艾紅輝，鐘 偉，龍 平，吳英華，胡錦芳

(南昌大學(xué)第一附屬醫(yī)院耳鼻咽喉頭頸外科，南昌 330006)

miR-155在變應(yīng)性鼻炎患者血清中的高表達(dá)

艾紅輝，鐘 偉，龍 平，吳英華，胡錦芳

(南昌大學(xué)第一附屬醫(yī)院耳鼻咽喉頭頸外科，南昌 330006)

目的 探討miR-155在變應(yīng)性鼻炎(allergic rhinitis,AR)患者外周血清中的表達(dá)。方法 分別提取變應(yīng)性鼻炎及健康人群外周血清中總RNA并進(jìn)行質(zhì)檢;應(yīng)用實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)檢測(cè)驗(yàn)證變應(yīng)性鼻炎患者外周血清中miR-155與正常對(duì)照者的表達(dá)差異。結(jié)果 AR患者外周血中細(xì)胞總數(shù)及嗜酸性粒細(xì)胞數(shù)高于正常對(duì)照組，血清中miR-155顯著高于正常對(duì)照組，是正常對(duì)照組的2.1倍。結(jié)論 miR-155在AR患者血清中為高表達(dá)。

變應(yīng)性鼻炎; miRNA-155； 血清； 高表達(dá)

變應(yīng)性鼻炎(allergic rhinitis，AR)是耳鼻喉科的常見病和多發(fā)病,其典型臨床表現(xiàn)為反復(fù)發(fā)作的鼻癢、噴嚏及清水樣涕，是一種全身免疫紊亂在上呼吸道的表現(xiàn)。保守估計(jì)全球的AR患者超過(guò)5億[1]，我國(guó)也早在2004年就進(jìn)行AR流行狀況的多中心調(diào)查[2],發(fā)病率高達(dá)20%[3]。本病的關(guān)鍵在于Th2>Thl的免疫反應(yīng)，此病易治療難控制。近年來(lái)，MicroRNA在變應(yīng)性鼻炎發(fā)生發(fā)展中的作用已日益受到關(guān)注。在眾多miRNA當(dāng)中，microRNA-155是免疫系統(tǒng)最主要的miRNA之一，在活化的各種免疫細(xì)胞中表達(dá)普遍升高，廣泛參與固有免疫應(yīng)答和適應(yīng)性免疫應(yīng)答。

本文通過(guò)檢測(cè)AR中血清miRNA-155的表達(dá)情況，分析求證在AR發(fā)病過(guò)程中miRNA在血清中的特異性表達(dá)，探討其可能的診斷和預(yù)后的靶點(diǎn)。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選擇2012年1至2013年1月南昌大學(xué)第一附屬醫(yī)院耳鼻咽喉頭頸外科接診的AR患者(AR組)22例，年齡16～40歲，其中男15例，女7例，平均年齡21.5歲。均符合2009年福建武夷山制定的《變應(yīng)性鼻炎診斷和治療指南》的標(biāo)準(zhǔn)確診[4]，為持續(xù)性變應(yīng)性鼻炎，癥狀為中-重度，皮膚點(diǎn)刺試驗(yàn)中僅屋塵螨()，且不伴有鼻竇炎、哮喘及阿司匹林耐受不良等疾病，最近3個(gè)月內(nèi)未接受全身或局部糖皮質(zhì)激素治療，未經(jīng)抗組胺和免疫治療。同時(shí)選擇在本科要求體檢年齡、性別相當(dāng)健康人22例作為對(duì)照組，男13例，女9例，平均年齡19.08歲，皮膚點(diǎn)刺試驗(yàn)全部陰性。所有受試者均需常規(guī)檢查取血，在征求知情同意后入組備血，并簽署知情同意書，報(bào)由南昌大學(xué)第一附屬醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。全部患者均采取肘靜脈取血。

1.2 標(biāo)本收集與檢測(cè)方法

1.2.1 標(biāo)本采集與處理

所有入組人員常規(guī)檢測(cè)血壓，查血常規(guī)，C反應(yīng)蛋白，嗜酸性粒細(xì)胞；同時(shí)備血通過(guò)2次離心獲得無(wú)細(xì)胞血清，簡(jiǎn)言之：離心得上層血清后，在取血30 min 內(nèi)以1500 r·min-1離心10 min，取上層血清于-80 ℃ 冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 血清總RNA的提取與質(zhì)檢

采用美國(guó)Qiagen公司試劑盒(miRNeasy Serum/Plasma Kit)并參照說(shuō)明書分別提取變應(yīng)性鼻炎組與對(duì)照組的總RNA。紫外分光光度計(jì)分別測(cè)定波長(zhǎng)230、260和280 nm的吸光度(A)值，確定樣品總RNA的純度和濃度；甲醛變性瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)樣品總RNA中28 s和18 s的比例，評(píng)估RNA純度及完整性。

1.2.3 實(shí)時(shí)熒光定量PCR

使用美國(guó)Qjagen公司試劑盒fmiScript SYBR Green PCR Kit)，根據(jù)說(shuō)明書進(jìn)行。驗(yàn)證變應(yīng)性鼻炎患者與對(duì)照者中miR-155的表達(dá)[5]。

取總RNA各1 μg進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄。RT引物序列:miR-155，5’-GTGCGTGTCGTGGAGTCG-3’。RT反應(yīng)程序:16 ℃ 30 min,42 ℃ 42 min，85 ℃5 min。實(shí)時(shí)定量PCR反應(yīng)體系:反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物1 μL，dNT P(2.5 mmol) 21 μL，10×PCR緩沖液2.5 μL，MgCl2溶液1.5 μL,T aq聚合酶1 U，SYBER greenⅠ終濃度0.25×10 μmol的PCR特異引物(miR-574-5p：5’-GGGGGTGAGTGTGTGTGTGT-3’，5’-GTGCGTGTCGTGGAGTCG-3’)1 μL，加水至總體積為25 μL。Realt imePCR儀進(jìn)行檢測(cè)。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 樣品總RNA質(zhì)量鑒定

血清中提取的總RNA純度高，蛋白質(zhì)和DNA污染少，總RNA中各條帶清晰，無(wú)明顯降解現(xiàn)象(封四圖1)。質(zhì)量鑒定結(jié)果表明各樣品總RNA質(zhì)量符合miRNA微陣列要求，可以進(jìn)行后續(xù)芯片實(shí)驗(yàn)。

2.2 AR組外周血?dú)獾姥装Y明顯高于正常對(duì)照組

AR組外周血中嗜酸粒細(xì)胞增多，符合變應(yīng)性鼻炎特征表現(xiàn)(封四圖2，P<0.05,n=22)。

2.3 AR組血清miRNA-155顯著高于正常對(duì)照組

Real-time PCR法檢測(cè)AR組血清miRNA-155的表達(dá)，結(jié)果顯示:符合變應(yīng)性鼻炎癥狀體征、皮膚過(guò)敏原點(diǎn)刺試驗(yàn)陽(yáng)性的AR患者，血清miRNA-155表達(dá)量約為正常對(duì)照組的2.1倍(封四圖3，P<0.05,n=22)。

2.4 miR-155與炎癥指標(biāo)的相關(guān)分析

血清miRNA-155表達(dá)水平與臨床炎癥指標(biāo)EO%呈正相關(guān)(封四圖4，r=0.346，P<0.01)。進(jìn)一步進(jìn)行線性逐步回歸分析，結(jié)果顯示EO%與miRNA-155水平呈獨(dú)立正相關(guān)(r=2.968.847，P=0.440，P=0.001)。

3 討論

微小核糖核酸(microRNAs,miRNA)是一類在轉(zhuǎn)錄后基因調(diào)控中發(fā)揮功能的非編碼小RNAs,在發(fā)育、生長(zhǎng)的分化等過(guò)程中發(fā)揮重要作用。miRNA可以通過(guò)降解mRNA或抑制蛋白翻譯的方式調(diào)節(jié)特異基因表達(dá)。無(wú)論是健康人或者患者血清中都存在大量的miRNA,都有特異性表達(dá)。由于外周血的獲得越來(lái)越簡(jiǎn)單，能在血液中檢出特異性的miRNA并將其作為變應(yīng)性鼻炎的生物學(xué)標(biāo)志具有更廣泛的意義。

血清miRNA在過(guò)敏性鼻炎中的功能和表達(dá)研究相對(duì)較少。Shao等[6]研究發(fā)現(xiàn)，在過(guò)敏性鼻炎患者鼻黏膜中有9個(gè)miRNAs發(fā)生兩倍以上的變化，經(jīng)驗(yàn)證發(fā)現(xiàn)miR-143、miR-187和miR-224表達(dá)水平降低。本研究通過(guò)比較變應(yīng)性鼻炎患者與健康試驗(yàn)者血清miR-155的表達(dá)情況，提示miR-155在變應(yīng)性鼻炎中的高表達(dá)，可能miR-155是參與變應(yīng)性鼻炎發(fā)病的miRNA,這對(duì)AR患者個(gè)性化的診斷、治療，具有良好的前景及潛在性價(jià)值。

[1] Bousquet J,Khaltaev N,Cruz A A,et al.Allergic rhinitis and its impact on asthma(ARIA)2008 update(in collaboration with the world health organization，GA2LEN and AllerG-en)[J].Allergy,2008,63:8-160.

[2] 韓德民，張羅，黃丹，等.我國(guó)11個(gè)城市變應(yīng)性鼻炎自報(bào)患病率調(diào)查[J].中華耳鼻咽喉頭頸外科學(xué)雜志,2007,42(5):378-384.

[3] Zhao J,Bai J,Shen K,et al.Self-reported prevalence of childhood allergic diseases in three cities of China:a multicenter study[J].BMC Public Health，2010,10:551.

[4] 中華耳鼻咽喉頭頸外科雜志編委會(huì).變應(yīng)性鼻炎診斷和治療指南(2009 年，武夷山)[J].中華耳鼻咽喉頭頸外科雜志，2009，44(12):977-978.

[5] 揭偉，王曉燕，羅泊濤，等.應(yīng)用微陣列芯片分析不同分化鼻咽癌細(xì)胞株miRNA 的表達(dá)[J].華中科技大學(xué)學(xué)報(bào):醫(yī)學(xué)版,2010,6(39):336-341.

[6] Shao Q Y，Ru X Z，Guo J L，et al.Microarray analysis of differentially expressed microRNAs in allergic rhinitis[J].Am J Rhinol Allergy，2011，25(6):e242-e246.

(責(zé)任編輯：劉大仁)

High Expression of miRNA-155 in Serum of Patients with Allergic Rhinitis

AI Hong-hui,ZHONG Wei,LONG Ping,WU Ying-hua,HU Jin-fang

(DepartmentOtolaryngologyHeadandNeckSurgeryoftheFirstAffiliatedHospitalofNanchangUniversity,Nanchang330006,China)

Objective To investigate the expression of microRNA-155 (miR-155) in serum of patients with allergic rhinitis.Methods Total RNA was extracted from the serum of allergic rhinitis patients and healthy subjects,and the expression of miR-155 was detected by real-time quantitative PCR.Results The total number of cells and the number of eosinophils in peripheral blood in allergic rhinitis patients were higher than those in healthy subjects.Moreover,serum expression of miR-155 in allergic rhinitis patients was 2.1 times as high as that in healthy subjects.Conclusion The miRNA-155 is highly expressed in serum of patients with allergic rhinitis.

allergic rhinitis; miRNA-155; serum; high expression

2016-08-20

江西省科技廳2011年計(jì)劃課題(20112BBG70046)

艾紅輝(1966—)，女，碩士，副主任醫(yī)師，主要從事耳鼻咽喉科疾病的臨床研究。

R765.21

A

1009-8194(2016)11-0064-02

10.13764/j.cnki.lcsy.2016.11.026