侯 粲，邱 靜，程永友，趙璐瑤，楊曙明

(中國農業(yè)科學院 農業(yè)質量標準與檢測技術研究所,北京 100081)

液相色譜-四極桿飛行時間質譜結合化學計量學方法篩查飼料中的未知藥物

侯 粲，邱 靜*，程永友，趙璐瑤，楊曙明*

(中國農業(yè)科學院 農業(yè)質量標準與檢測技術研究所,北京 100081)

建立了液相色譜-四極桿飛行時間質譜(LC-Q-TOF/MS) 對飼料中非目標污染物(獸藥) 的篩查方法，以及未知物的判定和確認技術。飼料樣品經0.1% EDTA-乙腈-甲醇(1∶1∶1，含0.1%甲酸) 混合溶液提取，Q-TOF全掃描模式采集數(shù)據，數(shù)據經過峰對齊(質量誤差5 mDa以內) 、噪音過濾、自動排除無用峰等處理后，進行正交偏最小二乘判別分析(OPLS-DA) 處理，根據Score圖、S-Plot圖和VIP圖判定出特征離子，結合二級信息與自建譜庫比對，進行結構式確認，或通過同位素豐度比例和分子式生成功能，確認分子式，結合二級斷裂信息，判定特征離子的結構式，從而判定未知物的成分。結果顯示：16份飼料樣品共篩查出27種獸藥。采用液相色譜-三重四極桿串聯(lián)質譜法對其中的12種獸藥進行定性定量分析，驗證結果僅出現(xiàn)2個假陽性，獸藥含量在12.5～152.0 mg/kg之間。通過LC-Q-TOF/MS結合OPLS-DA的方法能夠對飼料中的非目標物進行篩查分析，方法準確度高。

液相色譜-四極桿飛行時間質譜；非目標物；正交偏最小二乘判別分析；飼料；獸藥

目前大多數(shù)的儀器分析技術特別是色譜分析、色譜-質譜聯(lián)用分析技術多是針對已知目標物的測定[1]，用已知的標準品作為參考，進行樣品中目標成分的定性或定量分析，且針對目標物的檢出限達到ppb級，甚至ppt級別[2-11]，但這種針對目標物的檢測分析技術往往會忽略“目標”以外的“非目標物”，不利于對樣品的全面分析。近年來隨著分析儀器技術的發(fā)展，高分辨質譜儀器的產生，應用色譜-高分辨質譜技術分析時，在復雜的基質中即可以實現(xiàn)體系中的非目標化合物或者未知化合物的檢測[12]。分辨率是保證質譜數(shù)據的一致性和可靠性的重要參數(shù)[13]，在分析過程中，質譜的質量分辨率受到被分析化合物的濃度、基質類型以及樣品制備方法等因素的影響[14]。應用其高分辨性能得到的精確質量數(shù)信息，結合化學計量學方法，使得非目標物的分析成為可能[15]，該方法能夠在目標物背景未知、無標準品的前提下，對非目標化合物進行篩選、確認和定量分析。目前已有針對中藥[16]、環(huán)境水[17]、尿液和食品[18-19]等未知物的分析報道，而針對飼料中未知物的篩查報道很少。

“瘦肉精”問題對飼養(yǎng)管理以及相關化工產品的產、銷以及中間環(huán)節(jié)敲響了警鐘，同時也對食品安全提出更高的要求。所以，解決獸藥濫用、違法使用的現(xiàn)象迫在眉睫。通過“非目標”方式的分析，針對飼料進行事前篩查監(jiān)督，防止出現(xiàn)問題后的“事后監(jiān)測”現(xiàn)象，做到先知先覺，杜絕飼料中獸藥的濫用、違法使用問題，提高監(jiān)管力度，對于保證飼料及畜產品的安全具有重要意義。因此，本文應用液相色譜-飛行時間質譜結合化學計量學的方法，建立了飼料中非目標污染物的判別及確證方法，為相關的質量監(jiān)督、監(jiān)測提供了依據。

1 實驗部分

1.1 儀器、試劑與材料

Agilent 1200高效液相色譜儀(美國Agilent公司)；QSTAR四極桿飛行時間質譜儀、API2000 三重四極桿質譜儀(美國Applied Biosystems公司)；ThermoST16冷凍高速離心機(美國Thermo公司)；超聲波提取儀(昆山市超聲儀器有限公司)；GENIUS 3渦旋混合儀(德國IKA公司)；水浴氮吹儀(北京東方精華苑科技有限公司)；Milli-Q超純水系統(tǒng)(美國Millipore公司)。

1.2 實驗步驟

1.2.1 樣品制備 準確稱取飼料樣品2 g(精確至0.01 g)置于50 mL干凈離心管中，加入20 mL 0.1% EDTA-乙腈-甲醇(1∶1∶1，含0.1%甲酸)混合溶液提取，充分渦旋混合1 min后，室溫下超聲提取20 min，高速離心機中以7 000 r/min離心10 min后，取全部上清液于另一干凈離心管中，氮氣吹至近干，用1 mL乙腈-0.1%甲酸(4 ∶96)溶液定容，取全部溶液過0.22 μm濾膜，上機待測。

1.2.2 飼料中未知物的LC-Q-TOF/MS篩查分析 對飼料樣品進行LC-Q-TOF/MS檢測，全掃描模式采集數(shù)據，進行質譜數(shù)據處理后，利用SIMCA-P(瑞典Umetrics公司)軟件對數(shù)據進行降維處理，判定樣品中的未知特征離子，利用分子式生成(Formula Finder)軟件對未知獸藥進行定性分析。結合二級質譜信息和同位素豐度信息對未知獸藥進行結構確證分析。

1.2.3 飼料中未知物的LC-MS/MS驗證分析 針對篩查出的獸藥，選擇現(xiàn)有的12種獸藥標準品進行LC-MS/MS檢測，對飼料樣品進行MRM檢測，驗證LC-Q-TOF/MS篩查結果的準確性和可靠性，并對篩查結果進行定量分析。

1.3 實驗條件

1.3.1 液相色譜參數(shù) 色譜柱：Agilent Eclipse XDB-C18色譜柱(2.1×150 mm，5 μm)；進樣體積：10 μL；柱溫：30 ℃；流動相：A為0.1%甲酸水，B為甲醇；流速：300 μL/min；梯度洗脫程序：0～3 min，10% ～70% B，維持3 min；6～7.5 min，70% ～90% B，維持1.5 min；9.1～20 min，90% B。

1.3.2 質譜參數(shù) 質譜方法A：正離子模式(ESI+)，TOF/MS全掃描模式，一級質譜掃描范圍為m/z50～1 000。簾氣壓力(Curtain gas)：20 psi；離子源噴霧電壓(Ionspray voltage)：5 500 V；去簇電壓(Declustering potential)：80 V；碰撞氣壓力(Collision gas)：5 psi；霧化氣壓力(Gas1)：50 psi；加熱輔助氣壓力(GS2)：60 psi；離子源溫度(Temperature):500 ℃；碰撞室入口電壓(Entrance potential)：10 V ；駐留時間(Storage time )：20 ms。

二級質譜掃描采用信息相關性采集(IDA)，掃描范圍為：離子響應大于(Ion that exceeded)100 cps；質量數(shù)偏差：50 mDa；碰撞能量(Collision energy)：40 V；動態(tài)背景扣除(Dynamic background subtract )activated。采集數(shù)據時應用m/z149.023 3,279.159 1,391.284 3共3個離子作為質量軸進行數(shù)據的質量數(shù)校正工作。

質譜方法B：MRM正離子模式掃描，離子噴霧電壓：5 500 V；離子源溫度：500 ℃；簾氣壓力：20 psi；霧化氣壓力(Gas1):50 psi；加熱輔助氣壓力(GS2)：60 psi；碰撞室入口電壓(Entrance potential)：10 V；駐留時間(Storage time )：20 ms。

1.3.3 數(shù)據處理 質譜數(shù)據處理采用MarkerView(美國Applied Biosystems公司)軟件，將儀器掃描獲得的Wiff格式文件導入MarkerView軟件，設置誤差范圍(50 mDa)、噪音過濾、自動排除無用峰等，對數(shù)據降維，導出為XLS格式文件，隨后使用SIMCA-P(瑞典Umetrics公司)軟件的正交偏最小二乘判別分析(OPLS-DA)的方法進行統(tǒng)計學分析。

1.3.4 獸藥篩查譜庫 利用包含347種獸藥標準品建立的譜庫，包括一級譜庫信息：精確質量數(shù)、分子式；二級譜庫信息：相應化合物的二級斷裂譜圖信息。

2 結果與討論

2.1 前處理條件的選擇

本實驗的前處理步驟簡單，目的是避免在繁瑣的前處理過程中丟失一些化合物信息，盡管這一過程會降低分析方法的可靠性，在對未知物的研究過程中，應當盡可能多地獲取樣品中化合物的信息。使用0.1%EDTA-乙腈-甲醇(1∶1∶1,含0.1%甲酸)混合溶液作為提取劑，能夠適用于大多數(shù)獸藥和藥物的多殘留液相色譜-質譜法分析[20]。

2.2 LC-Q-TOF/MS的方法學考察

取空白飼料樣品連續(xù)進樣6次，考察了正離子模式下總離子流色譜圖中的4個主要色譜峰的保留時間和峰響應強度的變化情況。結果表明，主要色譜峰的保留時間的相對標準偏差(RSD)均小于0.3%，響應強度的RSD均小于5%。因此，該方法穩(wěn)定性較好，重現(xiàn)性良好，能夠滿足后續(xù)的統(tǒng)計學分析要求。部分陽性飼料樣品的總離子流色譜圖見圖1。

2.3 統(tǒng)計學分析

對采集的數(shù)據進行統(tǒng)計學分析，即正交偏最小二乘判別(OPLS-DA)分析法來建立判別模型，其結果以Score plot,S-Plot,VIP圖和Permutation圖的形式表現(xiàn)出來。如圖2所示，模型的R2(模型準確度)大于0.8，Q2(模型預測性)大于0.5，建立的預測模型經200次模擬后，可以相交于一點，即說明是有效模型。從OPLS-DA的得分圖中(見圖3)可以看出，空白組與樣品組能夠明顯區(qū)分，說明樣品中含有不同于空白組的成分或者不同的含量。載荷圖中包括母離子、同位素離子、單一同位素離子，用于識別導致各組有差異的特征成分，即標志物。圖4A中所有離子中距離載荷圖原點位置最遠的離子，對導致各組出現(xiàn)差異的貢獻相對最大，因此將載荷圖最兩端的離子選定為特征離子，VIP值用來說明各離子在所有數(shù)據中的可信度(誤差范圍)和影響力(縱坐標數(shù)值)(如圖4B)。選擇VIP值大于1且可信度高(誤差小)的離子作為特征離子，結合載荷圖和VIP圖的選擇條件，去除同位素離子和單一同位素離子，確定特征離子，進行后續(xù)的分子式、結構式的確證工作。通過統(tǒng)計學分析的方法處理數(shù)據后，可以判別出樣品之間的組分差異，這與Bourgin等、Vaclavik等報道的結論一致，同樣通過統(tǒng)計學分組的方法快速的判別不同紅酒、正常人和糖尿病患者的尿液、環(huán)境水中的差異化合物[21-23]。

2.4 特征離子(標志物)的確認

利用軟件的分子式生成功能，同時參照化合物的同位素分布和精確質量數(shù)匹配信息(匹配誤差小于5 ppm)，匹配結果能夠剔除大部分不正確的分子式以提高未知化合物鑒定分析的準確度和可靠性。結合化合物的二級質譜信息，通過自建譜庫比對或者Chemspider結合二級結構確定結構式。根據化合物的精確質量數(shù)和同位素豐度進行匹配，匹配出的分子式按照綜合得分的高低進行排列，通常分數(shù)高的分子式可能性比較大，此時需結合化合物的二級結構斷裂信息、Chemspider中的結構式信息進行化合物的確證，判定化合物可能的結構式信息。飼料樣品篩查的結果見表1，從表中可以看出,16份飼料樣品中共篩查出27種獸藥，包括喹諾酮類、咪唑類、抗病毒類、磺胺類、激素類等獸藥，其中有3份樣品未篩查出藥物殘留。27種藥物的具體匹配結果和匹配得分見表2，所有藥物的質量數(shù)誤差在-2.2～5.0 ppm之間，匹配分數(shù)均大于85分。

從匹配的過程可以看出，應用OPLS-DA分析法得到未知特征離子的質荷比(m/z)信息之后，需要查看特征離子的二級信息，確認特征離子的碎片信息，同時需根據特征離子的同位素分布情況，利用分子式生成功能，得到可能的分子式，其中包括根據同位素匹配程度得到的分數(shù)，分數(shù)越高，說明分子式匹配成功率越高。最后再根據特征離子的二級信息，確認結構式。

表1 16份飼料樣品的篩查結果

Table 1 Non-targeted screening of 16 feed samples

ND：no detected

表2 LC-Q-TOF/MS方法鑒定出的未知化合物Table 2 Non-target compounds identified in feed samples by LC-Q-TOF/MS

通過高分辨質譜的全掃描模式能夠獲得復雜樣品體系中相對較多的信息，利用統(tǒng)計學的方法對數(shù)據信息進行降維處理，將雜亂無章的質譜數(shù)據轉換成二維數(shù)據，通過模型判別，快速找出未知樣品中的未知離子，利用得到的精確質量、二級質譜和同位素豐度比3種條件進行未知物的匹配。首先，高分辨質譜儀器得到的精確質量數(shù)信息(精確到0.001)相比串聯(lián)質譜儀器得到的質荷比(m/z,精確到0.01)而言，縮小了相似質量的化合物范圍，這與Ibanez等[24]采用精確質量數(shù)確認水中未知化合物的報道相符。同位素豐度比值可以判定未知化合物的元素組成，二級質譜信息能夠反映化合物結構的斷裂情況，將這3種條件同時應用于未知化合物的分析有理論基礎，同時也有文獻依據，Bueno等[25]應用精確分子量、天然同位素豐度和二級質譜信息對河水中的藥物進行定性研究。譚和平等[26]通過與自建濫用藥物數(shù)據庫比對進行快速篩查，用精確分子量、同位素分布和碎片離子信息進行確證，發(fā)現(xiàn)中成藥中相對含量最高的3種成分均為非法添加藥物。Krauss等[27]應用高分辨質譜對環(huán)境中的未知物進行識別分析，得到精確質量數(shù)、同位素分布和二級質譜信息之后，基于上述3種信息，完成了對未知化合物的定性分析。

2.5 篩查結果的驗證及定量分析

表3 MRM檢測模式下12種藥物的儀器條件、含量結果Table 3 Parameters of multiple reaction monitoring and analysis results of 12 veterinary drugs

(續(xù)表3)

CompoundRetentiontime(min)Parention(m/z)Daughterion(m/z)Declusteringpotential(V)Collisionenergy(V)Content(mg/kg)Lacidipine(拉西地平)6.29456.2353.9,400.3*50,5035,30NDBendroflumethiazide(芐氟噻嗪)15.32422.1105.2,261.2*50,5020,2012.5,25.7

ND：no detected,*:quantitative ion

3 結 論

本研究建立了LC-Q-TOF/MS結合統(tǒng)計學方法對飼料中的未知物(獸藥)進行篩查分析，該方法結合了高分辨儀器的精確度、軟件快捷和準確性的優(yōu)勢，為未知物的篩查提供了快速、準確的分析方法，對未知樣品進行篩查之后，可以判定樣品中大致的獸藥成分，從而進行有目標的檢測研究，擴展了液質聯(lián)用儀器的應用范圍，為飼料中獸藥的篩查工作提供了技術參考。同時在養(yǎng)殖、生產過程中，可將正常的環(huán)境數(shù)據建庫，實時進行比對，一旦發(fā)現(xiàn)異常，可及時阻止問題的擴大化，減少損失，保證食品/農產品安全。

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Screening on Non-targeted Comporcents in Feed Using High Performance Liquid Chromatography Time-of-Flight Mass Spectrometry Combined with Chemometrics

HOU Can,QIU Jing*,CHENG Yong-you,ZHAO Lu-yao,YANG Shu-ming*

(Institute of Quality Standard and Testing Technology for Agro-products,Chinese Academy of Agricultural Sciences,Beijing 100081,China)

To screen feed for new or unexpected contaminants at the ppm level,a generic method was developed.The sample was extracted with 0.1%EDTA-acetonitrile-methanol (1∶1∶1,containing 0.1% formic acid) ,and analyzed by high-performance liquid chromatography coupled to electrospray ionization time-of-flight mass spectrometry(HPLC-Q-TOF/MS) in positive ionization mode.The data were collected after peak alignment (mass error within 50 mDa) ,noise filtration,elimination of useless peaks and statistical evaluation was performed based on Orthogonal Partial Least Squares Discriminant Analysis (OPLS-DA) .According to the score plot,S-plot and VIP,blind statistical evaluation revealed that feed samples could be separated regarding unknown components by OPLS-DA and them/z-retention time pair.With the assistance of MS/MS data,isotope abundance ratio,formula generation and self-built spectral library,the structures of unknown compounds were confirmed.The results showed that 27 veterinary drugs were screened out from 16 feed samples.By quantitative analysis of 12 existing veterinary drugs using liquid chromatography tandem mass spectrometry(LC-MS/MS) ,only two false positives appeared in the verification results,and the concentration levels of 12 veterinary drugs were between 12.5 mg/kg and 152.0 mg/kg.From the perspective of the results,TOF-MS data and OPLS-DA could be applied in the non-targeted screening of veterinary drugs in feed samples with high accuracy.

liquid chromatography quadrupole time-of-flight mass spectrometry (LC-Q-TOF/MS) ;non-targeted screening;orthogonal partial least squares discriminant analysis(OPLS-DA);feed;veterinary drugs

2016-04-18；

2016-06-10

農業(yè)部行業(yè)科技項目(201203023)

10.3969/j.issn.1004-4957.2016.11.007

O657.63;TQ460.72

A

1004-4957(2016)11-1409-07

*通訊作者：楊曙明，博士，研究員，研究方向：農產品質量安全檢測技術，Tel：010-82106561，E-mail：yangshumingcaas@sina.com 邱 靜，博士，研究員，研究方向：農產品風險評估與監(jiān)測，Tel：010-82106551，E-mail：qiujing@caas.cn