周志如

（海南師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院 海南?？?571158）

多重PCR技術(shù)在食品微生物檢測(cè)中的應(yīng)用進(jìn)展

周志如

（海南師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院 海南?？?571158）

PCR（聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)）技術(shù)由于具備操作方便、快速和靈敏等優(yōu)勢(shì)，并且能夠同時(shí)擴(kuò)增不同的目的基團(tuán)，在微生物檢測(cè)當(dāng)中受到了越來(lái)越廣泛的應(yīng)用。多重PCR技術(shù)的研究對(duì)于高效快速檢測(cè)的意義重大，逐漸成為了當(dāng)下的研究焦點(diǎn)。本文將對(duì)多重PCR技術(shù)的原理作出分析，并探討其在微生物檢測(cè)中的應(yīng)用、問(wèn)題及改進(jìn)方法。

多重PCR技術(shù) 食品微生物檢測(cè) 應(yīng)用進(jìn)展

當(dāng)前的食品行業(yè)中存在許多危害食品品質(zhì)與人類(lèi)健康的有害微生物，必須通過(guò)敏感、快速、有效的檢測(cè)手段來(lái)及時(shí)發(fā)現(xiàn)、控制致病菌，以降低其危害。多重PCR技術(shù)突破了傳統(tǒng)檢測(cè)手段用時(shí)長(zhǎng)、操作繁瑣的局限，在微生物致病菌檢測(cè)方面得到了日益廣泛的應(yīng)用。

1　食品微生物的檢測(cè)方法

傳統(tǒng)的食品微生物檢測(cè)主要有培養(yǎng)法和免疫學(xué)方法，其中培養(yǎng)法需歷經(jīng)贈(zèng)菌或前增菌、分離、培養(yǎng)和生化、血清學(xué)鑒定等多個(gè)繁瑣流程，十分的耗時(shí)耗力。而具有高敏感度和特異性的免疫學(xué)方法極易受復(fù)雜的微生物血清型影響，容易出現(xiàn)假陽(yáng)性狀況，檢測(cè)結(jié)果不夠精確。隨著現(xiàn)代科技的進(jìn)步，以PCR技術(shù)為基礎(chǔ)的分子生物學(xué)檢測(cè)技術(shù)發(fā)展迅速，因其操作快捷、成本低廉且特異性和靈敏性強(qiáng)，在食品微生物檢測(cè)中受到了越來(lái)越多的青睞。

2　多重PCR技術(shù)及原理

聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（PCR）指的是單鏈DNA模版在體外條件和DNA聚合酶作用下產(chǎn)生DNA片段特異性擴(kuò)增的技術(shù)，經(jīng)歷變性-退火-延伸流程。首先把雙鏈DNA所熱變形成的單鏈DNA靶序列與人工合成引物相結(jié)合，引物受DNA聚合酶作用沿DNA單鏈由5′末端延伸至3′末端并合成雙鏈，使其作為模版在聚合酶反應(yīng)下又形成新的DNA雙鏈，反復(fù)循環(huán)。多重PCR是將兩對(duì)及以上引物加入同一個(gè)反應(yīng)體系中，擴(kuò)增出多個(gè)DNA序列或目的基因。

3　微生物檢測(cè)中多重PCR技術(shù)的應(yīng)用

（1）應(yīng)用于食品病原微生物的檢測(cè)。主要包括：①沙門(mén)氏菌。沙門(mén)氏菌易因食品成分干擾或食品加工而損傷，影響檢測(cè)準(zhǔn)確性。多重PCR能夠?qū)ι抽T(mén)氏菌血清型、突變狀況進(jìn)行準(zhǔn)確的鑒定，提升沙門(mén)氏菌檢測(cè)率。目前屬特異性引物基因hilA、hns、fimA等與血清型特異性引物基因、血清群特異性引物基因是檢測(cè)沙門(mén)氏菌的主要靶基因；②金黃色葡萄球菌。金黃色葡萄球菌能夠繁殖生成引發(fā)食物中毒的腸毒素SE，廣泛存在于生肉、發(fā)酵肉類(lèi)和蔬菜當(dāng)中，其相關(guān)檢測(cè)基因包含sea、seb等基因；③腸出血性大腸桿菌。大腸桿菌具有十分相似的產(chǎn)毒素，檢測(cè)時(shí)以緊密素基因eae、鞭毛基因fliCH7等作為目的基因。

（2）應(yīng)用于食品非致病菌的檢測(cè)。乳酸菌對(duì)病菌生長(zhǎng)具有很好的抑制作用，但也常預(yù)示食物的腐敗。食品真空包裝中往往存在含量低卻可繁殖生長(zhǎng)的乳酸菌，多重PVR檢測(cè)可判斷真空包裝食品的腐敗情況。

（3）應(yīng)用于食品相關(guān)環(huán)境微生物的檢測(cè)。外界環(huán)境當(dāng)中廣泛分布著不動(dòng)桿菌和導(dǎo)致醫(yī)院感染的鮑氏不動(dòng)桿菌，以碳青霉烯類(lèi)耐藥株增加為主要特性的多重耐藥鮑氏桿菌增加給食品安全帶來(lái)了嚴(yán)重威脅，另外，以寄生曲霉為主要病原的黃曲霉中的毒素可致癌。相關(guān)研究顯示，多重PCR技術(shù)在不動(dòng)桿菌、黃曲霉等的檢測(cè)上具有很高的準(zhǔn)確度。

4　微生物檢測(cè)中多重PCR技術(shù)存在的問(wèn)題與改進(jìn)

（1）問(wèn)題。在應(yīng)用食品微生物的多重PCR檢測(cè)技術(shù)時(shí)，多對(duì)引物可能相互抑制并結(jié)合非靶序列出現(xiàn)非特異性擴(kuò)增。受到食品復(fù)雜成分的感染以及微生物含量低的影響，含PCR抑制成分的樣品會(huì)降低檢測(cè)靈敏度，出現(xiàn)假陰性結(jié)果，不利于多重PCR技術(shù)在食品微生物檢測(cè)中的普及。

（2）很多學(xué)者為了實(shí)現(xiàn)最佳多重PCR體系與反應(yīng)條件的優(yōu)化，采取了差速離心、免疫磁珠吸附等技術(shù)來(lái)對(duì)樣品前處理效果做出提高，降低了抑制因子的作用。結(jié)合實(shí)時(shí)熒光定量PCR能夠定量拷貝數(shù)并免除后處理，具有準(zhǔn)確、特異和高效的優(yōu)勢(shì)，但設(shè)備成本高，同時(shí)檢測(cè)結(jié)果可能受引物探針含量、外緣DNA等的干擾，在樣品處理過(guò)程簡(jiǎn)化和檢測(cè)成本降低方面還有待改進(jìn)。結(jié)合DGGE（變性梯度凝膠電泳）能夠?qū)Σ煌瑝A基DNA片段混合物進(jìn)行分離，通過(guò)條帶數(shù)量和明暗程度反映微生物狀況，操作簡(jiǎn)便且準(zhǔn)確率高，與此同時(shí)因可分析樣品容量較小，故目前僅使用在一些小DNA片段中，其圖譜條帶會(huì)在樣品制備時(shí)發(fā)生改變。

5　應(yīng)用進(jìn)展

多重PCR檢測(cè)技術(shù)效率高、速度塊且特異性好，在食品病原微生物、環(huán)境微生物與非致病微生物的檢測(cè)中意義重大，具有十分廣闊的發(fā)展前景。多重PCR當(dāng)前還面臨著檢測(cè)靈敏度不高、易受抑制因子感染等情況，當(dāng)前的改進(jìn)技術(shù)在一定程度上減少了檢測(cè)的時(shí)間與成本，但同時(shí)也存在諸多問(wèn)題。未來(lái)應(yīng)當(dāng)以樣品前處理技術(shù)的改進(jìn)和印制因子干擾的消除為研究重點(diǎn)，進(jìn)一步提升多重PCR技術(shù)在食品微生物檢測(cè)當(dāng)中的有效性與可行性。

［1］柳洪芳，宋慧.PCR及其改進(jìn)技術(shù)在食品微生物檢測(cè)中的應(yīng)用［J］.現(xiàn)代化農(nóng)業(yè)，2012，01：34-36.

［2］王華，劉斌.PCR技術(shù)在食品微生物檢測(cè)中的應(yīng)用［J］. 生物技術(shù)通報(bào)，2010，02：63-67.

［3］吳海華.多重PCR快速檢測(cè)技術(shù)在食品致病微生物檢測(cè)中的應(yīng)用［J］.現(xiàn)代食品，2015，17：43-45.

TS207

A

1674-2060（2016）05-0097-01

周志如（1993—），女，海南東方，海南師范大學(xué)2012級(jí)本科生， 研究方向：生物技術(shù)。