岳青霞張麗潔田健伍寧豐姚冬生

（1. 暨南大學生命科學技術(shù)學院，廣州 510632；2. 中國農(nóng)業(yè)科學院生物技術(shù)研究所，北京 100081；3. 河北農(nóng)業(yè)大學生命科學學院，保定071001）

漆酶N端融合His-tag或S-tag標簽促進其在大腸桿菌中可溶性表達

岳青霞1，2張麗潔2，3田健2伍寧豐2姚冬生1

（1. 暨南大學生命科學技術(shù)學院，廣州 510632；2. 中國農(nóng)業(yè)科學院生物技術(shù)研究所，北京 100081；3. 河北農(nóng)業(yè)大學生命科學學院，保定071001）

來源于地衣芽孢桿菌的漆酶具有催效率高，底物范圍廣等優(yōu)點在工農(nóng)業(yè)等領域具有重要的應用前景，但該酶在外源基因表達系統(tǒng)中的表達量低，影響了其在工農(nóng)業(yè)等領域的應用。His-tag和S-tag兩種標簽由于具有分子量小，且一般不影響外源蛋白性質(zhì)等特點，在外源蛋白的純化和檢測中具有重要的應用。本研究發(fā)現(xiàn)將來源于地衣芽孢桿菌的漆酶CotA的N端融合Histag或S-tag構(gòu)建于pET-22b載體，并轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21（DE3）后可以顯著提高其在大腸桿菌中的可溶性表達量，其表達量較N端無融合標簽的構(gòu)建，His-tag可提高漆酶表達量約為37倍，S-tag約可提高20倍，His-tag與S-tag共作用約可提高28倍。

漆酶；His-tag；S-tag；高效表達

漆酶（EC 1.10.3.2）是一種含銅的多酚氧化酶，能夠氧化多種芳香化合物和其他有機化合物，并使氧氣還原生成水［1］。漆酶分布廣泛，存在于植物［2］、昆蟲［3］、真菌［4］和細菌［5］中，其中真菌漆酶的研究較為深入，而且在真菌中的表達量較高。但細菌來源的漆酶對熱、鹵素和堿的穩(wěn)定性好，最適pH范圍廣泛，這些優(yōu)點都是真菌漆酶所無法比擬的。來源于地衣芽孢桿菌的漆酶CotA（GenBank登錄號：AGT45479.1）自2001年被首次發(fā)現(xiàn)后，逐漸引起人們的重視。雖然細菌來源的漆酶具有很大的潛在應用價值，但其在外源基因表達系統(tǒng)中的表達量仍是亟待解決的關鍵問題。

大腸桿菌因其具有遺傳背景清楚，技術(shù)操作和培養(yǎng)條件簡單，大規(guī)模發(fā)酵經(jīng)濟等優(yōu)點而倍受關注，同時大腸桿菌也是目前應用最廣泛的表達系統(tǒng)。但是該系統(tǒng)也存在一定的局限性，外源蛋白在表達過程中易形成包涵體，且包涵體的復性困難。因此，通過對靶蛋白的修飾，如對目的基因進行定點突變［6］，控制培養(yǎng)基成分［7］及Cu2+濃度［8-10］，添加標簽等可以提高目的蛋白的可溶性表達。目前常用的融合標簽包括：SUMO［11］（small ubiquitinlike modifier）、S-谷胱甘肽轉(zhuǎn)移酶［12］（glutathione S-transferase，GST）、多聚組氨酸［13］（His-tag）、Flag-tag［14］、麥芽糖結(jié)合蛋白［15］（maltose binding protein，BMP）、c-myc-tag［16］、eGFP和S-tag［17］等。

His標簽是一種非常普遍的用于純化蛋白的標簽，該標簽分子量小，雖然帶有His標簽的蛋白的衍射圖譜與天然蛋白稍有差異［18］，但對目的蛋白的活性幾乎無影響。1975年，Porath等［19］提出固定化金屬親和層析（Immoilized metal affinity chromatography，IMAC），它的基本原理是固定在基質(zhì)中的過渡金屬元素（Co2+、Ni2+、Cu2+和Zn2+）和特殊氨基酸側(cè)鏈間的相互作用。S-tag由15個氨基酸組成，其作用原理是這15個氨基酸與103個S-蛋白發(fā)生強烈的相互作用。它包括4個帶正電，3個帶負電，3個極性不帶電和5個非極性氨基酸組成，這些氨基酸使得S-tag具有可溶性。

本實驗將系統(tǒng)的研究漆酶N端的His-tag或S-tag對其在腸桿菌中可溶性表達的影響，旨為其應用及工業(yè)化生產(chǎn)奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株與試劑 大腸桿菌（Escherichia coli）BL21（DE3）感受態(tài)細胞購自天根生化科技（北京）公司，pET22b-CotA-BL為本實驗室保存。ABTS（2， 2'-聯(lián)氨-雙（3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸）二胺鹽）購自Sigma公司，T4 DNA連接酶和限制性內(nèi)切酶（Nde I、Nco I）購自New England Biolabs（NEB）公司，dNTPs、DNA聚合酶購自天根生化科技（北京）公司，DNA純化回收試劑盒、膠回收試劑盒購自Axygen公司，其他試劑為國產(chǎn)分析純，購自北京化學試劑公司。

1.1.2 培養(yǎng)基 LB培養(yǎng)基：酵母浸取物5 g/L，蛋白胨10 g/L，NaCl 10 g/L。

1.2 方法

1.2.1 His-tag、2Gly、S-tag、His-tag+S-tag序列的克隆 His-tag和S-tag為短序列，參考pET系列表達載體上的序列設計引物，His-tag引物為His-tag-F：5'-ATACATATGCATCACCACCACCATCACGGTGGCGCCATGGATA-3'和His-tag-R：5'- TATCCATGGCGCCACCGTGATGGTGGTGGTGATGCATATGTAT-3'，引物兩端引入Nde I和Nco I酶切位點；兩個Gly序列的引物為：2Gly-F：5'-ATACATATGGGTGGCGCCATGGATA-3'和2Gly-R：5'- TATCCATGGCGCCACCCATATGTAT-3'引物兩端同樣引入酶切位點Nde I和Nco I。S-tag引物為S-tag-F：5'- ATACATATGAAAGAAA CCGCTGCTGCTAAATTCGAACGCCAGCACATGGAC AGCGGTGGCCCATGGATA-3'和S-tag-R：5'- TATCC ATGGGCTGTCCATGTGCTGGCGTTCGAATTTAGCAGC AGCGGTTTCTTTCGCCACCATATGTAT-3'，引物兩端引入Nde I和Nco I酶切位點，His-tag-F、His-tag-R以及S-tag-F、S-tag-R用NEB 3號buffer溶解后各取5 μL混勻，兩條引物互為模板進行擴增。PCR條件為：94℃預變性5 min，94℃變性30 s，68℃退火30 s，每個循環(huán)退火溫度降低1℃至退火溫度為50℃，退火溫度降為50℃后循環(huán)11次。His-tag+S-tag超過100 bp，依據(jù)pET-30a（+）設計引物進行擴增，引物為His+S-F：5'-ATACAT-ATGCACCATCATCAT-3'和His+S-R：5'-ATACCATGGCCTTGTCGTCGT-3'，同樣在其產(chǎn)物兩端引入Nde I和Nco I酶切位點。以pET-30a（+）為模板進行擴增，擴增體系為：模板1 μL，dNTPs 4 μL，10 mmol/L His+S-F、His+S-R各 5 μL，F(xiàn)ast Pfu polymerase 1.5 μL，5×Fast Pfu polymerase buffer 10 μL，H2O 23.5 μL。擴增條件為：94℃預變性5 min，94℃變性30 s，55℃退火30 s，72℃延伸30 s，共30個循環(huán)，72℃延伸10 min。

1.2.2 His-tag、2Gly、S-tag、His-tag+S-tag分別與pET22b-CotA-BL重組載體的構(gòu)建 將擴增的Histag、2Gly、S-tag、His-tag+S-tag及pET22b-CotA-BL用Nde I和Nco I雙酶切，其中酶切后的His-tag、2Gly、S-tag、His-tag+S-tag用乙醇沉淀加以回收，酶切后的pET22b-CotA-BL經(jīng)1%的凝膠電泳，切膠回收。經(jīng)過雙酶切后的His-tag、2Gly、S-tag、His-tag+S-tag分別與雙酶切后的pET22b-CotA-BL連接，轉(zhuǎn)化BL21（DE3）感受態(tài)細胞，涂布含100 μg/mL氨芐青霉素平板。菌液PCR驗證陽性克隆子后送測序，測序正確后進行誘導表達。

1.2.3 重組漆酶的表達 將含有重組質(zhì)粒的菌株于平板上劃線活化，挑取單克隆至含有100 μg/mL氨芐青霉素的LB培養(yǎng)基中，37℃，200 r/min振蕩培養(yǎng)，將該培養(yǎng)液以1∶100的比例轉(zhuǎn)接至50 mL含100 μg/mL氨芐青霉素的液體培養(yǎng)基中，30℃，120 r/min培養(yǎng)至OD600=0.6-0.8后，加入終濃度為0.25 mmol/L的Cu2+和終濃度為1 mmol/L的IPTG，25℃，120 r/min振蕩培養(yǎng)4 h后靜置誘導20 h［20］。

誘導后的菌液在4℃，8 000 r/min離心10 min后，棄上清收集菌體。菌體用50 mmol/L Tris-HCl（pH8.0）重懸，冰上超聲破碎。破碎后的粗酶液經(jīng)4℃，12 000 r/min離心后小心地取出上清，進行酶活性的測定，同時取出少量樣品進行SDS-PAGE分析。

1.2.4 漆酶酶活的測定 漆酶活性的測定是以ABTS（ε420 nm=36 000 L/mol·cm）為底物，取750 μL 0.1 mol/L 磷酸氫二鈉-檸檬酸緩沖液（pH4.5）和200 μL 5 mmol/L ABTS，二者于37℃預熱2 min后加入50 μL重組漆酶粗酶液反應3 min后，混合液于冰水混合物中終止1 min后，在ε420 nm條件下讀數(shù)。漆酶一個酶活力單位（U）定義為：最適條件下，每分鐘催化1 μmol底物氧化所需要的酶量。

2 結(jié)果

2.1 標簽的克隆和重組表達載體的構(gòu)建

為了研究His-tag或S-tag對漆酶基因表達的影響，首先將來源于地衣芽孢桿菌的漆酶通過酶切位點（BamH I-Xho I）連入載體pET22b上。然后分別將His-tag、S-tag及His-tag+S-tag通過漆酶上游的酶切位點（Nde I和Nco I）連在表達載體上，為了使His-tag或S-tag不影響漆酶的功能，在標簽的下游引入兩個柔性的甘氨酸。同時也在Nde I和Nco I之間構(gòu)建了一個只有兩個甘氨酸的載體，該載體和僅在pET22b上連有漆酶的構(gòu)建一起用來作為陰性對照。構(gòu)建過程，見圖1。

2.2 重組漆酶酶活的測定

以ABTS為底物，在pH4.5，37℃條件下測定重組漆酶的酶活性，結(jié)果（圖2）顯示，在將pET-22b載體上的信號肽替換為2個甘氨酸時，兩者的酶活基本相同，但將His標簽連接于pET-22b與漆酶基因共同表達時，其酶活提高至2 U/mL，約是沒連標簽的37倍。此外，當漆酶基因與S-tag和His-tag與S-tag共表達時其可溶性蛋白的量也分別是沒連標簽的20倍和28倍。

2.3 重組漆酶SDS-PAGE分析

從蛋白電泳的結(jié)果（圖3）可以看出，融合蛋白的分子量約為70 kD，His-tag與S-tag大小相差不大，融合蛋白的分子量也基本相同，連接有Histag+S-tag的重組漆酶在基因序列上比連接有S-tag的重組漆酶多出一個His-tag序列外還增加了多個限制性酶切位點以及凝血酶和腸激酶等額外序列，因此其蛋白的分子量要大于連接有S-tag的重組漆酶。相比于野生型，His-tag、S-tag、His-tag+S-tag對與漆酶的可溶性表達均有所提高。

3 討論

漆酶在大腸桿菌中表達時常因銅離子的耗損導致其表達量或者酶活降低，Koschorreck等［21］通過向培養(yǎng)基中添加銅離子可以部分提高漆酶的酶活，但是銅離子濃度大于2 mmol/L時對菌體的生長產(chǎn)生抑制作用。細胞內(nèi)的銅離子的積累不一定能使得漆酶的銅離子含量增加，進而影響漆酶的表達，因為細胞內(nèi)的銅離子并不是以自由離子的形式存在，而是結(jié)合于金屬蛋白或者是銅離子伴侶進而將銅離子傳遞給目標蛋白［22］。Gunne等［23］將來源于地衣芽孢桿菌的漆酶CotA與銅離子伴侶CopZ在大腸桿菌BL（DE3）中共表達后，銅離子含量增加了20%，酶活相較于野生型提高了26%。

圖1 重組載體的構(gòu)建

圖2 重組漆酶的酶活

由于His-tag和S-tag的序列中包含有大量的帶電荷的氨基酸，可以非特異的螯合銅離子。而在漆酶的結(jié)構(gòu)中至少需要4個銅離子，因此，在漆酶的N端融合表達His-tag或S-tag可以幫助漆酶在結(jié)構(gòu)形成之前募集更多的銅離子，而His-tag和S-tag與銅離子的結(jié)合并不緊密，這些銅離子整合進漆酶的結(jié)構(gòu)中，并形成正確的結(jié)構(gòu)。因此，在漆酶的N端融合表達His-tag或S-tag有可能會提高漆酶的可溶性表達量。

His-tag作為蛋白融合標簽，在蛋白的純化中最為常見，且其分子量小，對于蛋白的活性一般無影響，有研究稱多聚組氨酸的數(shù)目及融合部位對融合蛋白的表達水平及其溶解性有顯著影響，當標簽長度由6個增加到10個時反而降低了目的蛋白的表達量［24］。本研究中多聚組氨酸提高了漆酶的表達量，其可能的原因是：（1）組氨酸作為過渡元素，能夠螯合環(huán)境中的銅離子，銅離子作為漆酶的反應中心，在傳遞電子和氧化還原作用中發(fā)揮重要作用，此外，銅離子對于漆酶的形成也有影響。組氨酸標簽在與漆酶共表達的過程中可充當銅離子庫，為漆酶提供銅離子，無論是在參與氧化還原反應還是在漆酶的形成過程中都有重要作用。（2）有研究表明，新生肽鏈的聚集速率超過蛋白正確折疊的速率就容易形成包涵體，連續(xù)的6個組氨酸降低了新生肽鏈合成的速率，使得蛋白能夠正確的折疊，減少了肽鏈的聚集，從而使可溶性蛋白的量提高。（3）組氨酸自身帶正電荷，使得重組蛋白所帶的電荷有所改變，蛋白多帶電荷與所處的溶劑環(huán)境相互作用，使重組蛋白可以穩(wěn)定存在，防止蛋白的聚集。（4）多聚組氨酸標簽改變了起始部分mRNA的二級結(jié)構(gòu)，使核糖體能夠高效結(jié)合，從而提高了重組蛋白的表達量。

同樣S-tag常用于蛋白的檢測及純化，其氨基酸組成使得自身高度可溶。S-tag對漆酶可溶性有所幫助，可能的原因是可溶性標簽使得與之融合的可溶性蛋白的量增加。本研究中，將兩者標簽聯(lián)合使用對漆酶的表達量的提高沒有單獨使用His-tag時效果好，可能是因為兩個標簽之間相互作用，影響了可溶性蛋白的表達。

本研究為金屬依賴性酶的可溶性表達提供了新思路，通過增加能夠螯合金屬離子的標簽的螯合作用，為蛋白的正確折疊提供金屬離子庫，同時N端的標簽也可以使得重組蛋白的mRNA的結(jié)構(gòu)有所改變，降低折疊速率，降低重組蛋白的降解率等，進而提高了可溶性蛋白的表達量。但是并不是所有的蛋白都適合此規(guī)律，我們應根據(jù)重組蛋白的性質(zhì)慎重選擇標簽，以期達到提高蛋白表達量的目的。

4 結(jié)論

通過在地衣芽孢桿菌來源的漆酶 N端添加Histag、S-tag以及His-tag+S-tag，將可溶性漆酶的酶活分別提高至未融合標簽蛋白的37倍，20倍和28倍。

［1］Hoshida H， Nakao M， Kanazawa H. Isolation of five laccase gene sequences from the white-rot fungus Trametes sanguinea by PCR，and cloning， characterization and expression of the laccase cDNA in yeasts［J］. Journal of Bioscience and Bioengineering， 2001， 92（4）：372-380.

［2］Bao W， Omalley DM， Whetten R， et al. A laccase associated with lignification in loblolly pine xylem［J］. Science， 1993， 260（5108）：672-674.

［3］Dittmer NT， Suderman RJ， Jiang H， et al. Characterization of cDNAs encoding putative laccase-like multicopper oxidases and developmental expression in the tobacco hornworm， Manduca sexta，and the malaria mosquito， Anopheles gambiae［J］. Insect Biochem Mol Biol， 2004， 34（1）：29-41.

［4］ Heinzkill M， Messner K. The ligninolytic system of fungi AnkeT（ed）. Fungal Biotechnology， 1997：213-226.

［5］Zeng J， Lin X， Zhang J， et al. Oxidation of polycyclic aromatic hydrocarbons by the bacterial laccase CueO from E. coli［J］. Applied Microbiology and Biotechnology， 2011， 89（6）：1841-1849.

［6］Koschorreck K， Schmid RD， Urlacher VB. Improving the functional expression of a Bacillus licheniformis laccase by random and sitedirected mutagenesis［J］. BMC Biotechnol， 2009， 9：12.

［7］Tinoco R， Acevedo A， Galindo E， et al. Increasing Pleurotus ostreatus laccase production by culture medium optimization and copper/lignin synergistic induction［J］. Journal of Industrial Microbiology & Biotechnology， 2011， 38（4）：531-540.

［8］Galhaup C， Haltrich D. Enhanced formation of laccase activity by the white-rot fungus Trametes pubescens in the presence of copper［J］. Applied Microbiology and Biotechnology， 2001， 56（1/2）：225-232.

［9］Palmieri G， Giardina P， Bianco C， et al. Copper induction of laccase isoenzymes in the ligninolytic fungus Pleurotus ostreatus［J］. Applied and Environment Microbiology， 2000， 66（3）：920-924.

［10］Lorenzo M， Moldes D， Sanromán MA. Effect of heavy metals on the production of several laccase isoenzymes by Trametes versicolor and on their ability to decolourise dyes［J］. Chemosphere， 2006， 63（6）：912-917.

［11］Malakhov MP. SUMO fusion and SUMO-specific proteases for efficient expression and purification of proteins［J］. Genome，2004， 5：75-86.

［12］Smith DB. Single-step purification of polypeptides espressed in Escherichia coli as fusions with glutathione S-transferase［J］. Gene， 1988， 67：31-40.

［13］Hochuli E. New metal chelate adsorbent selective for proteins and peptides containing neighbouring histidine residues［J］. J Chormatogr， 1987， 411：177-184.

［14］Hopp TP. A short ploypeptide marker sequence useful for recombinant protein identification and purification［J］. Bio Technology， 1988， 6：1204-1210.

［15］di Guan C， Li P， Riggs PD， Inouye H. Vectors that facilitate the expression and purification of foreign peptides in Escherichia coli by fusion to maltose-binding protein［J］. Gene， 1988， 67：21-30.

［16］ Evan GI. Isolation of monoclonal antibodies specific for human cmyc proto-oncogene product［J］. Mol Cell Biol， 1985， 5：3610-3616.

［17］Karpeisky MY. Formation and properties of S-protein complex with S-peptide containing fusion protein［J］. FEBS Lett， 1994， 339：209-212.

［18］Hakansson K. Crystallization of peptidase T from Salmonella typhimurium［J］. Acta Crystallographica Section D-Biological Crystallography， 2000， 56：924-926.

［19］ Porath J， Carlsson J， Olsson I. Metal chelate affinity chromatography，a new approach to protein fractionation［J］. Nature， 1975， 258（5536）：598-599.

［20］Durao P， Chen Z， Fernandes AT， et al. Copper incorporation into recombinant CotA laccase from Bacillus subtilis：characterization of fully copper loaded enzymes［J］. J Biol Inorg Chem， 2008， 13（2）：183-193.

［21］ Koschorreck K， Richter SM， Ene AB， et al. Cloning and characterization of a new laccase from Bacillus licheniformis catalyzing dimerization of phenolic acids［J］. Applied Microbiology and Biotechnology， 2008， 79：217-224.

［22］ Rae TD， Schmidt PJ， Pufahl RA， et al. Undetectable intracellular free copper：the requirement of a copper chaperone for superoxidedismutase［J］. Science， 1999， 284：805-808.

［23］ Gunne M， Al-Sultani D， Urlacher VB. Enhancement of copper content and specific activity of CotA laccase from Bacillus licheniformis by coexpression with CopZ copper chaperone in E. coli［J］. Journal of Biotechnology， 2013， 168（3）：252-255.

［24］ Mohanty AK， Wiener MC. Membrane protein expression and production：effects of polyhistidine tag length and position［J］. Protein Expression and Purification， 2004， 33（2）：311-325.

（責任編輯 李楠）

Promotion of Soluble Expression of Laccase in Escherichia coli by Fusion of His-tag or S-tag on the N-terminal of It

YUE Qing-xia1，2ZHANG Li-jie2，3TIAN Jian2WU Ning-feng2YAO Dong-sheng1
（1. College of Life Science and Technology，Jinan University，Guangzhou 510632；2. Biotechnology Research Institute，Chinese Academy of Agricultural Sciences，Beijing 100081. 3. College of Life Sciences，Agricultural University of Hebei，Baoding 071001）

Laccase from Bacillus licheniformis has the advantages of high catalytic efficiency，wide range of substrates，etc.，thus it owns the broad application prospect in industrial and agricultural fields. However，the expression level of the enzyme in the foreign gene expression system is low，which greatly limits its application in the agricultural and industrial fields. His-tag or S-tag is the small peptide with low molecular weight and usually can not affect the characteristics of heterologous fusion protein，and they are beneficial to be applied in the purification and detection of heterologous proteins. In this study，fusion of His-tag and/or S-tag on the N-terminal of the laccase CotA from B. licheniformis was constructed into pET-22b vector，and the vector was transferred into Escherichia coli BL（DE3），then we found that the soluble expression level of laccase significantly increased in E. coli BL（DE3）. Compared with the construction without no fusion of any tags on N-terminal，the expression level with His-tag was about 37 folds，20 folds with S-tag，and 28 folds with both His-tag and S-tag，respectively.

laccase；His-tag；S-tag；high expression

10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2016.03.028

2015-09-02

國家“863”計劃項目（2013AA102804）

岳青霞，女，碩士，研究方向：應用微生物與微生物工程；E-mail：hpuyqx@163.com

田健，男，博士，研究方向：蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)模擬、蛋白質(zhì)分子設計與改良及微生物重要基因或元件資源挖掘；E-mail：tianjian@caas.cn