張宏遒 曾小偉 梅林

100084北京，清華大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院（張宏遒）；518055深圳，清華大學(xué)深圳研究生院（張宏遒、曾小偉、梅林）

載磁性氧化鐵CA-PLGA納米顆粒對宮頸癌細(xì)胞的影響

張宏遒 曾小偉 梅林

100084北京，清華大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院（張宏遒）；518055深圳，清華大學(xué)深圳研究生院（張宏遒、曾小偉、梅林）

目的研究納米四氧化三鐵（Fe3O4）顆粒包裹不同外殼材料對宮頸癌細(xì)胞HeLa毒性的影響。方法通過無溶劑熱分解法制備磁性納米Fe3O4顆粒并分別使用聚乳酸-羥基乙酸共聚物（PLGA）和膽酸（CA）修飾的PLGA（CA-PLGA）星型共聚物包裹，對其進(jìn)行驗證表征后，使用激光共聚焦顯微鏡觀察HeLa細(xì)胞對納米顆粒的攝取，并用噻唑藍(lán)（MTT）法測定上述兩種材料包裹的納米Fe3O4顆粒對HeLa細(xì)胞的毒性作用。結(jié)果制備的單個納米Fe3O4顆粒粒徑約7 nm，載Fe3O4的PLGA和CA-PLGA納米顆粒均呈球狀，粒徑約200 nm，理論載藥量為10%。當(dāng)Fe3O4納米顆粒的質(zhì)量濃度相同（25 μg/ml）時，載Fe3O4的CA-PLGA納米顆粒對HeLa細(xì)胞的毒性小于對應(yīng)的PLGA納米顆粒。結(jié)論CA-PLGA星型共聚物可降低磁性納米Fe3O4顆粒的細(xì)胞毒性，在生物體內(nèi)具有廣闊的應(yīng)用前景。

星型共聚物；氧化鐵；納米顆粒；細(xì)胞毒性

Fund program:General Program of National Natural Science Foundation of China(31270019);Guangdong Natural Science Funds for Distinguished Young Scholar(2014A030306036);Science and Technology Planning Project of Guangdong Province(2016A020217001);Science,Technology＆Innovation Commission of Shenzhen Municipality(JCYJ20150430163009479,JCYJ20150529164918738)

0 引言

近年來，納米材料的研究得到了科學(xué)界的廣泛關(guān)注。所謂納米材料，是指由粒徑在1~100 nm的納米顆粒所組成的材料。因其粒徑不同于普通材料，故會表現(xiàn)出許多特殊的優(yōu)越性質(zhì)，從而被廣泛用于各個領(lǐng)域[1]。納米氧化鐵顆粒就是一種非常典型的生物學(xué)材料，該材料生物毒性小，顆粒粒徑易被控制。其中，納米四氧化三鐵（Fe3O4）顆粒除具有上述特性外，還具有磁性特性，因而被廣泛應(yīng)用于工業(yè)領(lǐng)域。近年來，隨著磁共振技術(shù)（magnetic resonance imaging,MRI）的逐漸普及，磁性納米Fe3O4顆粒在生物學(xué)領(lǐng)域的重要價值也逐漸被發(fā)掘。由于磁性納米Fe3O4顆粒比表面積大，所以很容易聚合而影響效果，因此筆者使用高生物相容性大分子來包裹納米Fe3O4顆粒。聚乳酸-羥基乙酸共聚物（poly（laticco-glycolic acid）,PLGA）是非常流行的一種生物相容性好、體內(nèi)穩(wěn)定性高的大分子材料。Zeng等[2]對PLGA進(jìn)行了膽酸（cholic acid,CA）修飾，形成了CA-PLGA星型共聚物，且后者的細(xì)胞攝取效率更高。因此筆者嘗試使用CA-PLGA對納米Fe3O4材料進(jìn)行包裹，對其表征并檢測其細(xì)胞攝取效果。在細(xì)胞攝取方面，細(xì)胞毒性是必須要考慮的問題，也是決定材料是否具有廣泛應(yīng)用前景的重要方面[3]。筆者擬采用噻唑藍(lán)（thiazolyl blue tetrazolium bromide, MTT）法測定載Fe3O4的CA-PLGA納米顆粒對宮頸癌細(xì)胞HeLa的毒性。

1 材料與方法

1.1 主要材料與儀器

乙酰丙酮鐵、90%油酸（美國Sigma-Aldrich公司），曲拉通X-100（Triton X-100）（美國Amresco公司），70%油胺、PLGA、四氫呋喃（中國藥物總公司），再生纖維素透析袋（截留相對分子質(zhì)量為5 000 u）（美國光譜醫(yī)學(xué)公司），宮頸癌HeLa細(xì)胞系（美國ATCC）。

Nicolet 6700傅里葉紅外光譜儀（美國Thermo Fisher公司），ACF300核磁共振分析儀（德國Bruker公司），Waters2414凝膠滲透色譜儀（美國Waters Milford公司），Q500熱重分析儀（美國TA公司），μSpeed-S10激光多普勒測速儀（德國Elovis公司），ZS90納米激光粒度儀（英國馬爾文公司），Tecnai G2 F20透射電子顯微鏡（荷蘭FEI公司），F(xiàn)V1200激光共聚焦顯微鏡（日本奧林巴斯公司）

1.2 方法

1.2.1 納米Fe3O4顆粒的合成和表征

納米Fe3O4顆粒的合成方法如文獻(xiàn)[4]所示，具體步驟為：將700 mg的乙酰丙酮鐵與10 ml油酸及10 ml油胺混合形成懸濁液，在氬氣流的保護(hù)下，120℃攪拌1 h脫水，再迅速加溫至300℃聚集成顆粒。反應(yīng)完成后，常溫靜置1 h；然后加入20 ml無水乙醇，20 000 r/min離心15 min；最后用無水乙醇沖洗3次，使用四氫呋喃溶解納米顆粒，得到納米顆粒的四氫呋喃溶液。利用透射電子顯微鏡對納米顆粒的形狀與粒徑進(jìn)行鑒定；永磁體實驗定性對納米顆粒的順磁性進(jìn)行驗證。

1.2.2 CA-PLGA星型共聚物的合成和表征

CA-PLGA星型共聚物的合成方法如文獻(xiàn)[2]所示。合成完成后利用核磁共振分析儀表征CA-PLGA的結(jié)構(gòu)和檢測材料的數(shù)均相對分子質(zhì)量；使用凝膠滲透色譜檢測CA-PLGA的相對分子質(zhì)量，并通過保留時間計算分子質(zhì)量的分布。

1.2.3 載Fe3O4納米顆粒的制備

采用溶劑揮發(fā)法制備幾種不同的納米顆粒。具體步驟為：取100 μl質(zhì)量濃度為100 mg/ml Fe3O4納米顆粒的四氫呋喃溶液和100 mg PLGA，另取100 μl Fe3O4納米顆粒溶液和100 mg CA-PLGA，溶于10 ml丙酮中；然后采用滴加的方法，慢慢加入200 ml體積分?jǐn)?shù)為0.03%的聚乙二醇琥珀酸酯（TPGS）水溶液中，800 r/min攪拌過夜除去丙酮。懸液以2 000 r/min離心15 min，然后加入雙蒸水洗3次除去未反應(yīng)的藥物和乳化劑，所得沉淀在10 ml的雙蒸水中冷凍干燥。用同樣方法可制得載0.1%香豆素-6的PLGA和載0.1%香豆素-6的CA-PLGA納米顆粒。

1.2.4 納米顆粒的表征

（一）粒徑和Zeta電位

取1 mg納米顆粒重懸于雙蒸水中，使用超聲分散懸液，之后利用納米激光粒度儀檢測納米顆粒的粒徑及粒度分布。另外，使用激光多普勒測速儀測定納米顆粒的Zeta電位。

（二）內(nèi)部形態(tài)、載藥量和包封率

利用透射電子顯微鏡觀察納米顆粒的內(nèi)部形態(tài)，利用高效液相色譜（high performance liquid chromatography,HPLC）測定納米顆粒的載藥量和包封率。具體步驟：將納米顆粒約5 mg溶解于1 ml丙酮中，攪拌均勻后轉(zhuǎn)移到5 ml由雙蒸水和乙腈（體積比為1∶1）組成的流動相中，通過通入氮氣15 min揮發(fā)掉所有的丙酮直至溶液變得澄清；使用濾器過濾后，加入流動相定容到10 ml，進(jìn)行HPLC分析。

1.2.5 細(xì)胞實驗

（一）細(xì)胞培養(yǎng)

將HeLa細(xì)胞（104個/ml）接種于含DMEM培養(yǎng)基（已添加體積分?jǐn)?shù)為10%的胎牛血清和質(zhì)量濃度為10 g/L的抗生素）的培養(yǎng)皿中，于37℃、5%CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

（二）細(xì)胞攝取實驗

使用激光共聚焦掃描顯微鏡觀察熒光納米顆粒（載0.1%香豆素-6的PLGA納米顆?；蜉d0.1%香豆素-6的CA-PLGA納米顆粒）的細(xì)胞攝取情況。HeLa細(xì)胞培養(yǎng)24 h（密度大致為104個/孔）后，加入含熒光納米顆粒（質(zhì)量濃度為200 μg/ml）的培養(yǎng)基與細(xì)胞孵育過夜，磷酸鹽緩沖液（phosphate buffered saline,PBS）洗3次；用多聚甲醛固定細(xì)胞20 min，PBS洗滌；再用4'，6-二脒基-2-苯基吲哚（DAPI）對細(xì)胞核染色30 min，PBS沖洗掉游離染料；最后用激光共聚焦顯微鏡觀察并借助成像軟件最終成像。

（三）細(xì)胞活力檢測

MTT實驗測定納米Fe3O4顆粒、載Fe3O4的PLGA納米顆粒以及載Fe3O4的CA-PLGA納米顆粒對HeLa細(xì)胞的細(xì)胞毒性。將HeLa細(xì)胞傳代至7.5 cm的培養(yǎng)皿中，加入10 ml DMEM培養(yǎng)基（含體積分?jǐn)?shù)為10%的胎牛血清和質(zhì)量濃度為10 g/L的抗生素），放入培養(yǎng)箱；當(dāng)細(xì)胞貼壁長滿后，用0.125%胰酶-EDTA溶液消化細(xì)胞并種于96孔板中；當(dāng)96孔板中的細(xì)胞生長至70%左右，將培養(yǎng)基換成含納米顆粒的培養(yǎng)基，控制Fe3O4納米顆粒的質(zhì)量濃度在25μg/ml，繼續(xù)培養(yǎng)24 h；納米藥物要先經(jīng)X射線滅菌，同時在培養(yǎng)板上設(shè)陽性對照，即只加入新鮮培養(yǎng)基；培養(yǎng)24h后，去除含納米顆粒的培養(yǎng)基，用PBS洗滌3次；每孔加入90 μl培養(yǎng)基和10 μl MTT，繼續(xù)培養(yǎng)3～4 h；最后除去所有溶液加入100 μl異丙醇，用酶標(biāo)儀測定吸光度并進(jìn)行定量分析。陽性對照細(xì)胞的存活率定為100%，未加入MTT的細(xì)胞可用于矯正吸光度。

1.3 統(tǒng)計學(xué)方法

采用SPSS13.0統(tǒng)計學(xué)軟件處理數(shù)據(jù)，數(shù)據(jù)以均值±標(biāo)準(zhǔn)差（x±s）表示，組間比較采用t檢驗，以P＜0.05為差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 納米Fe3O4顆粒的表征

筆者使用永磁體對合成的納米Fe3O4顆粒的順磁性進(jìn)行了驗證，結(jié)果發(fā)現(xiàn)該顆粒的四氫呋喃溶液可被永磁體所吸引而發(fā)生液面的變化，且在撤去永磁體之后溶液液面又恢復(fù)原狀，表明該溶液具有順磁性；已知四氫呋喃是沒有順磁性的，所以表明了合成的納米Fe3O4顆粒具有順磁性。（圖1）

圖1 納米Fe3O4顆粒的四氫呋喃溶液可被永磁體吸引

透射電子顯微鏡的結(jié)果表明，納米Fe3O4顆粒主要呈立方體形狀，傾向于聚集，且單個納米顆粒粒徑約7 nm。（圖2）

圖2 納米Fe3O4顆粒的透射電鏡圖

2.2 CA-PLGA星型共聚物的表征

圖3為CA-PLGA星型共聚物的1HNMR圖譜，共有5個峰：1.62ppm處的a峰對應(yīng)的是乳酸（lactic acid, LA）的重復(fù)單元—CHCH3中的伯氫原子；5.21 ppm處的b峰對應(yīng)的是LA的重復(fù)單元—CHCH3中的叔氫原子；4.82 ppm處的c峰對應(yīng)的是羥基乙酸（glycolic acid,GA）的重復(fù)單元—CH2—中的氫原子；兩個d峰分別對應(yīng)的是CA的重復(fù)單元—CH2—和—CH—中的氫原子，e峰則對應(yīng)的是整體的CA-PLGA的羥基基團(tuán)連接的氫原子—CHOH。核磁共振結(jié)果表明，已成功合成了CAPLGA星型共聚物。

圖3 膽酸-聚乳酸-羥基乙酸共聚物的1H NMR譜

凝膠滲透色譜結(jié)果表明，CA-PLGA是共聚物，而不是簡單的CA與PLGA的物理混合。綜上所述，已成功合成了CA-PLGA，且CA-PLGA具有與PLGA不同的理化性質(zhì)。

2.3 納米粒的表征

2.3.1 粒徑、Zeta電位和包封率的測定

表1顯示了載Fe3O4的PLGA納米顆粒、空載PLGA顆粒、載Fe3O4的CA-PLGA納米顆粒及空載CA-PLGA顆粒的粒徑、Zeta電位、包封率等特征參數(shù)，這些參數(shù)均會影響納米顆粒的攝取及其在體內(nèi)的半衰期等。

表1 載Fe3O4的PLGA和CA-PLGA納米顆粒的特征參數(shù)

2.3.2 內(nèi)部形態(tài)

載Fe3O4的PLGA和CA-PLGA納米顆粒的透射電鏡圖如圖4所示，載Fe3O4的PLGA納米顆粒呈球狀，內(nèi)部核心呈六邊形，粒徑約200 nm；載Fe3O4的CA-PLGA納米顆粒形態(tài)與PLGA納米顆粒形態(tài)基本一致。

2.4 HeLa細(xì)胞對載香豆素-6納米顆粒的攝取

HeLa細(xì)胞對熒光物質(zhì)的攝取可用來評估納米鐵顆粒被癌細(xì)胞的攝取效果。根據(jù)表1中載香豆素-6的納米顆粒粒徑基本與載Fe3O4的納米顆粒類似，筆者使用載香豆素-6的納米顆粒來評估細(xì)胞對納米顆粒的攝取能力。結(jié)果發(fā)現(xiàn)：載香豆素-6的PLGA和CA-PLGA納米顆粒均能在細(xì)胞質(zhì)中存在，表明這兩種納米顆粒均可被HeLa細(xì)胞所攝??；且CA-PLGA納米顆粒的攝取效果明顯好于PLGA納米顆粒，證明CA能增加納米顆粒與細(xì)胞的親和力、促進(jìn)納米顆粒吸收的猜想是正確的。（圖5）

圖4 載Fe3O4的PLGA和CA-PLGA納米顆粒的透射電子顯微鏡圖

2.5 細(xì)胞毒性評價

細(xì)胞毒性結(jié)果見圖6，相比于納米Fe3O4顆粒本身，載Fe3O4的PLGA納米顆粒作用下的細(xì)胞死亡率明顯降低，而載Fe3O4的CA-PLGA納米顆粒則可使細(xì)胞死亡率進(jìn)一步降低。在Fe3O4質(zhì)量濃度相同的情況下（25 μg/ml），24 h時的細(xì)胞存活率從80%升至87%，而48 h時的細(xì)胞存活率更是由64%升至76%；與納米Fe3O4顆粒比較，載Fe3O4的PLGA和CA-PLGA納米顆粒組的細(xì)胞存活率均有所升高（P＜0.05），且后者升高更顯著。這些都證明了使用PLGA包裹納米Fe3O4顆?？捎行Ы档推浼?xì)胞毒性，而CA-PLGA包裹的納米Fe3O4顆粒較單純的PLGA納米顆粒更能明顯降低細(xì)胞毒性。

圖63 種不同納米Fe3O4顆粒對HeLa細(xì)胞的毒性作用曲線

3 討論與結(jié)論

納米Fe3O4顆粒有著非常廣泛的應(yīng)用，因此筆者希望能把納米Fe3O4顆粒用于腫瘤細(xì)胞的觀察和腫瘤細(xì)胞的殺傷。若能使用生物親和力強(qiáng)的材料對納米Fe3O4顆粒進(jìn)行包裹，那么納米Fe3O4顆粒就可直接進(jìn)入細(xì)胞并能在體內(nèi)保存一段時間而不被肝臟降解。另外，筆者還發(fā)現(xiàn)，若能將納米Fe3O4顆粒引入靶向位點，則其就可較為準(zhǔn)確地出現(xiàn)在腫瘤細(xì)胞附近，這樣在使用MRI成像技術(shù)時，納米Fe3O4顆粒就可成為很好的造影劑與增強(qiáng)劑，幫助醫(yī)生更快、更精準(zhǔn)地發(fā)現(xiàn)病灶所在。游勁松等[5]研究表明，根據(jù)磁熱效應(yīng)，在交變磁場的作用下具有順磁性的物質(zhì)會發(fā)生劇烈的振動從而產(chǎn)生高溫。而何躍明等[6]提出，人體內(nèi)的正常細(xì)胞與腫瘤細(xì)胞對于高溫的耐受能力是不同的，腫瘤細(xì)胞在42℃環(huán)境下的半數(shù)致死時間遠(yuǎn)遠(yuǎn)短于同等條件下正常細(xì)胞的半數(shù)致死時間。因此筆者認(rèn)為，在現(xiàn)有條件下，若能將納米Fe3O4顆粒靶向作用于腫瘤細(xì)胞，則既能迅速通過MRI獲得腫瘤細(xì)胞所在的位置，又能對其施用磁熱效應(yīng)儀從而將腫瘤細(xì)胞殺滅，達(dá)到診療一體化的目的。此外，在降低細(xì)胞毒性方面也可考慮使用殼聚糖[7]等其他材料，或許可使低毒性的納米Fe3O4顆粒更有效地應(yīng)用于診療一體化。

本研究成功制備了納米Fe3O4顆粒以及載Fe3O4的PLGA和CA-PLGA納米顆粒。其中，載Fe3O4的PLGA和CA-PLGA納米顆粒均呈球狀，粒徑約為200 nm，理論載藥量為10%，且當(dāng)Fe3O4納米顆粒的質(zhì)量濃度相同（25 μg/ml）時，載Fe3O4的CA-PLGA納米顆粒的細(xì)胞毒性低于對應(yīng)的PLGA納米顆粒。因此，相比于PLGA納米顆粒，腫瘤細(xì)胞對CA-PLGA納米顆粒的攝取能力更強(qiáng)，并在接下來的MRI中可以起到更好的作用。

利益沖突無

（圖5見插頁3-6）

[1]胡鴻飛,李大成,吉紅兵.納米氧化鐵的制備方法及進(jìn)展[J]．四川有色金屬,2001,7(1)：15-20.DOI：10.3969/j.issn.1006-4079.2001. 01.004. Hu HF,Li DC,Ji HB.Development and method of nano-meter iron oxide particles[J].Sichuan Nonferrous Metals,2001,7(1)：15-20. DOI：10.3969/j.issn.1006-4079.2001.01.004.

[2]ZengX,TaoW,MeiL,etal.Cholicacid-functionalized nanoparticles of star-shaped PLGA-vitamin E TPGS copolymer for docetaxel delivery to cervical cancer[J].Biomaterials,2013,34(25)：6058-6067.DOI：10.1016/j.biomaterials.2013.04.052.

[3]張超,馬桂蕾.納米粒攝取機(jī)制的研究進(jìn)展[J].國際生物醫(yī)學(xué)工程雜志,2015,38(1)：57-62.DOI：10.3760/cma.j.issn.1673-4181.2015. 01.014. Zhang C,Ma GL.Research progress on the cellular uptake mechanism of nanoparticles[J].Int J Biomed Eng,2015,38(1)：57-62.DOI：10.3760/cma.j.issn.1673-4181.2015.01.014.

[4]Maity D,Choo SG,Yi JB,et al.Synthesis of magnetite nanoparticles via a solvent-free thermal decomposition route[J].J Magn Magn Mater, 2009,321(9)：1256-1259.DOI：10.1016/j.jmmm.2008.11.013.

[5]游勁松,楊麗,肖萍,等.熱療用四氧化三鐵磁性納米粒子的制備及其性質(zhì)表征[J].中國藥劑學(xué)雜志,2008,6(6)：309-315. You JS,Yang L,Xiao P,et al.Preparation and characterization of Fe3O4magnetic nanoparticles for hyperthermia[J].Chin J Pharm, 2008,6(6)：309-315.

[6]何躍明,呂新生,艾中立,等.惡性腫瘤的磁靶向熱療[J].國外醫(yī)學(xué)：物理醫(yī)學(xué)與康復(fù)學(xué)分冊,2003,23(2)：96-100.DOI：10.3870/j. issn.1001-117X.2003.02.015. He YM,Lyu XS,Ai ZL,et al.Magnetic-targeted thermochemotherapy for malignant tumors[J].Foreign Med Sci：Phys Med Rehab,2003, 23(2)：96-100.DOI：10.3870/j.issn.1001-117X.2003.02.015.

[7]董霞,劉蘭霞,朱敦皖,等.低分子質(zhì)量殼聚糖修飾多壁碳納米管的制備及細(xì)胞毒性研究[J].國際生物醫(yī)學(xué)工程雜志,2015, 38(1)：11-14.DOI：10.3760/cma.j.issn.1673-4181.2015.01.003. Dong X,Liu LX,Zhu DW,et al.Preparation and cytotoxicity study of multi-wailed carbon nanotubes modified with low-molecularweight chitosan[J].Int J Biomed Eng,2015,38(1)：11-14.DOI：10.3760/cma.j.issn.1673-4181.2015.01.003.

Effects of magnetic iron oxide-loaded CA-PLGA nanoparticles on HeLa cells

Zhang Hongqiu,Zeng Xiaowei, Mei Lin
School of Life Sciences,Tsinghua University,Beijing 100084,China(Zhang HQ);Graduate School at Shenzhen, Tsinghua University,Shenzhen 518055,China(Zhang HQ,Zeng XW,Mei L)

ObjectiveTo investigate the effects of magnetic iron-oxide(Fe3O4)nanoparticles with different skin materials on cytotoxicity against human cervix cancer HeLa cells.MethodsThe Fe3O4nanoparticles were prepared by solvent-free dissolving method and then covered with poly(lactic-co-glycolic acid)(PLGA)and cholic acid (CA)-PLGA respectively.After the characterization,the uptake of nanoparticles by HeLa cells was observed by laser scanning confocal microscopy,and thiazolyl blue tetrazolium bromide(MTT)assay was used to assess the cytotoxcity of the Fe3O4-loaded nanoparticles against HeLa cells.ResultsThe size of single Fe3O4nanoparticle was about 7 nm. The Fe3O4-loaded PLGA and CA-PLGA nanoparticles were spherical in shape under transmission electron microscope,around 200 nm in diameter,and the theoretical drug-loading capacity was 10%.At the same Fe3O4nanoparticles concentration of 25 μg/ml,the Fe3O4-loaded CA-PLGA nanoparticles showed less toxicity than Fe3O4-loaded PLGA nanoparticles.ConclusionsStar-shaped copolymer CA-PLGA is promising in decreasing cytotoxicity of magnetic Fe3O4nanoparticles and expanding its application in living organisms.

Star-shaped copolymer;Iron Oxide;Nanoparticles;Cytotoxicity

梅林，Email：mei.lin@sz.tsinghua.edu.cn

10．3760/cma．j．issn．1673-4181．2016．03．008

國家自然科學(xué)基金面上項目（31270019）；廣東省杰出青年科學(xué)基金（2014A030306036）；廣東省科技計劃公益研究與能力建設(shè)專項（2016A020217001）；深圳市科技計劃基礎(chǔ)研究項目（JCYJ20150430163009479,JCYJ20150529164918738）Corresponding author:Mei Lin,Email:mei.lin@sz.tsinghua.edu.cn

2016-03-11）