李樹剛王勇張偉辛渝但國平柴新娟龔會英于廷和

（1. 重慶科潤生物醫(yī)藥研發(fā)有限公司，重慶 401121；2. 重慶醫(yī)科大學附屬第二醫(yī)院，重慶 400010）

重組羧肽酶G2的原核表達、純化及活性分析

李樹剛1王勇1張偉1辛渝1但國平1柴新娟1龔會英1于廷和2

（1. 重慶科潤生物醫(yī)藥研發(fā)有限公司，重慶 401121；2. 重慶醫(yī)科大學附屬第二醫(yī)院，重慶 400010）

在原核表達系統(tǒng)中實現(xiàn)羧肽酶G2（Carboxypeptidase G2，CPG2）的表達，并對CPG2進行了純化和活性測定。通過PCR擴增得到編碼CPG2的基因片段，利用基因重組技術(shù)構(gòu)建原核表達質(zhì)粒pET-30a-CPG2，在Escherichia coli中進行誘導表達，菌體經(jīng)超聲破碎后利用金屬螯合親和柱和陰離子交換層析柱對目標蛋白進行純化。目的蛋白能夠以可溶形式表達，SDS-PAGE和Western blotting檢測有特異的蛋白表達條帶。純化的CPG2有降解氨甲喋吟（MTX）活性，酶活力達到400 U/mg。

羧肽酶G2；原核表達；純化；氨甲喋吟

羧肽酶G2（carboxypeptidase G2，CPG2）是羧肽酶G家族成員之一，最初是從假單胞菌屬（Pseudomonas）菌株RS-16中分離獲得［1］。羧肽酶G可水解葉酸及其衍生物的C端谷氨酸殘基［2-4］。CPG2在物理特性與動力學特征上與羧肽酶Gl（CPGl）類似，但其對MTX的親和力要高于CPGl。

CPG2全序列為415個氨基酸，其中包含一個25個氨基酸的信號肽序列和390個氨基酸的成熟蛋白序列。CPG2活性分子為同源二聚體，分子量83 kD-84 kD，催化活性需Zn2+。最初CPG2的制備是RS-16發(fā)酵而來，表達量僅為200-300 U/L，且CPG2表達量低于菌體總蛋白的0.1%，不能滿足研發(fā)的需要［5，6］。因此，用基因工程的方法生產(chǎn)重組羧肽酶G2是另一選擇。

CPG2分子無糖基化和二硫鍵，用原核系統(tǒng)表達是首選。近年CPG2基因已用基因工程的方法表達重組CPG2［7，8］。在原核系統(tǒng)中表達量最高可占菌體總蛋白的20%［7，9，10］。CPG2必須以二聚體形式存在才具有完全的生物學活性［11］。所以，在大腸桿菌中以可溶形式表達CPG2并能夠自發(fā)形成二聚體，是大腸桿菌表達CPG2必須考慮的因素。

為了進一步提高CPG2的表達水平，獲得有活性的目的蛋白，滿足研發(fā)的需要，實驗通過基因工程的方法在大腸桿菌中高效表達CPG2蛋白，并對其酶學活性進行初步研究，旨在為CPG2的臨床應用奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株和載體 Escherichia coli DH5α和BL21（DE3）、表達載體pET-30a為本公司保存。

1.1.2 工具酶、引物和試劑 限制性內(nèi)切酶、T4 DNA連接酶和Taq酶等購自大連TaKaRa生物工程有限公司；PCR引物由上海Sangon公司合成；PCR產(chǎn)物純化試劑盒、DNA marker、蛋白質(zhì)marker、YNB、生物素、酵母粉、蛋白胨、卡那霉素、EZ-10 Spin Column DNA Gel Extraction Kit、鼠抗His單克隆抗體（一抗）、羊抗鼠HRP-IgG（二抗）、牛血清白蛋白（BSA）購自上海Sangon公司；其他化學試劑均為國產(chǎn)或進口分析純。

1.2 方法

1.2.1 引物及基因合成 根據(jù)GenBank登錄的CPG2基因序列（登錄號：M12599）進行基因合成（上海生工完成）。設計一對擴增CPG2 cDNA的特異性上下游引物，上游引物CPG2-F中引入Bgl II酶切位點，下游引物CPG2-R引入NotⅠ酶切位點，引物由上海Sangon合成（表1）。

表1 擴增目的基因CPG2的PCR引物

1.2.2 pET-30a-CPG2/BL21（DE3）原核表達菌株的構(gòu)建和鑒定 以人工合成的CPG2為模板，CPG2-F和CPG2-R為引物，PCR擴增該序列，引入Bgl II酶切位點、腸激酶切割位點（DDDDK）和Not I酶切位點。1%瓊脂糖凝膠電泳后，切膠純化回收。將純化的目的基因片段與pET-30a Bgl II和NotⅠ酶切回收后，16℃連接過夜，轉(zhuǎn)化DH5α感受態(tài)細胞，提取質(zhì)粒后雙酶切鑒定，證明目的基因片段已正確插入pET-30a載體；質(zhì)粒經(jīng)上海Sangon測序，測序正確的重組質(zhì)粒命名為pET-30a-CPG2。重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化BL21（DE3）。

1.2.3 CPG2在E.coli BL21（DE3）中的重組表達挑取工程菌pET-30a-CPG2/BL21（DE3）接種到20 mL LB（Kan 50 μg/mL）液體培養(yǎng)基中，37℃，250 r/min，培養(yǎng)過夜。次日，按1%的比例接種母液到200 mL LB（Kan 50 μg/mL）液體培養(yǎng)基，37℃，250 r/min培養(yǎng)，OD600達到0.6后，加入IPTG至終濃度為0.4 mmol/L，30℃繼續(xù)誘導表達4 h。將搖瓶置于冰上5 min，5 000×g，4℃，離心5 min收集菌體。

1.2.4 CPG2蛋白純化 發(fā)酵液菌體按1∶5（W/W）懸浮于裂解液（20 mmol/L Tirs-HCl，0.2 mmol/L Zn2+，pH8.0）中，超聲破壁，8 000 r/min離心5 min收集上清；破菌液上清上樣于經(jīng)0.2 mol/L NiSO4處理并以20 mmol/L Tris-HCl（pH8.0）平衡的Ni2+Chelating Sepharose Fast Flow 鰲合層析介質(zhì)，分別以50 mmol/L和100 mmol/L咪唑（含20 mmol/L Tris-HCl，pH8.0）洗脫，目的蛋白集中于100 mmol/L咪唑洗脫部分；收集的目的蛋白以截留分子量l0 kD離心超濾管超濾脫鹽，置換緩沖為25 mmol/L Tris-HCl（含0.2 mmol/L Zn2+，pH8.0），lowry測定蛋白濃度，按每1 mg蛋白加入0.5 U腸激酶（50 mmol/L Tris-HCl，2 mmol/L CaCl2，0.1% Tween-20，pH8.0）在4℃條件下酶切融合蛋白約16 h；酶切目的蛋白上樣于25 mmol/L Tirs-HCl（pH8.5），0.2 mmol/L Zn2+平衡的Q-Sepharose Fast Flow（GE Healthcare），用25 mmol/L，Tris-HCl（pH8.5）緩沖液再沖洗5-6個柱床體積后，用50 mmol/L Tris-HCl（pH8.0）洗脫雜蛋白，再以0.1 mol/L Tris-HCl，pH7.5，0.2 mmol/L Zn2+一次性洗脫目的蛋白，收集洗脫蛋白峰。SDSPAGE檢測分子量約為42 kD，純度大于95%。

1.2.5 免疫印跡分析 純化的帶有His標簽的融合蛋白經(jīng)SDS-PAGE分離后電轉(zhuǎn)至PVDF膜上，用5%脫脂奶粉封閉2 h，滴加鼠抗 His一抗（1∶300）（上海生工），4℃孵育過夜，TBST 洗膜3次，再滴加HRP標記的羊抗鼠抗體（1∶1 000）（上海生工），37℃孵育2 h，TBST和PBS各洗膜3次，用濾紙吸干膜表面。利用DAB試劑盒進行顯色。

1.2.6 生物活性分析 取2.82 mL 0.l mol/L Tris-HCl，pH7.3，0.2 mmol/L ZnCl2，加入180 μL 1 mmol/L氨甲蝶吟（MTX，中國藥品生物制品檢定所）。用蒸餾水調(diào)零?？焖偌尤?0 μL標準品或待測樣品（適當稀釋，含0.03-0.06 U羧肽酶），混勻，倒入比色杯中于320 nm處測其吸光值，間隔15 s檢測一次。記錄吸光值變化。

1.2.7 羧肽酶G2酶學性質(zhì)的研究 （1）最適酶活反應溫度：實驗在pH7. 5，反應時間為30 min時分別測定4℃、16℃、25℃、30℃、35℃、37℃、40℃、45℃、50℃、55℃、60℃、65℃、70℃及75℃時的酶活。（2）最適酶活反應pH：測定羧肽酶G2酶液在不同pH值的緩沖液中酶活力，確定pH值對羧肽酶G2酶活力的影響。溫度為37℃，反應時間為30 min時，分別測定pH5.5、6.0、6.5、7.0、7.5、8.0、8.5、9.0和10.0時的酶活性，以確定最佳反應pH值。

2 結(jié)果

2.1 表達載體pET-30a-CPG2的構(gòu)建與鑒定

以人工合成的CPG2基因序列為模板，PCR法擴增該序列，并引入Bgl II和NotⅠ酶切位點及腸激酶酶切位點，回收 DNA 片段長度約1 200 bp。將Bgl II/NotⅠ酶切的PCR產(chǎn)物插入pET-30a，成功構(gòu)建pET-30a-CPG2原核表達載體，并轉(zhuǎn)化至E. coli DH5α感受態(tài)細胞。菌落PCR、質(zhì)粒酶切圖譜（圖1-A）及測序結(jié)果顯示pET-30a-CPG2重組質(zhì)粒構(gòu)建成功。

圖1 重組表達質(zhì)粒pET-30a-CPG2和BL21（DE3）陽性轉(zhuǎn)化子的鑒定

2.2 重組融合蛋白CPG2的表達

將pET-30a-CPG2表達載體轉(zhuǎn)入感受態(tài)的E. coli BL21（DE3）宿主菌，涂布LB平板，經(jīng)菌落PCR擴增出1 200 bp片段的菌落為陽性克?。▓D1-A），雙酶切重組質(zhì)粒表明能獲得陽性目的片段（圖1-B）。將pET-30a-CPG2/BL21（DE3）經(jīng)37℃培養(yǎng)的菌液OD600達到0.6-0.8時，加入終濃度為0.4 mmol/L的異丙基硫代-β-D-半乳糖苷（IPTG），30℃誘導目的蛋白表達，收集菌體，并進行SDS-PAGE檢測。結(jié)果（圖2）顯示，與誘導前相比，IPTG 誘導之后在43 kD附近有一條明顯的蛋白條帶，與融合蛋白理論分子量相當。菌體經(jīng)超聲波破碎后離心，分別取上清和沉淀進行SDS-PAGE分析。結(jié)果（圖2）表明，CPG2以可溶的形式表達。

圖2 CPG2蛋白在大腸桿菌BL21（DE3）中誘導表達的SDS-PAGE檢測

2.3 CPG2重組蛋白的純化與鑒定

菌體裂解后的上清，經(jīng)過組氨酸親和層析和陰離子交換層析，并經(jīng)Sephadex G-25凝膠過濾層析脫鹽、過濾除菌后就得到CPG2蛋白原液。通過該純化工藝，可以獲得純度大于95%的CPG2蛋白。純化過程中CPG2蛋白產(chǎn)物的純度分析（圖3-A），目的蛋白分子量約為42 kD。Western blotting結(jié)果（圖3-B）表明，CPG2融合蛋白可與鼠抗His發(fā)生特異性反應。

圖3 融合蛋白CPG2的純化結(jié)果（A）及Western blotting 檢測（B）

2.4 CPG2重組蛋白的活性測定

用酶動力學方法對CPG2的活性進行了測定，反應體系中最終加入酶量0.1-1.0 U，檢測MTX降解率，以計算酶活性。定義37℃條件下1 min內(nèi)降解1 μmol MTX所需要的酶量為1個活性單位（U）。經(jīng)檢測，CPG2原液比活性為400 U/mg。隨著CPG2濃度的上升，MTX的裂解率也隨之上升，兩者成呈劑量依賴關系（圖4）。

圖4 CPG2劑量-反應曲線

2.5 CPG2酶學性質(zhì)的測定

2.5.1 最適反應溫度 最適酶活反應溫度在pH7.5的條件下、用UV法測定4℃、16℃、25℃、30℃、35℃、37℃、40℃、45℃、50℃、55℃、60℃、65℃、70℃和75℃下的CPG2的酶活性，通過3次平行試驗，取平均值，繪制曲線如圖5。酶的最適溫度為37℃，在溫度為30℃-40℃范圍內(nèi)，酶活性保持在80%-100%，當溫度高于55℃時，酶活性急劇下降至60%，到60℃以后，酶活性急劇下降接近為0。

圖5 溫度對羧肽酶G2活性的影響

2.5.2 最適酶活反應pH 在最適溫度37℃下用UV法分別測定pH5.5、6.0、6.5、7.0、7.5、8.0、8.5、9.0和10.0的緩沖體系下酶活性，通過3次平行試驗，取平均值，繪制pH曲線，酶活情況由圖6可見。

3 討論

本研究將CPG2連接至原核表達載體pET-30a上，采用 IPTG誘導CPG2融合蛋白的表達。pET-30a原核表達載體具有兩個顯著特點：一是含有T7啟動子，可被宿主細胞提供的T7 RNA 聚合酶識別，T7 RNA 聚合酶的轉(zhuǎn)錄效率比大腸桿菌 RNA 聚合酶高5倍，能夠高效轉(zhuǎn)錄 mRNA，實現(xiàn)融合蛋白的高表達；二是載體上攜帶His·Tag和S·Tag，誘導表達的 43 kD標簽蛋白對目的蛋白的結(jié)構(gòu)及生物學活性影響很小，His·Tag為蛋白純化提供了親和位點，而且兩者之間有腸激酶酶切位點，便于純化后將標簽蛋白切除［12-15］。

圖6 pH對羧肽酶G2活性的影響

在蛋白純化過程中，首先采用 Ni2+柱進行親和層析，之后的SDS-PAGE分析出現(xiàn)43 kD的蛋白條帶。重組蛋白的理論等電點pI為6.5，所用緩沖液pH8.0，選擇Q柱進行陰離子交換層析，最終獲得目的蛋白的純度大于95%。

羧肽酶G2可水解MTX成無毒的非活性代謝物2，4-二甲基-N10-甲基蝶吟酸（DAMPA）和谷氨酸，兩者可以通過肝臟代謝提供一個非腎的MTX清除通道，減輕腎臟毒性［16，17］。目前，臨床上MTX高劑量化療所致的毒副作用，通常采用亞葉酸鈣進行解救。亞葉酸鈣與MTX競爭進入細胞、靶組織（骨髓、胃腸道上皮），阻止MTX的作用，補償DNA合成代謝途徑，從而達到緩解HD-MTX引發(fā)的不良反應。MTX濃度升高時需要更高濃度的亞葉酸鈣，但大劑量亞葉酸鈣同樣可解救腫瘤細胞，降低抗腫瘤效果。通過水化和堿化尿液增強MTX的水溶性來降低腎毒性，可將毒性影響范圍降低到1.5%，但仍會發(fā)生因清除延遲而致全身毒性。CPG2是目前被證明用于MTX大劑量治療的特異性解救藥，其可特異迅速裂解MTX，且不透過血-腦屏障（BBB）和細胞膜，因而不會抵消細胞內(nèi)MTX的作用。MTX裂解產(chǎn)物可在肝代謝，因此CPG2治療實際上間接提供了一種肝解毒途徑［18］。

CPG2還被用于抗體導向酶-前藥療法（ADEPT）［19-21］。ADEPT是利用抗體作為載體攜帶前藥的專一性活化酶，選擇性地結(jié)合于腫瘤部位，使前藥可以區(qū)域特異性地在腫瘤組織內(nèi)轉(zhuǎn)化為活性細胞毒分子，起到專一殺傷腫瘤的作用［22，23］。高純度的CPG2為上述研究的深入進行提供了可能性。

4 結(jié)論

成功構(gòu)建了CPG2原核表達體系，并純化獲得了純度較高的蛋白，初步證明其具有預期的生物學活性。下一步將重點圍繞CPG2蛋白的體內(nèi)外活性開展深入研究。

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（責任編輯 李楠）

Prokaryotic Expression，Purification and Activity Analysis of Recombinant Carboxypeptidase G2

LI Shu-gang1WANG Yong1ZHANG Wei1XIN Yu1DAN Guo-ping1CHAI Xin-juan1GONG Hui-ying1YU Ting-he2
（1. Chongqing Kerun Biopharm R&D Co.，Ltd.，Chongqing 401121；2. The Second Affiliated Hospital， Chongqing Medical University， Chongqing 400010）

This work is to express carboxypeptidase G2（CPG2）in prokaryotic expression system，purify it and detect its activity in vitro. The gene fragment encoding CPG2 was amplified by PCR，and the prokaryotic expressed plasmid pET-30a-CPG2 was constructed by gene recombinant technology，then it was transformed into Escherichia coli BL21（DE3）for the expression with induction. The target protein from grounded cells was purified by metals chelating affinity chromatogram and anion-exchange chromatography. Majority of the fusion protein was expressed in soluble form，and its specificity was confirmed via SDS-PAGE and Western blotting. The preliminary experimental result showed that the recombinant protein degraded MTX，and the specific activity reached 400 U/mg.

CPG2；prokaryotic expression；purification；MTX

10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2016.03.029

2015-07-02

李樹剛，男，博士生導師，研究方向：生物醫(yī)學工程；E-mail：kerunlsg@126.com