張濤，胡懷強(qiáng)，王旭輝，牛兵，陶珍，曹秉振

·論著·

一種高效簡(jiǎn)便的原代神經(jīng)元培養(yǎng)方法

張濤1、2，胡懷強(qiáng)1，王旭輝3，牛兵1，陶珍1，曹秉振1

目的：建立一種簡(jiǎn)便高效的原代神經(jīng)元培養(yǎng)方法。方法：出生12 h內(nèi)的Wistar乳鼠，分離皮質(zhì)后剪碎，0.25%胰酶消化30 min，漂洗后輕柔吹散細(xì)胞，過(guò)濾后1 000 rpm離心5 min，棄上清，加接種液吹勻后過(guò)濾，靜置3～5 min，取上層液體計(jì)數(shù)并接種。接種后4、45、96 h全量換液，之后每3 d半量換液1次。培養(yǎng)第5天評(píng)估神經(jīng)元，NSE染色、NMDAR1染色和臺(tái)盼蘭染色。結(jié)果：神經(jīng)元純度高（＞95%），死亡率低（＜5%），細(xì)胞形態(tài)好，交聯(lián)充分，背景干凈。結(jié)論：利用新生大鼠皮質(zhì)建立了高質(zhì)量、高產(chǎn)量、簡(jiǎn)便的神經(jīng)元培養(yǎng)模型。

皮質(zhì)神經(jīng)元；原代培養(yǎng)；細(xì)胞模型；乳鼠

神經(jīng)元原代培養(yǎng)是研究神經(jīng)系統(tǒng)疾病的重要基礎(chǔ)模型[1,2]。目前的模型大多存在一些瑕疵，如手術(shù)復(fù)雜，手術(shù)時(shí)間長(zhǎng)，影響神經(jīng)元活力；神經(jīng)元純度高，但死亡率也較高；價(jià)格昂貴，對(duì)實(shí)驗(yàn)器材及相關(guān)試劑要求高[3-5]等。本課題組采用新生乳鼠皮質(zhì)，建立了一種簡(jiǎn)單、廉價(jià)、高產(chǎn)、高純度、高成活率、低背景的神經(jīng)元培養(yǎng)模型。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物與試劑 新生12 h內(nèi)Wsitar乳鼠，雌雄不拘，購(gòu)自山東大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心。0.25%胰酶（含EDTA）（PYG0015）購(gòu)于武 漢 博 士 德 公 司 ，Neurobasal-A（108880-022）、B27（17504-044）、glutamax（35050-61）、Hanks’Balanced Salt Solution（HBSS）液（14175-079）、小 牛 血 清（16000-044）購(gòu)于Gibco公司，DMEM/F12（SH30023）購(gòu) 于 Hyclone公 司 ，DnaseI（D8071）購(gòu)于上海聯(lián)碩公司，抗體NSE（neuron-specific enolase）（SAB4200571）、多聚賴(lài)氨酸（P1399）購(gòu)于Sigma公司，抗體NMDAR1（N methyl D aspartate recptor（ab134308）購(gòu)于abcam公司。

1.2 方法

1.2.1 解剖及培養(yǎng) 少量水合氯醛捂鼻麻醉乳鼠，浸入75%酒精，再浸入無(wú)菌冰水中約2 min。無(wú)菌冰臺(tái)上迅速完整分離整個(gè)腦組織，置于冰HBSS液中漂洗。首先剪去尾側(cè)小腦，再沿矢狀線(xiàn)剪開(kāi)兩側(cè)大腦，將腦組織移入另一干凈的冰HBSS液中。小眼科鑷去除掉皮質(zhì)下腦干、間腦等組織，完整剝離軟腦膜，去除殘留血管、嗅球等組織。取出皮質(zhì)放入接種液PM（plantation medium，10% FBS/DMEM/F12）中，剪碎。將剪碎的腦組織吸入37℃預(yù)熱的胰酶中37℃消化30 min。將絮狀的皮質(zhì)組織吸入PM液中放置3 min×2次。再將皮質(zhì)組織吸入吹打液BM（blowing medium，0.2 mg/mL DnaseI/10%FBS/DMEM/F12）中，用塑料一次性無(wú)菌吸管輕柔緩慢吹打，吹打前將管口稍微過(guò)火鈍化，吹打時(shí)避免吹入氣泡，吹打BM液為米湯狀。200目細(xì)胞篩過(guò)濾后1 000 rpm離心5 min，棄上清后加入適量PM液稍微吹勻后再次200目細(xì)胞篩過(guò)濾，靜置約3 min后取上清液計(jì)數(shù)細(xì)胞密度，計(jì)算好接種濃度后添加適量PM液配好接種液。接種量：9.5×104/孔（24孔板），7.0×105/孔（6孔板）。接種后4、45、96 h使用NM（neurobasal meduim，含Neurobasal-A，B27，glutamax，青鏈霉素）全量換液，每次換液前可用HBSS液輕柔漂洗1次，之后可每3天半量換液1次。

1.2.2 細(xì)胞鑒定 培養(yǎng)第5天評(píng)估神經(jīng)元，光鏡下觀察神經(jīng)元并行NSE、NMDAR1免疫細(xì)胞化學(xué)染色和臺(tái)盼蘭染色。免疫細(xì)胞化學(xué)染色：4%多聚甲醛室溫下固定30 min，PBS液漂洗，3%H2O2去離子水10 min，PBS液漂洗后山羊血清封閉液20 min，NSE或NMDAR1孵育4℃過(guò)夜，漂洗后生物素標(biāo)記山羊抗大鼠IgG室溫15 min，漂洗后辣根酶標(biāo)記鏈霉卵白素室溫15 min，漂洗后DAB顯色。臺(tái)盼蘭染色：400 μL的2%臺(tái)盼蘭染液/孔（24孔板），室溫下12 min，倒掉染液，倒置光學(xué)顯微鏡觀察計(jì)數(shù)。

2 結(jié)果

2.1 神經(jīng)元生長(zhǎng)情況變化

接種約12 min左右，大部分神經(jīng)元即沉底，但貼壁不牢。接種4 h可見(jiàn)少數(shù)神經(jīng)元長(zhǎng)出突起，神經(jīng)元體積較小。接種第1天，大部分神經(jīng)元長(zhǎng)出突起。接種第2天，幾乎所有神經(jīng)元均長(zhǎng)出突起，突起較長(zhǎng)。部分非神經(jīng)元細(xì)胞、死亡神經(jīng)元、組織碎屑可在45 h全量換液時(shí)去除。換液后神經(jīng)元純度高，活力好，背景干凈。接種第3天開(kāi)始，神經(jīng)元形態(tài)基本成熟，體積較前變大。接種第4天神經(jīng)形態(tài)進(jìn)一步發(fā)育成熟，細(xì)胞飽滿(mǎn)透亮，突起交聯(lián)充分。部分活力較差的神經(jīng)元和死亡細(xì)胞在接種96 h全量換液時(shí)可去除。此后死亡細(xì)胞仍貼壁牢，再全量換液無(wú)類(lèi)似明顯效果。第5～9天細(xì)胞狀態(tài)無(wú)明顯變化，可用于相關(guān)實(shí)驗(yàn)。第10天神經(jīng)元逐漸衰老，透亮度下降，部分神經(jīng)元固縮凋亡，見(jiàn)圖1。

2.2 神經(jīng)元狀態(tài)評(píng)估鑒定

接種第5天，神經(jīng)元特異性標(biāo)志物NSE染色陽(yáng)性率＞95%，見(jiàn)圖2A；NMDAR染色可見(jiàn)神經(jīng)元突起細(xì)長(zhǎng)，交聯(lián)密布充分，見(jiàn)圖2B；臺(tái)盼蘭染色陽(yáng)性率＜5%，見(jiàn)圖1C、D。神經(jīng)元生長(zhǎng)狀態(tài)好，達(dá)到進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)要求。

圖1 培養(yǎng)的皮質(zhì)神經(jīng)元生長(zhǎng)情況（光鏡，×200）

圖2 神經(jīng)元評(píng)估鑒定

3 討論

神經(jīng)元的培養(yǎng)模型很多，還有一些實(shí)驗(yàn)[6,7]通過(guò)誘導(dǎo)其它細(xì)胞分化為神經(jīng)元。

細(xì)節(jié)的處理是決定神經(jīng)元培養(yǎng)效果的關(guān)鍵。本研究主要進(jìn)行了以下調(diào)整：①早期全量換液。本課題組研究發(fā)現(xiàn)全量換液對(duì)細(xì)胞活力的影響不明顯，而且可以清除活力差的細(xì)胞、非神經(jīng)元細(xì)胞和壞死碎屑。要注意操作溫柔、快速、一孔一換液，減少干底時(shí)間和污染。②換液時(shí)間很重要。采用NM液于接種后第4、45、96 h全量換液。能清潔神經(jīng)元，保持神經(jīng)元高活力、高純度、低背景。換液后超過(guò)2 d或接種第4天以后，神經(jīng)元已經(jīng)貼壁非常牢固，此時(shí)全量換液并不能將死亡的神經(jīng)元全部換掉。常規(guī)接種后每3天半量換液無(wú)此凈化效果。③通過(guò)簡(jiǎn)化實(shí)驗(yàn)步驟，減少取材接種時(shí)間，提高細(xì)胞活力。如胰酶消化后各個(gè)步驟均直接采用接種液PM為溶液，采用FBS中和胰酶。④增加離心后的過(guò)濾和沉淀。離心后還會(huì)有部分神經(jīng)元纏結(jié)成絮狀，無(wú)法吹勻，過(guò)濾棄除。仍有部分團(tuán)塊狀的神經(jīng)元得通過(guò)靜置去除。

此外還有一些細(xì)節(jié)問(wèn)題非常重要。吹打和消化是2個(gè)非常重要的因素。筆者的經(jīng)驗(yàn)是：采用含EDTA的胰酶，利于吹散神經(jīng)元；每次接種神經(jīng)元之后15 min在光鏡下觀察神經(jīng)元狀態(tài)。如果團(tuán)塊細(xì)胞多，說(shuō)明消化不夠，需要增強(qiáng)消化時(shí)間或者胰酶濃度；如果有大量組織碎屑，說(shuō)明消化過(guò)頭；如果非神經(jīng)元細(xì)胞過(guò)多，說(shuō)明解剖不夠干凈準(zhǔn)確。數(shù)次調(diào)整后摸索出適宜的消化方法和固定的吹打模式。不需要將所有的皮質(zhì)組織都吹散利用，只需吹打出適當(dāng)高活力的神經(jīng)元即可。本組1只乳鼠的2個(gè)皮質(zhì)可收集約300～400萬(wàn)個(gè)神經(jīng)元。另外，接種密度也是重要的因素。接種密度過(guò)大會(huì)影響神經(jīng)元生長(zhǎng)，導(dǎo)致部分神經(jīng)元死亡。接種的時(shí)候應(yīng)該提前計(jì)算并混勻好接種液[8]。

本課題組培養(yǎng)的神經(jīng)元生長(zhǎng)發(fā)育較其它報(bào)道的模型快[9]，1 d左右大多數(shù)神經(jīng)元都長(zhǎng)出突起，3 d左右神經(jīng)元基本成熟，10 d左右出現(xiàn)衰老[10]。考慮可能和采用乳鼠皮質(zhì)培養(yǎng)，較孕鼠神經(jīng)元發(fā)育較快有關(guān)。另外，通過(guò)全量換液的過(guò)程，富集了高活力和生長(zhǎng)發(fā)育快的神經(jīng)元可能也是一個(gè)原因。

本研究通過(guò)簡(jiǎn)單的乳鼠皮質(zhì)以及簡(jiǎn)便的培養(yǎng)過(guò)程，培養(yǎng)出高質(zhì)量原代神經(jīng)元，為類(lèi)似的實(shí)驗(yàn)研究提供了參考，尤其是有關(guān)神經(jīng)元死亡率相關(guān)的實(shí)驗(yàn)。

[1]Beaudoin GM 3rd,Lee SH,Singh D,et al.Culturing pyramidal neurons from the early postnatal mouse hippocampus and cortex[J].Nat Protoc,2012,7:1741-1754.

[2]Giordano G,Costa LG.Primary neurons in culture and neuronal cell lines for in vitro neurotoxicologicalstudies[J].Methods MolBiol,2011, 758:13-27.

[3]姜茜,姜玉武,王靜敏,等.一種改進(jìn)的大鼠皮層神經(jīng)元原代培養(yǎng)方法及其性質(zhì)鑒定[J].北京大學(xué)學(xué)報(bào)(醫(yī)學(xué)版),2009,41:212-216.

[4]張小娟,李廷玉,劉友學(xué),等.簡(jiǎn)易大鼠海馬神經(jīng)元原代培養(yǎng)方法及神經(jīng)元興奮性檢測(cè)[J].南方醫(yī)科大學(xué)學(xué)報(bào),2010,30:2080-2083.

[5]康國(guó)創(chuàng),劉文博,尹麗鶴,等.一種改進(jìn)的高密度大鼠皮層神經(jīng)元培養(yǎng)方法[J].中華神經(jīng)外科疾病研究雜志,2009,8:417-420.

[6]何主強(qiáng),楊國(guó)平,趙洪洋,等.Nogo-A受體在早期神經(jīng)元細(xì)胞分化過(guò)程中的表達(dá)[J].神經(jīng)損傷與功能重建,2015,9:95-97.

[7]戴錕,孫曉陽(yáng).成纖維細(xì)胞向神經(jīng)元轉(zhuǎn)化的研究進(jìn)展[J].神經(jīng)損傷與功能重建,2015,9:59-61.

[8]楊傳豪,趙冬,劉祺,等.新生大鼠皮層神經(jīng)元體外無(wú)血清原代培養(yǎng)[J].重慶醫(yī)學(xué),2014,43:3901-3903,3906.

[9]余華榮,楊貴忠,楊俊卿,等.大鼠皮層神經(jīng)元原代培養(yǎng)方法的改進(jìn)[J].重慶醫(yī)科大學(xué)學(xué)報(bào),2007,32:392-394,401.

[10]王旭輝,張岫竹,王伍超,等.大鼠下丘腦神經(jīng)元培養(yǎng)的新方法[J].第三軍醫(yī)大學(xué)學(xué)報(bào),2009,31:1709-1711.

（本文編輯：唐穎馨）

An Efficient and Convenient Model of Culturing Primary Neurons

ZHANGTao1、2,HUHuai-qiang1,WANGXu-hui3,NIUBing1,TAOZhen1,CAOBing-zhen1.

1.GeneralHospitalofJinanMilitaryArea,Jinan 250031,China;2.No.303Hospital ofChinesePeople'sLiberationArmy,Nanning530021,China;3.DapingHospital，ResearchInstituteofSurgeryThirdMilitaryMedical University,Chongqing400042,China

Objective:To establish an efficient and convenient model of culturing primary neurons.Methods: Firstly,the cortex of newborn Wistar mice younger than 12 hours old was thoroughly separated.And then the cortex was digested by 0.25%tyrisin for 30 min after cutting into pieces.Cells were rinsed,blew and centrifuged at 1000 rpm for 5 min after filtering.The supernatant was abandoned,and the resultant was added with plantation medium,gently blew and filtered.After standing for 3～5 min,the supernatant liquid was withdrawn in order to perform a count on the cells.The medium was replaced in full at 4 h,45 h and 96 h later after seeding and then the medium could be replaced in half every 3 days.At day 5 of culture,the neurons were evaluated by NSE,NMDAR1 and trypan blue staining.Results:The purity of neurons was over 95%and the mortality rate was less than 5%.The morphology of neurons was excellent,effectively crosslinking,and the background was clean.Con?clusion:Ahigh-quality,high-yield and simple neuronal culture model was established using neonatal rat cortex.

cortical neurons;primary culture;cell model;newborn rats

R741；R741.02

A DOI 10.16780/j.cnki.sjssgncj.2016.06.001

1.濟(jì)南軍區(qū)總醫(yī)院濟(jì)南 250031

2.解放軍第303醫(yī)院南寧 530021

3.第三軍醫(yī)大學(xué)大坪醫(yī)院野戰(zhàn)外科研究所重慶 400042

十二五全軍重點(diǎn)項(xiàng)目No.BWS11J062

2016-01-20

曹秉振cbzxia2011@163. com