何睿偲，黃艷婷，雷 毅，王冬梅*

(1.中山大學(xué) 藥學(xué)院，廣東 廣州 510006;2.廣東省藥品檢驗(yàn)所，廣東 廣州 510180)

HPLC法快速篩查抗風(fēng)濕類中成藥或保健食品中21種非法添加化學(xué)成分

何睿偲1，黃艷婷2，雷 毅2，王冬梅1*

(1.中山大學(xué) 藥學(xué)院，廣東 廣州 510006;2.廣東省藥品檢驗(yàn)所，廣東 廣州 510180)

基于亞3 μm核殼填料色譜柱技術(shù)建立了高效液相色譜法快速篩查21種抗風(fēng)濕類化合物。供試品以1%乙酸-甲醇為提取溶劑，經(jīng)ACCHROM C18100A (4.6 mm×100 mm,2.8 μm)分離，以磷酸水溶液(pH 3.0)-甲醇-乙腈溶液為流動(dòng)相，梯度洗脫，檢測(cè)波長(zhǎng)為230 nm，流速1.0 mL/min，柱溫35 ℃。該方法在20 min內(nèi)可分離21種成分,各化合物的線性范圍為5～100 μg/mL(萘普生為1.5～30 μg/mL)，回收率為91.0%～109.1%。萘普生的檢出限(S/N=3)為0.8 mg/kg，其余化合物的檢出限為2.0 mg/kg。按上述方法對(duì)抽檢樣品進(jìn)行檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)18批陽(yáng)性樣品，并采用液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法進(jìn)一步確證。該方法快速、準(zhǔn)確，適用于抗風(fēng)濕類中成藥或保健食品中非法添加化學(xué)成分的快速篩查，具有廣闊的應(yīng)用前景。

抗風(fēng)濕；高效液相色譜法；中成藥；保健品；非法添加

近年來(lái)，食用保健食品和草藥膳食補(bǔ)充劑的人群在美國(guó)以及歐洲顯著增加[1-2]。隨著經(jīng)濟(jì)的發(fā)展，我國(guó)人民生活水平的提高，人們對(duì)身體狀況的關(guān)注度也逐漸提高，對(duì)保健食品的需求日益增大。相對(duì)于西藥，人們更偏向于副作用較小的中成藥或保健食品。不法生產(chǎn)廠家在中成藥和保健食品中摻加合成藥物，使消費(fèi)者以為該中成藥或保健食品具有明顯療效，持續(xù)購(gòu)買。商家從中謀取利潤(rùn)，從而導(dǎo)致非法添加的現(xiàn)象屢屢發(fā)生[3-4]。若患者在不知情的情況下長(zhǎng)期服用違法添加的中成藥，可能會(huì)引起嚴(yán)重后果。例如非甾體類藥物可能產(chǎn)生的不良反應(yīng)有血液毒性、肺部毒性、腎臟毒性、中樞及外周神經(jīng)系統(tǒng)損傷、出血和凝血障礙等[5-6]。糖皮質(zhì)激素則可能誘發(fā)或加重感染，其常見(jiàn)的不良反應(yīng)有血壓升高、血糖升高、血鉀降低、十二指腸潰瘍、骨質(zhì)疏松等[7-9]。

現(xiàn)有的抗風(fēng)濕類化學(xué)成分檢測(cè)主要分為非甾體類解熱鎮(zhèn)痛藥[10-11]和糖皮質(zhì)激素類藥物的檢測(cè)[12]。由于樣品中存在同時(shí)添加這兩類成分的可能性，近年來(lái)，文獻(xiàn)方法通常同時(shí)檢測(cè)這兩類藥物。例如，廖瑜[13]采用HPLC方法在30 min內(nèi)對(duì)10種抗風(fēng)濕類中成藥及保健食品中非法添加的化學(xué)藥物進(jìn)行檢測(cè)，黎雪清等[14]用HPLC建立了45 min內(nèi)檢測(cè)24種抗風(fēng)濕類非法添加化學(xué)成分的分析方法。國(guó)家食品藥品監(jiān)督管理局頒布的具有法律效力的抗風(fēng)濕類補(bǔ)充檢驗(yàn)方法[15]按3個(gè)體系檢測(cè)了13種成分，但操作繁瑣費(fèi)時(shí)。為提高監(jiān)督檢驗(yàn)效率，本文采用亞3 μm核殼HPLC色譜柱，建立了更加簡(jiǎn)便、快速的分析方法，在20 min內(nèi)對(duì)21種抗風(fēng)濕類化學(xué)成分進(jìn)行檢測(cè)。同時(shí)發(fā)現(xiàn)補(bǔ)充檢驗(yàn)方法或文獻(xiàn)方法中，用甲醇提取含有阿司匹林的樣品會(huì)導(dǎo)致阿司匹林快速分解，本實(shí)驗(yàn)改用1%乙酸-甲醇溶液對(duì)樣品進(jìn)行提取。運(yùn)用該方法首次在樣品中發(fā)現(xiàn)新添加成分奈福泮。本文建立的方法可用于快速檢測(cè)抗風(fēng)濕類中成藥或保健品中的非法添加化學(xué)成分。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 儀器與試劑

1.2 標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液制備與供試品處理

精密稱取對(duì)照品10 mg，用1%乙酸-甲醇溶解定容至10 mL容量瓶，配成1 mg/mL的標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液。

將供試樣品(膠囊劑、片劑或丸劑)研磨，取300 mg，精密稱定；置于50 mL容量瓶中，加1%乙酸-甲醇適量，超聲提取20 min，功率為80%(300 W)，頻率為40 kHz，放冷至室溫，加1%乙酸-甲醇稀釋至刻度，搖勻，過(guò)0.45 μm濾膜，即得。

1.3 HPLC色譜條件

色譜柱：ACCHROM Unitary C18100A(4.6 mm×100 mm,2.8 μm)。流動(dòng)相：A為磷酸水溶液(pH 3.0)，B為甲醇-乙腈(50∶50)；梯度洗脫：0～8 min，94%～40% A，8～20 min，40%～20% A。流速：1.0 mL/min；柱溫：35 ℃；檢測(cè)波長(zhǎng)：230 nm；進(jìn)樣量：10 μL。

1.4 HPLC-MS/MS 色譜條件

色譜柱：Phenomenexluna C18色譜柱(2.0 mm×150 mm,3 μm)；流速：0.2 mL/min；柱溫：40 ℃；進(jìn)樣量：10 μL。

①正離子采集模式：流動(dòng)相為0.02 mol/L乙酸銨-水溶液(A)，甲醇(B)；梯度洗脫：0～2 min，20%～60% B，2～6 min，60%～80% B，6～10 min，80% B，10～12 min，80%～20% B，12～17 min，20% B；②負(fù)離子采集模式：流動(dòng)相為0.02 mol/L乙酸銨-水溶液(A)，乙腈(B)；梯度洗脫:0～9 min，20%～75%B，9～10 min，75%～20%B，10～15 min，20% B。

質(zhì)譜條件：離子源：電噴霧電離(ESI)；霧化氣8 psi；氣簾氣8 psi；噴霧電壓正離子模式5.0 kV，負(fù)離子模式-5.0 kV；離子源溫度450 ℃；碰撞池出口電壓：正離子模式 15 V，負(fù)離子模式-15 V。21種抗風(fēng)濕類化學(xué)成分的質(zhì)譜離子對(duì)見(jiàn)表1。

表1 21種化合物的線性方程、線性范圍、相關(guān)系數(shù)及定量離子對(duì)Table 1 Linear equations，linear ranges，correlation coefficients(r) and quantitative ion pairs of 21 compounds

*are the negative ion collection mode,the rest are the positive ion collection mode(負(fù)離子采集模式，其余為正離子采集模式)

2 結(jié)果與討論

2.1 檢測(cè)波長(zhǎng)的選擇

2.2 提取溶劑的選擇

按照補(bǔ)充檢驗(yàn)方法以及文獻(xiàn)[15-17]的配制方法，加甲醇溶解對(duì)照品與供試品。在實(shí)驗(yàn)過(guò)程中發(fā)現(xiàn)阿司匹林在甲醇中會(huì)分解，產(chǎn)生水楊酸。導(dǎo)致用甲醇提取的供試品，回收率在8 h后降至53.4%。針對(duì)這一現(xiàn)象，考察了1%乙酸-甲醇溶液、乙腈對(duì)阿司匹林的影響，發(fā)現(xiàn)用乙腈提取的供試品中阿司匹林幾乎不分解；而用1%乙酸-甲醇溶液提取時(shí)，阿司匹林存在緩慢分解的情況，猜測(cè)可能是甲醇的羥基進(jìn)攻阿司匹林，導(dǎo)致阿司匹林分解，產(chǎn)生酸性產(chǎn)物水楊酸，而加入1%乙酸能抑制阿司匹林分解成水楊酸的反應(yīng)。在1%乙酸-甲醇溶液體系中，隨著時(shí)間的推移，阿司匹林持續(xù)發(fā)生分解，經(jīng)過(guò)8，12，24 h后，阿司匹林的峰面積分別為初始峰面積的96.0%，92.9%和88.3%，24 h內(nèi)的穩(wěn)定性(RSD)為4.6%。選取1%乙酸-甲醇、乙腈對(duì)21種成分以及阿司匹林的降解產(chǎn)物水楊酸進(jìn)行提取分析，發(fā)現(xiàn)1%乙酸-甲醇對(duì)化合物的分離度和峰形不產(chǎn)生影響，而乙腈影響對(duì)乙酰氨基酚和氨基比林的峰形。綜合考慮，選取1%乙酸-甲醇溶解、稀釋對(duì)照品與供試品，含阿司匹林的供試品溶液需在制備后8 h內(nèi)完成HPLC分析。

2.3 色譜條件的優(yōu)化

考察了水-乙腈、0.1%乙酸水-甲醇、0.02 mol/L乙酸銨-乙腈、磷酸二氫鉀(pH 3.0)-甲醇、磷酸水溶液(pH 3.0)-乙腈、磷酸水溶液(pH 3.0)-甲醇-乙腈6種流動(dòng)相體系對(duì)色譜峰和分離效果的影響。結(jié)果表明，使用磷酸水溶液(pH 3.0)-甲醇-乙腈作為流動(dòng)相得到的色譜峰和分離效果較優(yōu)，21種化合物與阿司匹林分解產(chǎn)物水楊酸(峰編號(hào)為22)的HPLC色譜圖見(jiàn)圖1A。

2.4 線性關(guān)系與檢出限

精密量取標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液，按比例稀釋成濃度分別為5，10，25，50，100 μg/mL(萘普生為1.5，3.0，7.5，15，30 μg/mL)的系列標(biāo)準(zhǔn)溶液。由于萘普生的響應(yīng)度較高，因此配制成1.5，3.0，7.5，15，30 μg/mL的系列標(biāo)準(zhǔn)溶液。按“1.3”色譜條件進(jìn)樣測(cè)定。結(jié)果顯示：各化合物在5～100 μg/mL(其中萘普生在1.5～30 μg/mL)范圍內(nèi)呈良好的線性關(guān)系，相關(guān)系數(shù)均大于0.999 0(見(jiàn)表1)。萘普生的檢出限(S/N=3)為0.8 mg/kg，其余化合物的檢出限為2 mg/kg。

2.5 回收率

2.6 精密度與穩(wěn)定性

取加有對(duì)照品的陰性供試品溶液，重復(fù)進(jìn)樣6 次，按“1.3”色譜條件測(cè)定，結(jié)果21種成分峰面積的RSD不大于1.0%，表明精密度良好。在室溫下放置1，2，4，8，12，24 h后，按“1.3”色譜條件測(cè)定，除阿司匹林的峰面積RSD為4.6%，其余各成分的RSD不大于1.0%。結(jié)果表明：除阿司匹林外，供試品溶液在配制后24 h內(nèi)穩(wěn)定。阿司匹林在8 h內(nèi)穩(wěn)定，其8 h內(nèi)穩(wěn)定性的RSD為1.8%。

2.7 實(shí)際樣品分析

按照所建立的方法對(duì)70個(gè)抽檢樣品進(jìn)行檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)18個(gè)樣品呈陽(yáng)性，結(jié)果見(jiàn)表2。在樣品中首次檢出奈福泮，含量為2.0 mg/g(見(jiàn)圖1B)。其中有4個(gè)樣品來(lái)自網(wǎng)購(gòu)，均呈陽(yáng)性，表明網(wǎng)絡(luò)營(yíng)銷產(chǎn)品具有較大風(fēng)險(xiǎn)。按照“1.4”所述HPLC-MS/MS 色譜條件，對(duì)實(shí)際樣品進(jìn)行確證，所得結(jié)果與高效液相色譜一致。說(shuō)明本文所建立的快速檢測(cè)抗風(fēng)濕類化學(xué)成分的HPLC方法具有可靠性。

表2 樣品的測(cè)定結(jié)果Table 2 Determination results of samples

(續(xù)表2)

SampleIllegallyadulterationchemicalFENGSHILING(風(fēng)濕靈)Piroxicam(吡羅昔康,97.5mg/g),Dexamethasone-17-acetate(醋酸地塞米松,6.4mg/g),Ibuprofen(布洛芬,131.6mg/g)GUKANGFUSHEMUGUAJIAONANG(骨康蝮蛇木瓜膠囊)Nefopam(奈福泮,2.0mg/g),Piroxicam(吡羅昔康,17.8mg/g),Naprox-en(萘普生,86.8mg/g),Diclofenac(雙氯芬酸,88.7mg/g),Indometacin(吲哚美辛,52.0mg/g),Ibuprofen(布洛芬,184.5mg/g)NANLIANGUJIELING(南聯(lián)骨節(jié)靈)Indometacin(吲哚美辛,61.7mg/g)GUJIELING(骨節(jié)靈)Diclofenac(雙氯酚酸,21.7mg/g)TEXIAOFENGSHIWAN(特效風(fēng)濕丸)Diclofenac(雙氯酚酸,30.8mg/g),Ibuprofen(布洛芬,115.6mg/g)XUELIANHUAQINGHUOKELI(雪蓮花清火顆粒)Piroxicam(吡羅昔康,0.1mg/g),Phenylbutazone(保泰松,0.1mg/g),Diclofenac(雙氯酚酸,0.3mg/g)SHENJINZHUANGGUJIAONANG(伸筋壯骨膠囊(濃縮型))Piroxicam(吡羅昔康,6.8mg/g),Diclofenac(雙氯酚酸,52.0mg/g),Ibu-profen(布洛芬,145.7mg/g)ZHUANGGUBUGAIWAN(壯骨補(bǔ)鈣丸)Piroxicam(吡羅昔康,7.0mg/g),Ibuprofen(布洛芬,89.3mg/g)TOUGUKANGTIEGAO(透骨康貼膏)Diclofenac(雙氯酚酸,1.2mg/g)WANTONGJINGUWANG(萬(wàn)通筋骨王)Piroxicam(吡羅昔康,5.5mg/g),Diclofenac(雙氯酚酸,47.5mg/g),In-dometacin(吲哚美辛,23.0mg/g)FENGHANTONGSHIWAN(風(fēng)寒痛濕丸)Ibuprofen(布洛芬,21.0mg/g)XIAOTONGCILIAOTIE(消痛磁療貼)Diclofenac(雙氯酚酸,1.2mg/g)JIANZHENGSHENQI(見(jiàn)證神奇)Piroxicam(吡羅昔康,7.5mg/g),Diclofenac(雙氯酚酸,20.2mg/g)

3 結(jié) 論

本文建立了20 min內(nèi)同時(shí)測(cè)定21種抗風(fēng)濕類化學(xué)藥物的HPLC色譜法，同時(shí)在HPLC色譜條件下增加了水楊酸的考察，擴(kuò)大了監(jiān)控范圍，若在樣品中發(fā)現(xiàn)水楊酸的峰，應(yīng)考慮樣品中是否存在阿司匹林。本文在樣品中發(fā)現(xiàn)非法添加成分奈福泮，也發(fā)現(xiàn)樣品中存在添加不屬于補(bǔ)充檢驗(yàn)方法檢測(cè)范圍內(nèi)的化學(xué)成分醋酸地塞米松。該法選擇性好、快速簡(jiǎn)便、可操作性強(qiáng)、準(zhǔn)確可靠，極大地提高了檢測(cè)效率，具有實(shí)際應(yīng)用價(jià)值，已用于日常檢測(cè)。

[1] Filipiak-Szok A,Kurzawa M,Szyk E.J.TraceElem.Med.Biol.,2015,30:54-58.

[2] Zelig R,Radler D R.Nutrit.Clin.Pract.,2012,27(6):767-776.

[3] Shen L H.Pharm.Clin.Res.(申蘭慧.藥學(xué)與臨床研究),2010,18(4):411-413.

[4] Lu Y,Han D Q,Li X Q,Yin G,Wang J,Wang T J.Chin.Pharm.Affairs(魯藝,韓東岐,黎雪清,殷果,王玨,王鐵杰.中國(guó)藥事),2015,29(8):775-781.

[5] Niu S P,Huang C B.Clin.Med.J.(牛素平,黃慈波.臨床藥物治療雜志),2011,9(4):34-36.

[6] Wei J,Pan W S,Yang Y,Wang Y X.Chin.Pharm.Affairs(魏晶,潘衛(wèi)三,楊悅,王瑜歆.中國(guó)藥事),2010,24(7):725-728.

[7] Wang X Y.J.Clin.Exp.Med.(王學(xué)葉.臨床和實(shí)驗(yàn)醫(yī)學(xué)雜志),2008,7(10):133-134.

[8] Wang Y Q,Wen M H,Chang M,Ding Q H,Zeng Y,Meng L,Wu X G,Tang Z,Niu G S.AdverseDrugReactionsJournal(王育琴,聞滿華,常明,丁慶華,曾艷,孟莉,吳曉光,湯哲,牛光勝.藥物不良反應(yīng)雜志),2004,2:78-82.[9] Xie S H,Qiu B D.GuideChin.Med.(謝書(shū)和,邱邦東.中國(guó)醫(yī)藥指南),2011,9(3):29-30.

[10] Patel P N,Samanthula G,Shrigod V,Modh S C,Chaudhari J R.Chromatogr.Res.Int.,2013,(4):1-13.

[11] Li C J,Guo F Y.Chin.Tradit.PatentMed.(李存金,郭飛宇.中成藥),2010,32(12):2191-2194.

[12] Pan J.Chin.Tradit.PatentMed.(潘軍.中成藥),2014,36(11):2323-2326.

[13] Liao Y.Chin.J.Mod.Appl.Pharm.(廖瑜.中國(guó)現(xiàn)代應(yīng)用藥學(xué)),2014,31(7):868-871.

[14] Li X Q,Tan M,Jiang C J,Han D Q,Yin G,Chen X H.Chin.Tradit.PatentMed.(黎雪清,譚渺,蔣創(chuàng)杰,韓東岐,殷果,陳曉輝.中成藥),2014,36(9):1891-1894.

[15] 2009025.TraditionalChineseMedicineofAnti-rheumatic.State Food and Drug Administration Inspection and Additional Testing Methods and Project Approval Documents.(抗風(fēng)濕類中成藥.國(guó)家食品藥品監(jiān)督管理局藥品檢驗(yàn)補(bǔ)充檢驗(yàn)方法和檢驗(yàn)項(xiàng)目批準(zhǔn)件).

[16] Li X Q,Lu Y,Wang T J,Yin G,Han D Q,Jiang K.Chin.Med.Herald(黎雪清,魯藝,王鐵杰,殷果,韓東岐,江坤.中國(guó)醫(yī)藥導(dǎo)報(bào)),2015,12(6):86-90.

[17] Li D,Wen H M,Cui F C,Huang Y,Guo C,Sun X R,Yang J P.Chin.J.Pharm.Anal.(李丹,文紅梅,崔福春,黃亞,郭春,孫夏榮,楊婧平.藥物分析雜志),2010,30(8):1527-1532.

Rapid Determination of 21 Adulterants in Anti-rheumatic Chinese Patent Drugs or Dietary Supplements by HPLC

HE Rui-si1，HUANG Yan-ting2，LEI Yi2，WANG Dong-mei1*

(1.School of Pharmaceutical Sciences,Sun Yat-sen University,Guangzhou 510006,China;2.Guangdong Institute for Drug Control,Guangzhou 510180,China)

A method for the rapid determination of 21 adulterants in anti-rheumatic Chinese patent drugs or dietary supplements was established by HPLC using sub-3 μm fused-core silica particles columns.The samples were extracted with 1% acetic acid-methanol,and separated on the fused-core column ACCHROM C18100A (4.6 mm×100 mm,particle size 2.8 μm) column by gradient elution with a water solution of phosphoric acid (pH 3.0)-methanol-acetonitrile as mobile phase at a flow rate of 1.0 mL/min.The detection wavelengths were set at 230 nm and the column temperature was set at 35 ℃.Under the conditions,21 compounds could be separated within 20 min,and the calibration curve of naproxen showed a good linearity in the range of 1.5-30 μg/mL while those of the other 20 compounds were in the range of 5-100 μg/mL，and the detection limits(S/N=3) were 0.8 mg/kg for naproxen and 2.0 mg/kg for other compounds.The recoveries were between 91.0% and 109.1%.The method was applied in the detection of real samples,and 18 positive samples were found.The samples were further confirmed by HPLC-MS/MS.The results indicated that this method was rapid and accurate,and could be used for the rapid determination of illegal adulteration in anti-rheumatic Chinese patent drugs or dietary supplements,which indicates its extensive application prospect.

anti-rheumatic;high performance liquid chromatography(HPLC);Chinese patent drugs;dietary supplements;adulteration

2016-05-06；

2016-06-13

廣東省科技計(jì)劃項(xiàng)目(2013B090200059)；廣州市健康產(chǎn)品非法添加化學(xué)成分快速檢測(cè)技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室項(xiàng)目(2013年)

10.3969/j.issn.1004-4957.2016.11.021

O657.72;TQ460.72

A

1004-4957(2016)11-1486-05

*通訊作者：王冬梅，博士，副教授，研究方向：天然藥物的研究，Tel:020-39943042，E-mail:lsswdm@mail.sysu.cn