付竹青喻云梅溫小軍袁偉曦趙祖國

（1. 廣東醫(yī)學(xué)院微生物學(xué)與免疫學(xué)教研室，湛江 524023；2. 解放軍第422中心醫(yī)院，湛江 524023；3. 廣東醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院肝膽外科，湛江 524023）

細(xì)菌小RNA抗?fàn)I養(yǎng)應(yīng)激調(diào)控功能的研究進展

付竹青1喻云梅2溫小軍3袁偉曦1趙祖國1

（1. 廣東醫(yī)學(xué)院微生物學(xué)與免疫學(xué)教研室，湛江 524023；2. 解放軍第422中心醫(yī)院，湛江 524023；3. 廣東醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院肝膽外科，湛江 524023）

細(xì)菌生存的環(huán)境復(fù)雜多變，經(jīng)常處于營養(yǎng)元素過?；蛉狈Φ臓顟B(tài)。因此，細(xì)菌必須及時準(zhǔn)確地調(diào)節(jié)其基因表達以適應(yīng)不斷變化的營養(yǎng)環(huán)境，才能得以生存。小RNA（small RNA，sRNA）是近年來在細(xì)菌中發(fā)現(xiàn)的一類RNA調(diào)控子，在細(xì)菌應(yīng)對營養(yǎng)應(yīng)激的基因表達調(diào)控中發(fā)揮重要作用。就細(xì)菌sRNA的特點及其抗?fàn)I養(yǎng)應(yīng)激的作用進行綜述。

細(xì)菌小RNA；調(diào)控網(wǎng)絡(luò)；營養(yǎng)應(yīng)激

細(xì)菌生存的營養(yǎng)環(huán)境不斷變化，經(jīng)常被迫處于各種營養(yǎng)物質(zhì)應(yīng)激中。細(xì)菌在生長過程中代謝物質(zhì)的累積和營養(yǎng)元素含量的變化都能引起應(yīng)激反應(yīng)。例如，磷酸葡萄糖糖應(yīng)激、鐵應(yīng)激、氨基酸應(yīng)激等。為了應(yīng)對這些應(yīng)激環(huán)境，細(xì)菌必須通過精細(xì)的調(diào)控系統(tǒng)來調(diào)節(jié)營養(yǎng)的吸收及代謝。以往的研究多關(guān)注蛋白質(zhì)水平的基因表達調(diào)控，然而近年來越來越多的研究表明sRNA對細(xì)菌的生長繁殖、快速適應(yīng)外界環(huán)境變化及調(diào)節(jié)營養(yǎng)代謝起著重要的作用［1-3］。sRNA可作用于多個靶點，而且sRNA無需翻譯成蛋白質(zhì)，在RNA水平即可發(fā)揮作用，再加上RNA的半衰期短，因此sRNA通常能夠更精確、迅速地調(diào)節(jié)多種基因的表達，比蛋白質(zhì)水平的基因調(diào)控更具有優(yōu)勢。所以，生物體內(nèi)的sRNA的鑒定及其調(diào)控機制的研究已成為新的研究熱點。

細(xì)菌sRNA是一類非編碼RNA，廣泛存在于真核和原核生物中，在細(xì)胞生長繁殖過程中發(fā)揮著重要的生物學(xué)功能。細(xì)菌sRNA有以下特點：（1）長度多為50-500 nt。（2）多位于編碼基因間隔區(qū)，少數(shù)位于mRNA 的5'或3'非編碼區(qū)域（non-codingregion，NCR）。（3）穩(wěn)定性多依賴于RNA分子伴侶蛋白Hfq（a host factor for RNA phage QP）。（4）轉(zhuǎn)錄通常開始于一段能折疊成穩(wěn)定莖環(huán)結(jié)構(gòu)的序列，終止于Rho非依賴轉(zhuǎn)錄終止因子；由于莖環(huán)結(jié)構(gòu)有助于穩(wěn)定整個RNA分子的結(jié)構(gòu)，因此大多數(shù)sRNA明顯比mRNA穩(wěn)定。（5）一個sRNA可調(diào)控一個或多個靶點，一個靶點也可受到多個sRNA的調(diào)控。（6）細(xì)菌sRNA主要由細(xì)菌染色體編碼，少部分源于質(zhì)粒、噬菌體或轉(zhuǎn)座子［4］。

1 sRNA的分類

隨著生物信息學(xué)技術(shù)和實驗方法的迅速發(fā)展，迄今發(fā)現(xiàn)的細(xì)菌sRNA已超過200個，其中來自大腸桿菌的sRNA就超過100種。在其他細(xì)菌中也發(fā)現(xiàn)一些sRNA，如枯草芽孢桿菌、霍亂弧菌、銅綠假單胞菌、葡萄球菌和單核細(xì)胞增生性李斯特菌等。根據(jù)sRNA作用機制及生物學(xué)功能不同，目前可以把細(xì)菌sRNA分為5種類型。

1.1 行使管家功能的sRNA

這類sRNA本身具有酶活性或者作為核糖核蛋白的組成部分發(fā)揮功能，此類sRNA是細(xì)菌生命活動所必需的，其表達水平相對較高。目前至少發(fā)現(xiàn)3種該類型的sRNA，包括具有酶催化活性并形成RNaseP的催化亞單位M1RNA、轉(zhuǎn)運信使（transfer messenger RNA，tmRNA）及組成核糖核蛋白復(fù)合物的4.5S RNA［5，6］。

1.2 反式編碼sRNA

目前已發(fā)現(xiàn)的細(xì)菌sRNA大部分屬于此類，也是研究得最清楚的一類sRNA。此類sRNA能與靶mRNA通過不完全堿基互補配對結(jié)合，阻斷mRNA與核糖體結(jié)合進而阻斷翻譯過程來抑制靶基因的表達［7］。少數(shù)反式編碼sRNA與靶mRNA結(jié)合后，可通過RNase E 降解 mRNA 而降低靶基因的表達水平［8］。其大部分需要通過與RNA伴侶Hfq結(jié)合而發(fā)揮作用［9］。這類sRNA通常參與細(xì)菌的代謝和環(huán)境應(yīng)激調(diào)控。

1.3 順式編碼sRNA

順式編碼sRNA由靶基因的反義鏈編碼，這種sRNA能與靶mRNA完全互補配對，通過促進轉(zhuǎn)錄衰減、抑制翻譯、促進靶基因降解來發(fā)揮調(diào)控功能［10］。多數(shù)順式編碼sRNA來自于質(zhì)粒、轉(zhuǎn)座元件或噬菌體［11］，近年來細(xì)菌染色體來源的sRNA也逐漸被發(fā)現(xiàn)［12］。例如，許多染色體順式編碼sRNA能夠調(diào)節(jié)對細(xì)胞有毒性的小疏水性蛋白的表達，被認(rèn)為是抗毒因子［13］。

通過中國知網(wǎng)，南京體育學(xué)院圖書館及網(wǎng)絡(luò)搜索查閱了有關(guān)定向運動、高校運動和可持續(xù)發(fā)展方面的文獻、書籍及文件，基本掌握了普通高校開展定向運動的現(xiàn)狀和可持續(xù)發(fā)展的基本特征，為本課題研究的順利進行提供了基礎(chǔ)。

1.4 蛋白質(zhì)結(jié)合sRNA

這類 sRNA通過與蛋白質(zhì)相互作用來調(diào)節(jié)靶蛋白生物活性。目前研究比較透徹的有CsrB、CsrC、GlmY和6S RNA［14］。例如，CsrB和CsrC sRNA與全局轉(zhuǎn)錄后調(diào)控因子CsrA蛋白相互作用抑制CsrA活性，競爭性使CsrA與靶mRNA 5'UTR（untranslated regions）結(jié)合減少，從而影響下游基因的表達。

1.5 核糖開關(guān)

核糖開關(guān)是一類非編碼RNA，多數(shù)位于mRNA的 5'UTR 區(qū)，主要由適體平臺（aptamer platform）和表達平臺（expression platform）兩部分組成。它能通過感知小分子代謝物濃度的變化在轉(zhuǎn)錄和翻譯兩種水平上調(diào)控基因的表達。在轉(zhuǎn)錄水平上，配體結(jié)合適體平臺后，表達平臺構(gòu)象改變，促使或擾亂表達平臺中內(nèi)源性終止子的形成，導(dǎo)致下游基因轉(zhuǎn)錄提前終止或繼續(xù)延伸；在翻譯水平上，配體與適體結(jié)合，改變核糖體結(jié)合位點處核酸序列的二級結(jié)構(gòu)，這種二級結(jié)構(gòu)暴露或者隱藏 SD 序列從而改變核糖體的結(jié)合狀態(tài)，進而激活或者終止翻譯的進行［15］。

2 sRNA抗?fàn)I養(yǎng)應(yīng)激的作用

2.1 在鐵應(yīng)激中的作用

鐵是細(xì)菌生命活動所必需的營養(yǎng)元素，含量過低會影響細(xì)菌的正常代謝，含量過高則會對細(xì)菌產(chǎn)生毒害作用，因此細(xì)菌必須及時調(diào)節(jié)菌體內(nèi)的鐵離子濃度。大部分細(xì)菌鐵的吸收和利用受到負(fù)調(diào)控因子鐵吸收調(diào)控蛋白Fur（ferric uptake regulator）的調(diào)控。當(dāng)環(huán)境中鐵豐富時，F(xiàn)ur與Fe2+結(jié)合，F(xiàn)ur蛋白被激活，直接抑制一系列與鐵吸收有關(guān)蛋白的表達，減少細(xì)菌對鐵的攝入量；同時激活一系列儲鐵蛋白和非必需鐵硫蛋白基因的表達，增加體內(nèi)對鐵的儲存和利用，防止過量鐵對細(xì)胞毒害作用［16］。

長期困惑人們的問題是，負(fù)調(diào)控因子Fur是如何調(diào)控上述基因的表達。隨著小RNA調(diào)節(jié)子RyhB的發(fā)現(xiàn)和深入研究，這個問題得到了解釋：RyhB是一類長度為90 nt的小RNA，它通過堿基互補配對與鐵儲存蛋白（如Bfr）和非必需的鐵硫蛋白（如超氧化物歧化酶sodB，sdhCDAB操縱子等）的mRNA在核糖體結(jié)合位點附近結(jié)合，降低靶mRNA穩(wěn)定性及翻譯效率，減少體內(nèi)鐵的儲存和利用［17］。當(dāng)環(huán)境鐵剩余時，F(xiàn)ur與Fe2+結(jié)合并被活化，直接抑制參與鐵吸收和轉(zhuǎn)運的基因表達，減少細(xì)菌對鐵的攝入量；與此同時，活化后的Fur結(jié)合到RyhB啟動子上，RyhB的表達受到抑制，細(xì)菌體內(nèi)編碼鐵儲存蛋白和鐵硫蛋白的基因得到表達，消耗利用鐵離子，將細(xì)胞內(nèi)鐵濃度維持在一個正常的水平。當(dāng)環(huán)境鐵不足時，F(xiàn)e2+與Fur分離，F(xiàn)ur處于失活狀態(tài)，直接促進鐵的吸收和轉(zhuǎn)運，增加細(xì)菌對鐵的攝入量，與此同時，RyhB表達量增加，抑制鐵儲存蛋白和鐵硫蛋白的合成，減少體內(nèi)對鐵的消耗和儲存［18］。負(fù)調(diào)控因子 Fur在RyhB的幫助下，將細(xì)胞內(nèi)的鐵離子濃度維持在一個恒定的范圍，保證了細(xì)菌生命活動的正常進行。有研究表明，當(dāng)ryhB 基因缺失后，細(xì)菌不能在鐵缺乏的環(huán)境下生存［19］。

此外，在其他菌屬中也陸續(xù)發(fā)現(xiàn)與RyhB功能類似的sRNA，如銅綠假單胞菌中的PrrF1、PrrF2和PrrF［20］，芽孢桿菌FsrA［21］，腦膜炎奈瑟氏菌NrrF［22］。

2.2 在糖應(yīng)激中的作用

許多細(xì)菌都是通過磷酸烯醇丙酮酸轉(zhuǎn)移酶系統(tǒng)（phosphoenolpyruvate phosphotransferase system，PTS）吸收葡萄糖［23，24］。在吸收葡萄糖的過程中伴隨產(chǎn)生大量的磷酸葡萄糖或磷酸葡萄糖代謝物（如G-6-P、αMG-6-P、2DG-6-P等）。然而磷酸葡萄糖在細(xì)胞內(nèi)累積會使細(xì)胞受損，即磷酸葡萄糖應(yīng)激。Aiba等［25］發(fā)現(xiàn)，大腸桿菌在這種應(yīng)激條件下，大部分編碼葡萄糖轉(zhuǎn)運子基因ptsG的 mRNA發(fā)生降解，從而減少對葡萄糖的吸收，降低G-6-P水平。有意思的是，這種調(diào)控作用需要Hfq參與，這提示可能有sRNA參與。通過Hfq共免疫沉淀方法發(fā)現(xiàn)了這種調(diào)節(jié)磷酸葡萄糖應(yīng)激的sRNA-SgrS。誘導(dǎo)表達的SgrS能引起ptsG mRNA快速降解，反之，敲除sgrS基因能遏制由磷酸葡萄糖應(yīng)激引起的ptsG的下調(diào)［26］。

SgrS是一個大小為 227 nt的反式編碼小 RNA，在磷酸葡萄糖應(yīng)激中發(fā)揮重要的調(diào)控功能。SgrS 能負(fù)向調(diào)控數(shù)種靶mRNA的表達，其中研究最多的是ptsG mRNA，其能編碼葡萄糖轉(zhuǎn)運子IICBGlc。SgrS 3'端有6 nt與ptsG mRNA 互補配對，其中包含部分SD序列［27］。這樣，SgrS 阻止ptsG mRNA與核糖體結(jié)合，并能同時使ptsG mRNA 被Hfq蛋白與 RNaseE形成的降解復(fù)合體所降解，從而進一步阻止新的IICBGlc合成，最終降低體內(nèi)磷酸葡萄糖的水平，減弱對細(xì)胞的損傷［28］。與此同時，SgrS 5'端還能編碼一段小肽SgrT，抑制IICBGlc的活性，阻止磷酸葡萄糖的進一步增加［29］。值得一提的是sRNA在降解靶mRNA的同時，其自身也降解。這樣當(dāng)細(xì)胞內(nèi)磷酸葡萄糖恢復(fù)正常生長狀態(tài)時，SgrS的水平也隨之降低，其負(fù)調(diào)節(jié)pstG mRNA的功能也終止。

最近研究發(fā)現(xiàn)，SgrS也在轉(zhuǎn)錄后水平上負(fù)向調(diào)控manXYZ mRNA的表達，后者編碼PTS轉(zhuǎn)運子EIIABCDMan［30，31］。EIIABCDMan能轉(zhuǎn)運多種糖分子到菌體內(nèi)，如甘露糖、葡萄糖、甲基葡萄糖和脫氧葡萄糖。與SgrS調(diào)控ptsG 翻譯機制相比，SgrS對manXYZ mRNA的調(diào)控機制顯得稍復(fù)雜。manXYZ mRNA上有兩個獨立的SgrS結(jié)合位點：第一個結(jié)合位點位于manX起始編碼子下游20-30 nt，SgrS與其堿基配對結(jié)合后可抑制manX的翻譯，但是不能抑制manY或manZ的翻譯；第二個結(jié)合位點在manX-manY基因間隔區(qū)，SgrS與之結(jié)合后能進一步抑制manY和manZ翻譯。SgrS同時結(jié)合這兩個位點后才能誘導(dǎo)manXYZ降解［32］，阻止合成新的EIIABCDMan，從而阻止磷酸葡萄糖在菌體中進一步累積。

2.3 在碳源應(yīng)激中作用

碳是細(xì)菌生長必需的元素，是蛋白質(zhì)、核酸、脂類和酶類及菌體結(jié)構(gòu)的重要原料，同時又能為細(xì)菌提供能量。碳存儲調(diào)控因子A（CsrA）由 61 個氨基酸殘基組成的小分子翻譯調(diào)控蛋白，于1993年在大腸桿菌中被發(fā)現(xiàn)，能參與碳源代謝的調(diào)節(jié)［33］。一方面，CsrA通過與glgC（編碼糖原合成相關(guān)酶）和fbp（編碼果糖二磷酸激酶-1）mRNA的非翻譯區(qū)或翻譯起始區(qū)（如SD序列處）結(jié)合，降低mRNA的穩(wěn)定性和阻礙核糖體對mRNA的正常識別，抑制糖原合成及糖異生；另一方面，CsrA能與pykF、pfkB（編碼糖酵解丙酮酸激酶同工酶F和A）和pfkA、pfkB（編碼磷酸果糖激酶同工酶I 和 II）mRNA的5'非翻譯區(qū)堿基配對結(jié)合，增強mRNA的穩(wěn)定性，從而提高目標(biāo)蛋白質(zhì)的表達，促進糖酵解及乙酸代謝［34，35］。

那么，CsrA 的活性又是如何被調(diào)控的呢？當(dāng)細(xì)菌碳源不足時，細(xì)菌通過雙組分調(diào)節(jié)系統(tǒng)（two component regulatory system，TCS）上調(diào)sRNA CsrB和CsrC的轉(zhuǎn)錄水平［36］。CsrB和CsrC能特異地與CsrA蛋白分子結(jié)合，抑制CsrA蛋白的活性。因此CsrA蛋白對靶基因的調(diào)節(jié)作用減弱，間接抑制糖酵解并且激活糖異生途徑，從而增加菌體內(nèi)碳含量。當(dāng)碳源充足時，CsrB和CsrC能被CsrD通過RNaseE介導(dǎo)途徑降解［37］。

此外，在其他的細(xì)菌（如中華根瘤菌、軟腐歐文菌等）中也發(fā)現(xiàn)CsrA同源蛋白RsmA（repressor of secondary metabolism）［38］，二者在氨基酸序列上高度保守，現(xiàn)在統(tǒng)稱為CsrA/RsmA，且也含有功能類似于CsrB/C的sRNA-RsmY/Z。

新月柄桿菌是一種營養(yǎng)匱乏菌，它能在養(yǎng)分少的環(huán)境中生存，但是關(guān)于它如何在貧瘠的環(huán)境中生存的分子機制知之甚少。直到最近有研究發(fā)現(xiàn)，當(dāng)碳饑餓和進入穩(wěn)定期時，新月柄桿菌大量合成一種sRNA-CrfA，表明CrfA可能與新月柄桿菌碳應(yīng)激調(diào)控網(wǎng)絡(luò)有關(guān)。進一步研究發(fā)現(xiàn)CrfA 能顯著激活27種基因，這些靶基因中有1/3能編碼TonB-依賴受體家族［39］，其中TonB-依賴受體——CC3461與碳源麥芽糊精和n-乙酰氨基葡萄糖的吸收有關(guān)。CrfA能與CC3461核糖體結(jié)合位點上游的莖環(huán)結(jié)構(gòu)結(jié)合，抵抗核酸酶的降解，增強CC3461 mRNA穩(wěn)定性，從而促進新月柄桿菌對碳源的吸收。

2.4 在氨基酸應(yīng)激中的作用

由于氨基酸是蛋白質(zhì)合成不可或缺的成分，同時也是其他細(xì)胞內(nèi)成分如核苷酸和酶輔助因子的前體，因此氨基酸代謝必須被精確的調(diào)節(jié)。目前有研究發(fā)現(xiàn)小RNA也參與對氨基酸吸收的調(diào)控。例如，gcvB合成一種206 nt sRNA-GcvB，其能調(diào)控氨基酸和多肽轉(zhuǎn)運子相關(guān)基因的表達。gcvB的表達受GvcA和GcvR兩種轉(zhuǎn)錄因子調(diào)控。在氨基酸或者多肽剩余狀態(tài)下，GvcA蛋白結(jié)合于轉(zhuǎn)錄起始點的上游-29 至 -76區(qū)間上，激活gcvB的轉(zhuǎn)錄，GcvB得以表達［40］。GcvB能通過與多肽和氨基酸轉(zhuǎn)運相關(guān)基因（如dppABCDF操縱，gltI、argT、livK和sstT等）mRNA的5'UTR區(qū)結(jié)合抑制其翻譯，進而阻止氨基酸和多肽進入細(xì)胞內(nèi)［41］。反之，GcvA 和GcvR共同作用于GcvB mRNA，GcvB 的表達受到抑制，促進氨基酸和多肽的吸收。在缺乏嘌呤時，這種抑制作用被進一步增強［42］。

同時也有研究發(fā)現(xiàn)，CsrA也參與氨基酸代謝調(diào)節(jié)。在氨基酸饑餓時，CsrB和CsrC大量表達，當(dāng)向基礎(chǔ)培養(yǎng)基中加入酪蛋白水解物，胰蛋白胨或者純氨基酸混合物后，CsrB和 CsrC RNA的表達迅速減少［43］。然而通過氨基酸如何抑制CsrB和CsrC的表達機制尚不清楚。

3 展望

sRNA作為原核生物中新發(fā)現(xiàn)的一類基因表達調(diào)控因子，通過感應(yīng)外界環(huán)境條件，在轉(zhuǎn)錄后水平調(diào)節(jié)基因的表達，目前已成為新的研究熱點。雖然已分離的sRNA種類很多并不斷被人們認(rèn)知，但大多數(shù)sRNA功能未知，其作用機制及其調(diào)控網(wǎng)絡(luò)研究仍然處于初級階段。因此，深入認(rèn)識這些 sRNA可能開辟出一個新的研究領(lǐng)域。

細(xì)菌耐藥性的產(chǎn)生與細(xì)菌適應(yīng)生長環(huán)境緊密相連，其調(diào)控機制符合sRNA的作用特點。因此我們猜測細(xì)菌對抗生素的耐受可能與sRNA有關(guān)。然而目前大部分對細(xì)菌sRNA的研究主要都集中在大腸桿菌等模式生物，而針對耐藥致病菌的sRNA 研究幾乎是一片空白。本實驗室正在做相關(guān)方面的研究。隨著研究的深入，將會有越來越多的研究轉(zhuǎn)向sRNA對細(xì)菌耐藥性的調(diào)控機制，為臨床治療耐藥菌感染提供新的治療靶點和治療策略。

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（責(zé)任編輯 狄艷紅）

Research Progress on Regulatory Function of Bacterial Small RNA Resistance to Nutritional Stress

FU Zhu-qing1YU Yun-mei2WEN Xiao-jun3YUAN Wei-xi1ZHAO Zu-guo1
（1. Department of Microbiology and Immunology，Guangdong Medical College，Zhanjiang 524023；2. Central Hospital of PLA，Zhanjiang 524023；3. Hepatobiliary Surgery，Affiliated Hospital of Guangdong Medical College，Zhanjiang 524023）

The survival environment of bacteria is complex and volatile，and it is usually in a state of over-nutrition or denutrition. Therefore，bacteria only are able to survive by using sophisticated regulation system to timely and accurately adjust its gene expressions to adapt to the changing nutritional environment. Bacterial small RNA（small RNA，sRNA）playing an important role in regulating expression of bacterial gene in response to nutrient stress，is a class of RNA regulators discovered in bacteria in recent years. This article reviews the characters and the functions of bacterial small RNA resistance to nutrient stress.

bacterial small RNA；regulatory networks；nutrient stress

10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2016.03.003

2015-05-12

國家自然科學(xué)基金項目（30901286），東莞市社會科技發(fā)展項目（201350715200246）

付竹青，女，碩士研究生，研究方向：細(xì)菌中小RNA研究；E-mail：zhuziwell@163.com

趙祖國，男，博士，研究方向：微生物耐藥性及分子機制；E-mail：zuguozhao@126.com