王奇 王林風(fēng) 閆德冉 張斐洋 劉天天 吳靜波

（河南天冠企業(yè)集團(tuán)有限公司 車(chē)用生物燃料技術(shù)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，南陽(yáng) 473000）

玉米秸稈酶水解過(guò)程中的酶復(fù)配條件優(yōu)化

王奇 王林風(fēng) 閆德冉 張斐洋 劉天天 吳靜波

（河南天冠企業(yè)集團(tuán)有限公司 車(chē)用生物燃料技術(shù)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，南陽(yáng) 473000）

降低酶解成本是纖維素乙醇生產(chǎn)的關(guān)鍵。利用酶復(fù)配技術(shù)優(yōu)化蒸汽爆破處理后玉米秸稈的酶水解工藝條件，以提高纖維素的轉(zhuǎn)化率。通過(guò)單因素實(shí)驗(yàn)和正交實(shí)驗(yàn)，研究了纖維素酶、木聚糖酶和β-葡萄糖苷酶對(duì)酶解效率的影響規(guī)律。結(jié)果表明，汽爆玉米秸稈，纖維素含量達(dá)42.21%，半纖維素僅為3.65%。纖維素酶對(duì)酶解過(guò)程起決定性作用，添加40 FPU/g時(shí)，酶解率為75.45%；木聚糖酶可促使更多的纖維素暴露出來(lái)，添加1 500 IU/g時(shí)，酶解率最高為78.03%；β-葡萄糖苷酶有助于消除纖維二糖積累造成的反饋抑制，用量40 IU/g時(shí)，纖維二糖濃度為0.330 4 g/100 mL，酶解率達(dá)76.45%。正交實(shí)驗(yàn)確定最佳工藝為：纖維素酶用量30 FPU/g，木聚糖酶用量800 IU/g，β-葡萄糖苷酶用量40 IU/g；該條件下，進(jìn)行底物質(zhì)量濃度25%的驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)，葡萄糖達(dá)9.3 g/100 mL，若用單一天冠纖維素酶，葡萄糖僅5.9 g/100 mL，提高了57.63%。三種酶的影響順序?yàn)椋豪w維素酶＞木聚糖酶＞β-葡萄糖苷酶。

玉米秸稈；纖維素酶；木聚糖酶；β-葡萄糖苷酶；復(fù)合配方

生物質(zhì)（農(nóng)業(yè)廢棄物、草本和木本植物等）是世界上儲(chǔ)量豐富、廉價(jià)、應(yīng)用潛能巨大的可再生能源。我國(guó)具有豐富的生物質(zhì)資源，據(jù)統(tǒng)計(jì)2010年秸稈理論資源量為8.4×108t（折合4×108t標(biāo)煤），僅玉米秸稈約2.73×108t。加快推進(jìn)秸稈能源化利用如生產(chǎn)纖維乙醇，有助于減少溫室氣體CO2的排放，緩解化石燃料短缺的壓力，實(shí)現(xiàn)碳減排目標(biāo)，符合可持續(xù)能源發(fā)展戰(zhàn)略［1］。

通常纖維乙醇的生產(chǎn)過(guò)程包括原料的預(yù)處理、酶水解、發(fā)酵和蒸餾，其中酶解是整個(gè)纖維乙醇生產(chǎn)的主要技術(shù)和經(jīng)濟(jì)瓶頸［2］。降低酶解糖化過(guò)程的成本、提高酶解率及減少酶用量成為重要因素。纖維素酶，是能夠?qū)⒗w維素降解為葡萄糖單體的一種多組分復(fù)雜酶體系，主要組分包括內(nèi)切型-β-1，4葡聚糖酶（Cx酶）、外切型-β-1，4葡聚糖酶（C1酶）、β-1，4-葡萄糖苷酶（CB）。纖維素酶的作用機(jī)制目前普遍認(rèn)可的是協(xié)同作用理論。首先內(nèi)切酶在纖維素內(nèi)部的非結(jié)晶區(qū)進(jìn)行切割，隨機(jī)水解β-1，4-糖苷鍵，形成外切酶所需新的游離末端，然后由外切酶從多糖鏈的還原端或非還原端切下纖維二糖單位，最后由β-葡萄糖苷酶將纖維二糖降解為葡萄糖［3］。酶解過(guò)程需要這3種組分的彼此協(xié)調(diào)配合，且各組分配比要恰當(dāng)。

纖維素酶生產(chǎn)菌株有木霉屬（Trichoderma）、曲霉屬（Aspergillus）和青霉屬（Penicillium）。應(yīng)用較多的是木霉屬中的里氏木霉（Trichoderma reesei），它可發(fā)酵得到高活力的內(nèi)切葡聚糖酶和外切葡聚糖酶，但所產(chǎn)生的β-葡萄糖苷酶的活性較差，致使纖維二糖不能及時(shí)的轉(zhuǎn)化為葡萄糖而累積，對(duì)酶解過(guò)程形成明顯的反饋抑制作用［4］。Selig等［5］研究了纖維素酶水解過(guò)程中加入木聚糖酶對(duì)酶解率的影響，未進(jìn)行酶系組分和配比的深入研究。有關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道［6］，混合使用不同微生物生產(chǎn)的酶有利于提高水解效率。在T. reesei 酶體系中加入β-葡萄糖苷酶比不加β-葡萄糖苷酶的糖化效果好。

關(guān)于酶復(fù)配技術(shù)的工藝優(yōu)化研究報(bào)道并不多。本研究以蒸汽爆破處理后的玉米秸稈作為考察對(duì)象，擬通過(guò)單因素實(shí)驗(yàn)和正交實(shí)驗(yàn)相結(jié)合的方式來(lái)優(yōu)化酶復(fù)配技術(shù)的工藝參數(shù)，系統(tǒng)的研究纖維素酶、木聚糖酶和β-葡萄糖苷酶對(duì)酶解效率影響的規(guī)律，以期獲得最佳的纖維素酶配系比，進(jìn)而提高還原糖濃度。該復(fù)配技術(shù)的建立可為纖維素乙醇的工業(yè)化生產(chǎn)中的酶解工藝提供有益的啟示和參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 材料和試劑 玉米秸稈收購(gòu)于南陽(yáng)郊區(qū)農(nóng)田。纖維素酶和木聚糖酶由河南天冠纖維乙醇有限公司生產(chǎn)，纖維素酶的濾紙酶活為580 FPU/mL，木聚糖酶酶活23 000 IU/mL，β-葡萄糖苷酶購(gòu)于康地恩公司其酶活為6 880 IU/mL，復(fù)合諾維信酶購(gòu)于諾維信公司，其他所用試劑均為分析純。

1.1.2 儀器和設(shè)備 電子恒溫水浴鍋，精密增力定時(shí)電動(dòng)攪拌器，電熱鼓風(fēng)干燥箱，SHB-III循環(huán)水式多用真空泵，MJ33快速水分測(cè)定儀，SXL-1002程控箱式電爐，精密電子天平，計(jì)量稱(chēng)，SBA-40C型生物傳感分析儀，新型密封式粉碎機(jī)，手提式蒸汽滅菌鍋，耐壓管，JSM-6700F型掃描電子顯微鏡，高效液相色譜儀Agilent 1200。

1.2 方法

1.2.1 原料蒸汽爆破預(yù)處理 將收購(gòu)的玉米秸稈經(jīng)自然風(fēng)干、粉碎后，裝入蒸汽爆破罐，通入高溫蒸汽迅速升高罐壓至1.5-1.8 MPa，維持時(shí)間20 min后，通過(guò)瞬間泄壓來(lái)實(shí)現(xiàn)原料的組分分離和結(jié)構(gòu)變化；秸稈爆破后經(jīng)水洗脫毒，進(jìn)入立式板框壓縮，收集并用粉碎機(jī)粉碎至粒徑≤4 mm以供實(shí)驗(yàn)用。測(cè)定其中纖維素、半纖維素和木質(zhì)素的含量。

1.2.2 玉米秸稈酶解實(shí)驗(yàn) 底物濃度設(shè)計(jì)為25%（質(zhì)量分?jǐn)?shù)），300 g的體系，初始投料量為總物料的1/6，每次補(bǔ)料剩余量的1/10，分10次補(bǔ)完，用0.05 mol/L的檸檬酸緩沖溶液調(diào)節(jié)酶解初始pH為4.8-5.0，根據(jù)實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)表添加所需酶液，初始加入總酶量的2/3，補(bǔ)料6次后加入剩余的酶，將料、酶、水混合均勻后，在50℃的電子恒溫水浴鍋中以120 r/min的轉(zhuǎn)速進(jìn)行酶解。酶解48 h 后將酶解液離心分離，取上清液測(cè)葡萄糖含量并進(jìn)HPLC以分析其中木糖和纖維二糖的含量。

1.2.2.1 單因素實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì) 分別進(jìn)行影響因子纖維素酶（A）、木聚糖酶（B）和β-葡萄糖苷酶（C）的添加梯度實(shí)驗(yàn)，具體設(shè)計(jì)如表1所示。

1.2.2.2 正交優(yōu)化設(shè)計(jì) 在前面單因素實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上，初步確定纖維素酶（A）、木聚糖酶（B）和β-葡萄糖苷酶（C）的變化區(qū)間，選用五因素四水平的正交表進(jìn)行優(yōu)化實(shí)驗(yàn)（表2），確定酶解最佳工藝條件。

表1 單因素實(shí)驗(yàn)水平設(shè)計(jì)（IU/g絕干物料）

表2 正交實(shí)驗(yàn)水平設(shè)計(jì)（IU/g絕干物料）

1.2.3 分析方法

1.2.3.1 酶活的測(cè)定 纖維素酶的酶活測(cè)定根據(jù)IUPAC推薦的濾紙酶活法進(jìn)行［7］，一個(gè)濾紙酶活的國(guó)際單位（FPU）為在標(biāo)準(zhǔn)條件下，酶促反應(yīng)中1 min生成1 μmol葡萄糖所需的酶量。

木聚糖酶酶活的測(cè)定參照文獻(xiàn)［8］中的檢測(cè)方法并加以改進(jìn)，木聚糖酶活力單位（IU）是指在標(biāo)準(zhǔn)條件下，1 min催化1.2%的木聚糖底物水解生成1 μmol木糖所需酶量。

β-葡萄糖苷酶酶活采用對(duì)硝基苯基-β-D-吡喃葡萄糖苷（pNPG）為底物進(jìn)行測(cè)定［9］。

1.2.3.2 秸稈分析 玉米秸稈處理前后纖維素、半纖維素和木質(zhì)素含量的測(cè)定按照美國(guó)可再生能源實(shí)驗(yàn)室（NREL）標(biāo)準(zhǔn)方法［10］進(jìn)行。通過(guò)掃描電鏡SEM觀察秸稈爆破前后表面結(jié)構(gòu)的改變情況。水分用水分測(cè)定儀測(cè)定。

1.2.3.3 酶解液成分分析 酶解液中各種糖組分含量用高效液相色譜（HPLC）進(jìn)行定量分析，操作條件：Zorbax Eclipse XDB-C18色譜柱，流動(dòng)相：0.55 mL色譜純濃H2SO4用純水定容至1 000 mL；流速：0.5 mL/min；柱溫：65℃，柱壓：42 bar。葡萄糖含量測(cè)定采用山東省科學(xué)院生物研究所研制的SBA-40C型生物傳感分析儀。

1.2.3.4 計(jì)算公式 酶解率（%）=（葡萄糖含量×0.9）/（秸稈質(zhì)量×固形物×纖維素含量）×100%，其中，0.9為葡萄糖與纖維素的折算系數(shù)。固形物=1-含水率。

2 結(jié)果

2.1 玉米秸稈的化學(xué)組分

玉米秸稈經(jīng)蒸汽爆破處理后，能實(shí)現(xiàn)原料的組分分離和結(jié)構(gòu)變化，纖維素內(nèi)部的氫鍵被打斷，有序結(jié)構(gòu)發(fā)生重排，游離出新的羥基，聚合度降低，增加纖維素酶的吸附能力。表3顯示，秸稈汽爆后，半纖維素脫乙酰基大部分被降解生成可溶性成分，含量明顯減少，僅剩3.65%；纖維素相對(duì)百分含量達(dá)42.21%，原料可水解部分增多；木質(zhì)素含量相對(duì)有所提高。SEM結(jié)構(gòu)（圖1）顯示，未處理秸稈，結(jié)構(gòu)緊湊，排列致密，爆破過(guò)程中因受到類(lèi)酸性水解作用、熱降解和機(jī)械斷裂作用，纖維素結(jié)晶結(jié)構(gòu)被破壞，木質(zhì)素發(fā)生解聚、軟化與纖維分離，物料孔隙率增大，便于后續(xù)酶解的進(jìn)行。

表3 玉米秸稈主要組分的百分含量（%，干基）

圖1 玉米秸稈SEM結(jié)構(gòu)圖

2.2 纖維素酶添加梯度

考慮到纖維素酶糖化過(guò)程受纖維二糖的抑制影響，添加足量β-葡萄糖苷酶。由圖2知，纖維素酶的添加量對(duì)玉米秸稈酶解過(guò)程起決定性作用，直接影響酶解效果的好壞，纖維二糖和木糖的生成量基本穩(wěn)定。隨著纖維素酶用量的增加，酶解率迅速提高，且增長(zhǎng)速度先快后慢，漸漸趨向平衡，纖維素酶添加量40 FPU/g絕干秸稈時(shí)，酶解率為75.45%，繼續(xù)添加纖維素酶對(duì)玉米秸稈纖維素轉(zhuǎn)化率作用影響有所增大但變化不顯著，添加80 FPU/g，酶解率為77.57%，提高僅2.12%。原因主要是，酶解反應(yīng)是液固非均相反應(yīng)，液相中的酶分子首先吸附在底物纖維素表面上，二者形成不穩(wěn)定的化合物，進(jìn)而降解生成還原糖，當(dāng)吸附位點(diǎn)全部被占據(jù)達(dá)到飽和再繼續(xù)增加酶量，對(duì)整個(gè)過(guò)程起不到明顯的促進(jìn)作用。還可能是反應(yīng)時(shí)間延長(zhǎng)，酶出現(xiàn)變性失活；產(chǎn)物還原糖的積累等。從轉(zhuǎn)化率和成本綜合考慮，酶法糖化工藝，要盡可能降低酶成本，減少酶用量。因此，選擇合適的酶用量至關(guān)重要。

圖2 不同纖維素酶添加量對(duì)酶解的影響

2.3 木聚糖酶添加梯度

在纖維素酶用量30 FPU/g，β-葡萄糖苷酶量60 IU/g的條件下，分析不同木聚糖酶添加量對(duì)酶解率的影響。結(jié)果（圖3）顯示，起初加入木聚糖酶，酶解率開(kāi)始增大，超過(guò)500 IU/g后，增速變緩，達(dá)到1 500 IU/g時(shí)，最高為78.03%，之后略有下降的趨勢(shì)?？赡苁俏锪现械陌肜w維素被木聚糖酶降解，其對(duì)纖維素的包覆作用減弱，纖維素酶和纖維素的液-固異相反應(yīng)的空間位阻降低，更多的纖維素被暴露出來(lái)，加快了纖維素酶與底物的吸附、擴(kuò)散速度和纖維素酶的水解速率，進(jìn)而增加酶解率；木聚糖酶超過(guò)2 000 IU/g，可能吸附到纖維素表面上，和纖維素酶形成競(jìng)爭(zhēng)位點(diǎn)，阻礙纖維素酶的水解程度。木糖含量隨木聚糖酶加入量的增加逐漸增大，進(jìn)一步說(shuō)明半纖維被降解，木聚糖酶對(duì)酶解的協(xié)同增強(qiáng)作用。纖維二糖的變化和酶解率曲線基本相一致。

圖3 不同木聚糖酶用量對(duì)酶解的影響

圖4 不同β-葡萄糖苷酶添加量對(duì)酶解的影響

2.4 β-葡萄糖苷酶添加梯度

為降低酶解過(guò)程中因纖維二糖的富集造而成的反饋抑制，增加纖維底物的酶解效率，需向酶解體系中補(bǔ)加纖維二糖酶以提高纖維二糖酶的活力，增強(qiáng)酶解效果。纖維素酶添加30 FPU/g，木聚糖酶用量60 IU/g的條件下，改變?chǔ)?葡萄糖苷酶的加入量考慮其對(duì)酶解的影響。結(jié)果（圖4）顯示，未加β-葡萄糖苷酶，纖維二糖濃度為0.720 1 g/100 mL，酶解率僅為60.88%，說(shuō)明纖維二糖的累積對(duì)酶解過(guò)程形成較大的抑制作用。隨著β-葡萄糖苷酶用量的提高，纖維二糖含量不斷減少，糖化率逐漸增大，慢慢的趨向穩(wěn)定。當(dāng)加入40 IU/g時(shí)，纖維二糖0.330 4 g/100 mL，酶解率達(dá)76.45%，提高了15.57%，超過(guò)40 IU/g后，基本達(dá)到飽和。因此β-葡萄糖苷酶的使用對(duì)整個(gè)過(guò)程中酶活的發(fā)揮影響較大。

表4 正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)與結(jié)果

2.5 正交優(yōu)化結(jié)果

在單因素實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上，選L16（45）正交表進(jìn)一步考查纖維素酶（A）、木聚糖酶（B）和β-葡萄糖苷酶（C）對(duì)酶解的綜合影響，實(shí)驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表4。

從極差R的大小看，3種酶的影響先后順序?yàn)椋豪w維素酶＞木聚糖酶＞β-葡萄糖苷酶，酶解率最高的組合為A4B4C3，即纖維素酶添加量40 FPU/g，木聚糖酶1 200 IU/g，β-葡萄糖苷酶40 IU/g。結(jié)合經(jīng)濟(jì)性分析，降低酶解成本在纖維乙醇生產(chǎn)中是關(guān)鍵，確定最佳配比條件：纖維素酶添加30 FPU/g，木聚糖酶800 IU/g，β-葡萄糖苷酶40 IU/g；在該條件進(jìn)行底物濃度25%（W/W）的酶解，并與諾維信酶（添加40 IU/g）進(jìn)行對(duì)比實(shí)驗(yàn)，諾維信葡萄糖為9.8 g/100 mL，復(fù)配后葡萄糖達(dá)9.3 g/100 mL，兩者相差5.1%，若只用天冠纖維素酶，葡萄糖僅5.9 g/100 mL，提高了57.63%。

3 討論

纖維素酶是由三種組分組成的復(fù)合酶系，各組分間如何發(fā)揮作用，目前普遍認(rèn)可的酶解機(jī)制是協(xié)同作用模型。在協(xié)同降解過(guò)程中首先由CX酶在纖維素的內(nèi)部起作用，在纖維素的非結(jié)晶部位進(jìn)行切割產(chǎn)生新的末端，然后再由C1酶以纖維二糖為單位從末端進(jìn)行水解，最后由CB酶將纖維二糖水解為葡萄糖［11，12］。纖維素酶各組分間的比例以及彼此相互協(xié)同作用對(duì)整個(gè)酶解過(guò)程影響較大，纖維素酶多組分的協(xié)同作用比單一組分的水解效果要顯著。

相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道［13］液體酶制劑復(fù)配時(shí)，除了加入水，還加入了穩(wěn)定劑來(lái)控制水的活度。本實(shí)驗(yàn)酶的復(fù)配是料水混勻后同時(shí)加入不同3種酶進(jìn)行酶解。Nidetzky等［14］研究了由里氏木霉發(fā)酵產(chǎn)生的纖維素酶各組分間的相互協(xié)同作用和最佳配合比例，結(jié)果表明，最大的協(xié)同作用出現(xiàn)在β-葡萄糖苷酶和內(nèi)切葡聚糖酶之間，纖維素酶各組分是按次序發(fā)揮水解作用的。Berlin等［15］對(duì)酶復(fù)配優(yōu)化木質(zhì)纖維素水解進(jìn)行了研究發(fā)現(xiàn)，添加木聚糖酶、果膠酶、β-葡萄糖苷酶可明顯促進(jìn)酶解，所需的總蛋白大約減少兩倍及葡萄糖和木糖轉(zhuǎn)化率分別為99%和88%，有助于改善酶解和降低水解過(guò)程成本。林增祥等［16］采用混料設(shè)計(jì)分析了兩種不同廠家的纖維素酶和木聚糖酶的復(fù)配對(duì)酶解影響，研究得出經(jīng)過(guò)多酶復(fù)配比使用單一纖維素水解酶的效率增加了約40%，這對(duì)提高水解酶的水解率、降低成本有重要意義。本研究通過(guò)單因素實(shí)驗(yàn)和正交實(shí)驗(yàn)，系統(tǒng)全面地研究了天冠集團(tuán)生產(chǎn)的纖維素酶、木聚糖酶和購(gòu)買(mǎi)的β-葡萄糖苷酶進(jìn)行復(fù)配對(duì)酶解的影響規(guī)律，得出最優(yōu)添加量，指導(dǎo)實(shí)際生產(chǎn)應(yīng)用。

纖維乙醇生產(chǎn)過(guò)程中酶法糖化工段關(guān)鍵是降低纖維素酶的生產(chǎn)成本、投加量和提高酶解效率。多酶復(fù)配技術(shù)目的是優(yōu)化不同酶添加量及酶系相互協(xié)調(diào)作用來(lái)調(diào)控酶系的比例，使酶解更充分進(jìn)而減小酶用量并降低成本。纖維素酶的添加量有最大值，因?yàn)槔w維素酶作為一種生物催化劑，與底物的吸附作用有一定飽和度，定量的纖維素分子能與酶分子相結(jié)合的位點(diǎn)有限，當(dāng)這些結(jié)合點(diǎn)全部被纖維素酶分子所占據(jù)后，再增加纖維素酶的用量，對(duì)酶解效率的提高影響不大［17，18］。Briggs-Haldane穩(wěn)態(tài)學(xué)說(shuō)［19］：

開(kāi)始提高酶量［E］，整個(gè)反應(yīng)向右邊推進(jìn)，生成中間復(fù)合物［ES］，隨著［ES］的累積不斷生成產(chǎn)物［P］，但在酶量［E］過(guò)多時(shí)，反應(yīng)向左進(jìn)行，抑制產(chǎn)物的生成，降低了酶解效率。添加木聚糖酶能充分水解底物中的半纖維，使更多纖維素暴露于表面，增加了酶與纖維素的接觸幾率［20］。

秸稈汽爆后結(jié)構(gòu)發(fā)生變化，含有42.21%的纖維素，少量的半纖維素和木質(zhì)素，若只用纖維素酶，酶解效果較差，糖度較低；加入木聚糖酶可降低液-固異相反應(yīng)的空間位阻，消除半纖維素的包覆作用，避免對(duì)酶的無(wú)效吸附，暴露更多纖維素與酶充分接觸；β-葡萄糖苷酶加入能消除纖維二糖的累積對(duì)葡聚糖的反饋抑制作用，便于纖維二糖順利轉(zhuǎn)化為葡萄糖，提高酶解效率。

因?yàn)槠斩捲诿附到夥磻?yīng)中會(huì)出現(xiàn)產(chǎn)物反饋抑制影響，所以酶系各組分間的用量經(jīng)優(yōu)化后才能避免出現(xiàn)某種酶系含量較多、底物消耗過(guò)快而不能充分徹底發(fā)揮酶解作用，或者某一酶系含量較少出現(xiàn)底物富集，引起整個(gè)酶解過(guò)程不順暢，降解速率降低。

4 結(jié)論

玉米秸稈經(jīng)蒸汽爆破處理，纖維素含量達(dá)42.21%，半纖維素分解含量為3.65%。SEM顯示秸稈致密緊湊結(jié)構(gòu)被破壞，變得疏松多孔隙，易被纖維素酶吸附進(jìn)行酶解。

單因素分析多酶復(fù)配技術(shù)對(duì)酶解的影響。纖維素酶對(duì)酶解過(guò)程起決定性作用，β-葡萄糖苷酶能降低纖維二糖的富集而造成的反饋抑制，促進(jìn)酶解的進(jìn)行，木聚糖酶降解底物中的半纖維素，纖維素更多的暴露，加快纖維素酶與底物的吸附、擴(kuò)散速度，增加酶解率。纖維素酶添加量40 FPU/g（絕干秸稈）時(shí)，酶解率為75.45%；木聚糖酶添加達(dá)1 500 IU/g時(shí)，酶解率最高為78.03%；β-葡萄糖苷酶加入40 IU/g時(shí)，纖維二糖0.330 4 g/100 mL，酶解率達(dá)76.45%。

正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示三種酶影響先后順序?yàn)椋豪w維素酶＞木聚糖酶＞β-葡萄糖苷酶。結(jié)合經(jīng)濟(jì)性考慮最佳組合為：纖維素酶用量30 FPU/g，木聚糖酶800 IU/g，β-葡萄糖苷酶40 IU/g。在此條件下，進(jìn)行底物濃度25%（W/W）的復(fù)配實(shí)驗(yàn)，葡萄糖達(dá)9.3 g/100 mL，若用單一天冠纖維素酶，葡萄糖僅5.9 g/100 mL，提高了57.63%。

不同酶復(fù)配是增加生物質(zhì)酶解效率的重要方法，經(jīng)過(guò)復(fù)配后酶間的相互協(xié)調(diào)作用明顯增強(qiáng)。

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（責(zé)任編輯 李楠）

The Optimization of Enzyme Complex Formulation for Enzymatic Hydrolysis of Corn Stalk

WANG Qi WANG Lin-feng YAN De-ran ZHANG Fei-yang LIU Tian-tian WU Jing-bo
（State Key Laboratory of Motor Vehicle Biofuel Technology，Henan Tianguan Group Co.，Ltd.，Nanyang 473000）

Reducing the cost of enzymatic hydrolysis is the key step in bio-ethanol production from cellulose. In order to enhance the conversion of cellulose into ethanol，the enzymatic hydrolysis condition of corn stalk pretreated by steam explosion was optimized by enzyme complex formulation. The affecting rules of cellulase，xylanase and β-glycosidase on enzymatic hydrolysis efficiency were studied by singlefactor experiment and orthogonal test. The results showed that the cellulose content of steam-exploded corn stalk reached 42.21%，and the hemicellulose content was only 3.65%. Cellulase was crucial to the enzymatic hydrolysis process，the enzymatic hydrolyzation yield was 75.45% when added by 40 FPU/g. Xylanase promoted more cellulose exposed，enzymatic hydrolyzation yield reached 78.03% when added by 1 500 IU/g. β-glucosidase was conducive to eliminate the feedback inhibition caused by cellobiose，when dosage was in 40 IU/g，the concentration of cellobiose was 0.330 4 g/100 mL，enzymatic hydrolyzation yield reached 76.45%. The optimal conditions for the process by orthogonal experiment were as follows：cellulase 30 FPU/g，xylanase 800 IU/g，and β-glucosidase 40 IU/g，under this and when the substrate concentration was 25%，glucose was up to 9.3 g/100 mL，i.e.，increased by 57.63% compared to using a single cellulase while the glucose was only 5.9 g/100 mL. The affecting significance of three enzymes was ordered as follows：cellulase ＞ xylanase ＞ β-glucosidase.

corn stalk；cellulase；xylanase；β-glucosidase；complex formulation

10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2016.03.027

2015-05-29

國(guó)家科技支撐計(jì)劃（2012BAC18B03），車(chē)用生物燃料技術(shù)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室開(kāi)放基金（2013030）

王奇，男，碩士，助理工程師，研究方向：生物質(zhì)能源；E-mail：wq_061130@163.com