5 min后，加入400 μl固定緩沖液，立即用流式細(xì)胞術(shù)定量檢測，同時(shí)以不加Annexin VFITC及PI的一管作為陰性對(duì)照。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用Graphpad Prism 5.0軟件作圖并進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，所有實(shí)驗(yàn)至少重復(fù)3次，數(shù)據(jù)以均值±標(biāo)準(zhǔn)差（x±s）表示。多組間比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用t檢驗(yàn)，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 I3C代謝產(chǎn)物對(duì)輻照細(xì)胞存活分?jǐn)?shù)的影響

如圖1所示，在I3C的7種代謝產(chǎn)物中，CTET、LTET、HI-IM和DIM均不同程度地提高了受照184A1細(xì)胞的存活分?jǐn)?shù)，即具有輻射損傷防護(hù)作用。其中，與對(duì)照組細(xì)胞的IC90（導(dǎo)致90%細(xì)胞存活分?jǐn)?shù)抑制的照射劑量）（2.8 Gy）相比，CTET（5.4 Gy）（t=2.43，P＜0.05）、LTET（5.8 Gy）（t=3.53，P＜0.05）、HI-IM（7.4 Gy）（t=2.95，P＜0.01）以及DIM（7.6 Gy）（t=2.81，P＜0.01）處理組的IC90均明顯提高。根據(jù)獲得的IC90值，可知這4種代謝產(chǎn)物的輻射防護(hù)療效為DIM＞HI-IM＞LTET＞CTET。但是，其余3種代謝產(chǎn)物CT、LTr-1和ICZ則對(duì)受照184A1細(xì)胞的存活分?jǐn)?shù)不產(chǎn)生影響（P＞0.05）。上述結(jié)果表明并非所有的I3C代謝產(chǎn)物均具有輻射損傷防護(hù)作用。

2.2 I3C代謝產(chǎn)物對(duì)DNA損傷與修復(fù)蛋白磷酸化水平的影響

采用Western Blot檢測了I3C的7種代謝產(chǎn)物對(duì)3種已知的DNA損傷與修復(fù)蛋白（ATM、BRCA1和NBS1）磷酸化水平的影響。結(jié)果如圖2所示，CTET、LTET、HI-IM和DIM 4種I3C代謝產(chǎn)物不同程度地誘導(dǎo)了ATM（Ser1981）、BRCA1（Ser1387）和NBS1（Ser343）蛋白磷酸化水平的升高，但對(duì)ATM、BRCA1和NBS1總蛋白水平無影響；對(duì)細(xì)胞存活分?jǐn)?shù)不產(chǎn)生影響的其余3種代謝產(chǎn)物CT、LTr-1和ICZ對(duì)上述3種蛋白的表達(dá)及磷酸化水平均無明顯影響。

圖2 吲哚-3-甲醇代謝產(chǎn)物對(duì)DNA損傷與修復(fù)相關(guān)蛋白及其磷酸化的影響

圖17 種吲哚-3-甲醇酸性代謝產(chǎn)物與人正常纖維上皮184A1細(xì)胞放射敏感性的相關(guān)性

圖3HI-IM對(duì)輻照誘導(dǎo)的細(xì)胞壞死和細(xì)胞凋亡的影響

2.3 HI-IM對(duì)輻照誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的影響

Annexin V-FITC/PI流式檢測結(jié)果發(fā)現(xiàn)受到6 Gy γ-射線照射后24 h的184A1細(xì)胞明顯出現(xiàn)細(xì)胞凋亡和細(xì)胞死亡。與空白對(duì)照組細(xì)胞相比，照射誘導(dǎo)的早期細(xì)胞凋亡從3.24%增加到26.49%（t=2.93，P＜0.01），晚期細(xì)胞凋亡從1.97%增加到14.5%（t=3.21，P＜0.01），而壞死細(xì)胞從0.18%增加到8.53%（t=3.11,P＜0.01）。1 μmol/L HI-IM單獨(dú)處理24 h并未誘導(dǎo)任何細(xì)胞壞死和凋亡，表明1 μmol/L HI-IM并無毒性。但是，與單獨(dú)γ-射線照射組細(xì)胞相比，γ-射線照射+HI-IM組無論是早期細(xì)胞凋亡、晚期細(xì)胞凋亡還是壞死細(xì)胞均明顯減少，即早期細(xì)胞凋亡下降到10.02%（t=2.77，P＜0.01），晚期細(xì)胞凋亡下降到2.92%（t=3.36，P＜0.01），壞死細(xì)胞下降到0.52%（t=3.05，P＜0.01）。上述結(jié)果清楚地表明HI-IM預(yù)處理可明顯降低輻射損傷所導(dǎo)致的細(xì)胞凋亡和細(xì)胞壞死。（圖3）

3 討論與結(jié)論

I3C廣泛存在于富含芥子油苷的十字花科菜中，人們?nèi)粘Ｊ秤玫脑S多蔬菜，包括白菜、水田芥菜、菜花、辣根、卷心菜、蘿卜、大白菜、花椰菜以及甘藍(lán)等均屬于十字花科菜?，F(xiàn)已知道運(yùn)輸、冷凍、切碎和烹調(diào)等食物加工處理以及咀嚼過程會(huì)使十字花科菜中的細(xì)胞受到破壞，導(dǎo)致葡萄糖異硫氰酸鹽經(jīng)黑芥子硫苷酸酶水解后生成I3C及異硫氰酸鹽[4]。I3C在胃內(nèi)酸性環(huán)境中極不穩(wěn)定，發(fā)生縮合反應(yīng)而形成DIM及其他一系列多聚體，包括ICZ和LTr-1等[5]。而DIM和LTr-1是I3C進(jìn)入體內(nèi)血清中的主要代謝產(chǎn)物，肝臟中I3C的各種代謝產(chǎn)物中DIM占24%，LTr-1占20%。其他微量代謝物如ICZ的濃度非常低[6]。I3C的生物學(xué)效應(yīng)主要?dú)w因于其代謝產(chǎn)物作用，其中DIM的作用尤為重要。

有文獻(xiàn)報(bào)道，I3C及其代謝產(chǎn)物可能影響電離輻射所導(dǎo)致的輻射損傷，因?yàn)椋孩俅髣┝侩婋x輻射照射導(dǎo)致免疫功能下降，而I3C可提升免疫功能[7-8]。②I3C具有非常好的抗氧化作用，已證實(shí)I3C能降低氧化劑過氧化氫對(duì)細(xì)胞的損傷作用[9]。③I3C可誘導(dǎo)DNA損傷和修復(fù)密切相關(guān)的蛋白ATM、BRCA1、BRCA2的表達(dá)及其磷酸化等[9-11]。這些間接研究結(jié)果均提示抗氧化劑I3C及其代謝產(chǎn)物有可能對(duì)電離輻射損傷產(chǎn)生一定影響。筆者的前期研究表明DIM具有良好的輻射損傷防護(hù)作用，且發(fā)現(xiàn)0.3 μmol/L的濃度則表現(xiàn)出最佳防護(hù)效果[3]。本研究進(jìn)一步證實(shí)除DIM以外，CTET、LTET和HI-IM 3種I3C代謝產(chǎn)物均表現(xiàn)出輻射防護(hù)作用（圖1）。顯然，I3C及其部分代謝產(chǎn)物確實(shí)可作為輻射損傷防護(hù)后選藥進(jìn)行更深入的研究。

已知電離輻射造成損傷信號(hào)之一是輻射引起細(xì)胞內(nèi)DNA雙鏈斷裂而導(dǎo)致ATM和ATR基因的表達(dá)產(chǎn)物ATM-ATR蛋白磷酸化激活，同時(shí)ATM和ATR表達(dá)上調(diào)，然后將DNA損傷信號(hào)傳遞給BRCA1；而BRCA1直接參與DNA的損傷修復(fù)或通過不同的基因調(diào)節(jié)而參與調(diào)控電離輻射導(dǎo)致的細(xì)胞周期阻滯和細(xì)胞凋亡，從而控制細(xì)胞的生長和死亡。ATM和BRCA1是調(diào)控DNA損傷反應(yīng)的關(guān)鍵基因，理論和實(shí)驗(yàn)均已證實(shí)了直接激活A(yù)TM蛋白激酶活性能增加ATM蛋白激酶對(duì)DNA損傷反應(yīng)的調(diào)控作用，從而可以獲得輻射抗性，降低受照細(xì)胞對(duì)輻射的敏感性。筆者的前期研究工作表明，DIM可直接激活BRCA1蛋白表達(dá)，激活BRCA1蛋白磷酸化也可獲得輻射抗性，降低受照細(xì)胞對(duì)輻射的敏感性，這些結(jié)果表明BRCA1磷酸化在DNA損傷修復(fù)調(diào)節(jié)中通常被激活，從而在BRCA1參與DNA損傷修復(fù)的生物功能中起著重要作用。本研究檢測了I3C的7種代謝產(chǎn)物對(duì)ATM（Ser1981）、BRCA1（Ser1387）和NBS1（Ser343）蛋白磷酸化水平的影響，并證實(shí)其中具有輻射防護(hù)作用的3種I3C代謝產(chǎn)物CTET、LTET和HI-IM與DIM一樣均可導(dǎo)致ATM（Ser1981）、BRCA1（Ser1387）和NBS1（Ser343）蛋白磷酸化水平不同程度地提高。表明DIM、CTET、LTET和HI-IM所產(chǎn)生的放射損傷防護(hù)作用可能與它們調(diào)節(jié)DNA損傷與修復(fù)ATM-BRCA1-NBS1蛋白磷酸化有關(guān)。

本研究結(jié)果表明，包括CTET、LTET、HI-IM與DIM在內(nèi)的部分I3C代謝產(chǎn)物均表現(xiàn)出了非常有效的輻射損傷防護(hù)作用，且其輻射防護(hù)作用與這些代謝產(chǎn)物激活DNA損傷與修復(fù)ATM-BRCA1-NBS1信號(hào)通路以及抑制輻射誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡有著密切的關(guān)系。

利益沖突無

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Study on radioprotection of indole-3-carbinol acid condensation products

Chu Xiaofei,Zhao Shuyi,Cui Ming, Lu Lu,Zhang Junling,Meng Qinghui,Fan Saijun
Institute of Radiation Medicine,Chinese Academy of Medical Sciences&Peking Union Medical College,Tianjin Key Laboratory of Radiation Medicine and Molecular Nuclear Medicine,Tianjin 300192,China(Chu XF,Zhao SY,Cui M,Lu L,Zhang JL,Fan SJ);Department of Oncology,Lombardi Comprehensive Cancer Center,Georgetown University,Washington DC 20097,USA(Meng QH)

ObjectiveTo study the radioprotective effect of indole-3-carbinol(I3C)acid condensation products.MethodsCell colony formation assay was used to determine cell survival rate,and Western Blot assay was employed to measure protein expression.ResultsSeven kinds of the I3C acid condensation products showed different radioprotective effect on normal fibrous epithelial cells 184A1,among which 24 h pre-treatment of CTET (1 μmol/L),LTET(1 μmol/L),HI-IM(1 μmol/L)and 3,3'-diindoly methane(DIM)(0.3 μmol/L)showed significant increase of cell survival rate following irradiation with γ-ray,and the difficence was statistically significant(P＜0.05, P＜0.01).However,CT(1 μmol/L),LTr-1(1 μmol/L)and ICZ(1 μmol/L)showed no effect on cell survival rate caused by radiation(P＞0.05).Furthermore,CTET,LTET,HI-IM and DIM activated the phosphorylation of ATM,BRCA1 and NBS1 proteins.HI-IM significantly decreased radiation-caused cell death and apoptosis.ConclusionsCTET, LTET,HI-IM,and DIM can significantly reduce the radiosensitivity in 184A1 cells,and the mechanism may be related to the regulation of DNA damage and the repair of protein phosphorylation.

Indole-3-carbinol acid condensation products;Radiation injuries;DNA damage and repair; Apoptosis

樊賽軍，Email：fansaijun@irm-cams.ac.cn

10.3760/cma.j.issn.1673-4181.2016.03.004

科技部科研院所技術(shù)開發(fā)研究專項(xiàng)（2014EG150134）；國家自然科學(xué)基金（81172127，81572969）；天津科技支撐項(xiàng)目（14ZCZDSY00001）；中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院放射醫(yī)學(xué)研究所發(fā)展基金（1559，1549）Corresponding author:Fan Saijun,Email:fansaijun@irm-cams.ac.cn

2016-04-30）