姚楊 蘇杰 劉凱歌 徐銳

（西安醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院，西安 710077）

上調(diào)基因-11（URG11）生物信息學(xué)與功能分析

姚楊 蘇杰 劉凱歌 徐銳

（西安醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院，西安 710077）

應(yīng)用基因芯片技術(shù)獲取以穩(wěn)定轉(zhuǎn)染HBx基因的肝癌細(xì)胞HepG2（HepG2-X）Y，以及非轉(zhuǎn)染的肝癌細(xì)胞HepG2的差異表達(dá)基因，利用生物信息學(xué)方法對其進(jìn)行初步分析表明，該蛋白基因編碼673個氨基酸，預(yù)測分子量為17.06 kD，理論等電點(diǎn)為4.83，定位于細(xì)胞核，具有轉(zhuǎn)錄調(diào)控、生長因子、信號傳導(dǎo)的功能，同源性分析結(jié)果表明，其堿基序列與已經(jīng)報道的其他12個物種的相似率為76%-97%，且符合種屬之間的進(jìn)化關(guān)系。

乙肝相關(guān)性肝癌；生物信息學(xué)分析；URG11；HBx

目前，我國每年約有11-13萬人死于原發(fā)性肝癌，占全球肝癌死亡數(shù)的半數(shù)之多。在誘發(fā)肝細(xì)胞癌（hepatocellular carcinoma，HCC）的眾多因素中，乙型肝炎病毒（hepatitis B virus，HBV）感染占到50%以上［1-3］。流行病學(xué)和分子生物學(xué)研究認(rèn)為HBV是HBV相關(guān)性HCC發(fā)生的高危因素。HBx（Hepatitis B virus X protein）是HBV四個開放讀碼框架中X編碼的一種病毒多功能蛋白，研究發(fā)現(xiàn)X基因表達(dá)產(chǎn)物（HBx）在肝癌形成過程中參與肝癌血管生成，但作用機(jī)理并不明確［4，5］。URG11（upregulated gene11）是一個可被HBx蛋白上調(diào)的基因，能促進(jìn)肝癌細(xì)胞G1期向S期進(jìn)展，與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展和轉(zhuǎn)移密切相關(guān)的基因［6，7］。

URG11與腫瘤關(guān)系的相關(guān)的報道已經(jīng)很多，但并未對其進(jìn)行詳細(xì)的生物信息學(xué)分析。本實驗通過HBx基因穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的HepG2細(xì)胞為實驗組，非轉(zhuǎn)染的肝癌細(xì)胞HepG2為對照組，通過Agilent人全基因芯片篩選差異表達(dá)基因，通過生物信息學(xué)方法對其進(jìn)行分析，旨在為HBV相關(guān)肝癌的發(fā)生、轉(zhuǎn)移的診斷、靶基因治療和預(yù)后評估提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

人肝癌細(xì)胞系HepG2及HepG2-X均為本實驗室保存。10%小牛血清（四季青生物工程工司），RPMI-1640培養(yǎng)基（Gibco公司）；消化液（0.02%EDTA 0.25%胰蛋白酶）；DEPC水；Agilent人類全基因4×44K芯片；Agilent Microarray Scanner和Agilent feature extraction數(shù)據(jù)分析軟件。

1.2 方法

1.2.1 基因芯片 用Trizol［8］法分別抽取實驗組及對照組細(xì)胞總RNA，紫外分析及電泳檢測，合成有熒光標(biāo)記的cDNA探針并純化，將基因芯片和雜交探針分別在95℃水溶液中變性5 min，將探針加在芯片上，蓋玻片封片，65℃，10 r/min，滾動雜交17 h，實驗組和對照組分別雜交上樣量825 ng，60℃下用SCC和0.2%SDS分別洗2 min，室溫晾干。片結(jié)果采用Agilent Microarray Scanner進(jìn)行掃描，用Feature Extraction software 10.7讀取數(shù)據(jù)，最后采用Gene Spring Software 11.0進(jìn)行歸一化處理，所用的算法為Lowess。

1.2.2 序列的生物信息學(xué)分析 利用BLAST在線分析工具分別對GenBank 的非冗余核算數(shù)據(jù)庫和非冗余蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫序列進(jìn)行比對分析；采用NCBI的ORF finder［9］對URG11開放閱讀框進(jìn)行預(yù)測；利用ExPASy 的ProtParam［10］程序統(tǒng)計基因中各種氨基酸含量，并預(yù)測理論分子量和等電點(diǎn)；應(yīng)用ProtScale［11］程序進(jìn)行蛋白質(zhì)的疏水性分析；跨膜結(jié)構(gòu)域分析采用TMHMM軟件預(yù)測［12］。信號肽采用SignalP3.0server工具分析［13］。磷酸化位點(diǎn)分析采用蛋白質(zhì)亞細(xì)胞定位NetPhos2.0 Server在線分析工具［11］。采用在線工具（http：//psort nibb.ac.jp/form. html）預(yù)測，通過NCBI數(shù)據(jù)庫GenBank 分析蛋白質(zhì)保守結(jié)構(gòu)域；采用Protfun在線工具預(yù)測URG11的功能分類［14］；采用同源模型服務(wù)軟件SWISSMDEL［15，16］預(yù)測URG11的三維結(jié)構(gòu)；采用MEGA5.0軟件進(jìn)行系統(tǒng)進(jìn)化樹的構(gòu)建。

2 結(jié)果

2.1 開放閱讀框分析

本研究利用NCBI ORF Finder對URG11在線分析表明其在+1閱讀框有最長的開放性讀碼框，長度為2 020 bp編碼673個氨基酸殘基（圖1）。

圖1 人URG11基因序列的ORF分析

2.2 保守結(jié)構(gòu)域預(yù)測

利用NCBIBLAST 工具進(jìn)行保守區(qū)分析，發(fā)現(xiàn)URG11氨基酸序列中含有4個保守的作用位點(diǎn)，如圖2所示。

2.3 理化性質(zhì)分析

利用ExPASy 在線工具ProtParam對URG11基因編碼產(chǎn)物的理化性質(zhì)預(yù)測結(jié)果表明，其中含量最多的兩種氨基酸是Cys（C）和Gly（G），所占比例分別為34.4%和27.8%理論分子量為17.06 kD，理論等電點(diǎn)為4.83。

根據(jù)蛋白質(zhì)親水性/疏水性分析原理，利用ExPASy ProtScal程序，對人URG11基因編碼產(chǎn)物的疏水性進(jìn)行分析，結(jié)果（圖3）顯示，整條多肽鏈表現(xiàn)為親水性，由此可知人URG11是一種可溶性蛋白。

2.4 跨膜結(jié)構(gòu)域分析

TMHMM綜合了跨膜區(qū)疏水性、螺旋長度和膜蛋白拓?fù)鋵W(xué)限制等性質(zhì)，用馬氏模型對跨膜區(qū)及膜內(nèi)外區(qū)進(jìn)行整體預(yù)測。本實驗利用TMHMM對URG11進(jìn)行跨膜結(jié)構(gòu)的分析，結(jié)果表明此蛋白不含跨膜位點(diǎn)。

圖2 保守域預(yù)測結(jié)果

圖3 ProtScal程序分析URG11編碼產(chǎn)物的疏水性結(jié)果

圖4 URG11跨膜結(jié)構(gòu)預(yù)測產(chǎn)物信號肽預(yù)測

信號肽（signal peptide）是一段由3-60個氨基酸組成的短肽序列，它是引導(dǎo)新合成蛋白質(zhì)被輸送至目的地點(diǎn)的識別信號，也被稱為靶標(biāo)信號。利用SignalP 3.0 Server工具對人URG11信號肽進(jìn)行預(yù)測，結(jié)果（圖5）表明，該蛋白不含信號肽。

圖5 URG11編碼產(chǎn)物氨基酸序列信號肽預(yù)測

2.5 磷酸化位點(diǎn)分析

磷酸化和去磷酸化在多種真核細(xì)胞中具有重要的作用，如新陳代謝、細(xì)胞分裂及信號轉(zhuǎn)導(dǎo)等，利用NetPhos2.0 Server在線分析工具對URG11磷酸化位點(diǎn)分析，結(jié)果（圖6）發(fā)現(xiàn)有29個絲氨酸和12個蘇氨酸可能被磷酸化。

2.6 編碼產(chǎn)物功能預(yù)測及分析

通過Protfun預(yù)測URG11編碼產(chǎn)物的功能，從分析結(jié)果（表1）可知，URG11具有轉(zhuǎn)錄調(diào)控、生長因子、信號傳導(dǎo)的功能，可能性分別為0.854、0.476、0.365。

2.7 URG11保守域預(yù)測與高級結(jié)構(gòu)分析

通過Swiss-Modeling軟件對URG11的氨基酸序列進(jìn)行蛋白質(zhì)三維結(jié)構(gòu)的同源建模，獲得其氨基酸序列的預(yù)測三級結(jié)構(gòu)（圖7）。

2.8 同源比對和系統(tǒng)進(jìn)化樹分析

將URG11氨基酸序列與NCBI數(shù)據(jù)庫在核苷酸和蛋白質(zhì)一級結(jié)構(gòu)水平上進(jìn)行同源性比較，結(jié)果（表2）表明其在進(jìn)化中十分保守，與其他12種物種URG11氨基酸水平的相似性為76%-97%。同時也反映了URG11編碼產(chǎn)物在不同物種結(jié)構(gòu)上的穩(wěn)定性對生物體功能的重要性。根據(jù)URG11基因特征序列和保守序列在GenBank數(shù)據(jù)庫進(jìn)行檢索，物種間系統(tǒng)進(jìn)化樹（圖8）分析表明，白頰長臂猿、蘇門答臘猩猩、獼猴的親緣關(guān)系較近。

圖6 NetPhos2.0 Server預(yù)測磷酸化位點(diǎn)

表1 URG11編碼產(chǎn)物功能分析結(jié)果

圖7 URG11氨基酸序列高級結(jié)構(gòu)分析結(jié)果

表2 URG11與其他近緣物種該蛋白基因氨基酸序列同源性

圖8 不同物種URG11編碼產(chǎn)物系統(tǒng)發(fā)育樹

3 討論

URG11最早是利用抑制消減雜交及全長PCR擴(kuò)增技術(shù)克隆的一個基因，該基因定位于人11號染色體長臂，能促進(jìn)肝癌細(xì)胞系的增殖、分化并促進(jìn)肝癌細(xì)胞裸鼠體內(nèi)的成瘤能力，更重要的是將此基因轉(zhuǎn)染入腫瘤細(xì)胞，可促進(jìn)B-連接蛋白（B-catenin）的表達(dá)。B-catenin不僅在維持細(xì)胞正常形態(tài)及介導(dǎo)細(xì)胞運(yùn)動中發(fā)揮重要作用，還是與腫瘤發(fā)生及發(fā)展密切相關(guān)的Wnt信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路中的關(guān)鍵分子［17，18］。Peng 等［19］發(fā)現(xiàn)URG11通過上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化促進(jìn)胰腺癌的侵襲，從而導(dǎo)致預(yù)后效果不佳。Fan等［20］發(fā)現(xiàn)抑制URG11，HCC細(xì)胞可通過下調(diào)G1-S期相關(guān)蛋白抑制細(xì)胞增殖，通過下調(diào)BCL-2誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。

雖然關(guān)于URG11基因的報道已經(jīng)很多，但并未對其進(jìn)行詳細(xì)的生物信息學(xué)分析。本研究通過基因芯片技術(shù)篩選出HBx參與的乙肝相關(guān)性肝細(xì)胞性癌差異表達(dá)基因URG11，對其同源性比較結(jié)果表明，其堿基序列與已經(jīng)報道的其他12個物種的相似率為76%-97%，與其他物種比較，URG11基因氨基酸序列表現(xiàn)出高度保守性，以保證其執(zhí)行重要的生物學(xué)功能。利用MeGa5.0軟件基因NJ法構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹，人URG11與大猩猩、黑猩猩、普通狨該基因的分子進(jìn)化距離最近，親緣關(guān)系最密切，這與動物學(xué)分類結(jié)果一致，這種同源性在一定程度上代表著物種親緣關(guān)系的遠(yuǎn)近，同時也反映了URG11編碼產(chǎn)物在不同物種結(jié)構(gòu)上的穩(wěn)定性對生物體功能的重要性。隨著對URG11結(jié)構(gòu)和功能的深入研究，針對URG11的干擾和抑制可能成為一種新型的臨床分子靶點(diǎn)抗癌藥物。

4 結(jié)論

本研究結(jié)合分子生物學(xué)技術(shù)和生物信息學(xué)分析，通過基因芯片技術(shù)篩選出HBx參與的乙肝相關(guān)性肝細(xì)胞性癌差異表達(dá)基因URG11，該基因編碼673個氨基酸，預(yù)測分子量為17.06 kD，理論等電點(diǎn)為4.83，同源性分析結(jié)果表明，其堿基序列與已經(jīng)報道的其他12個物種的相似率為76%-97%，且符合種屬之間的進(jìn)化關(guān)系。亞細(xì)胞定位于細(xì)胞核的可能性大，具有轉(zhuǎn)錄調(diào)控、生長因子、信號傳導(dǎo)的功能。

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（責(zé)任編輯 李楠）

Function Analysis of Up-regulated Gene（URG11）Based on Its Bioinformatics

YAO Yang SU Jie LIU Kai-ge Xu Rui
（The First Affiliated Hospital of Xi'an Medical University，Xi'an 710077）

This work was to obtain differentially-expressed genes with hepatoma cell HepG（HepG2-X）Y of stable transfected HBx and non-transfected hepatoma cell HepG2using gene chip technology. The preliminary bioinformatic analysis demonstrated that the gene of the protein encoded 673 amino acids with a predicted molecular weight of 17.06 kD and pI 4.83. URG11 were mainly localized in the nuclear and played the role in transcription regulation，growth factor and signal transducer，and it showed 76%-97% identity with the others reported 12 species，as well as was consistent with the evolutionary relationship between species.

HBV-related hepatocellular carcinoma；bioinformatics；URG11；HBx

10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2016.03.032

2015-06-04

西安市科技計劃項目（SF1418（6）），西安醫(yī)學(xué)院科研項目（12FZ15），西安醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院科研項目（XYFY11-14）

姚楊，碩士研究生，研究方向：生化與分子；E-mail：yaoyang1220@sina.com