趙海勇　馬　娜　田發(fā)明

(唐山市工人醫(yī)院骨外科，河北　唐山　063000)

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辛伐他汀對DH豚鼠自發(fā)性膝骨性關(guān)節(jié)炎關(guān)節(jié)軟骨退變的影響

趙海勇馬娜田發(fā)明1

(唐山市工人醫(yī)院骨外科，河北唐山063000)

〔摘要〕目的探討辛伐他汀灌胃干預(yù)對DH豚鼠原發(fā)性膝骨關(guān)節(jié)炎(OA)關(guān)節(jié)軟骨退變的影響。方法3個月齡DH豚鼠18只，6只在實(shí)驗(yàn)開始時處死(基線組)，其余12只分別給予辛伐他汀(20 mg·kg(-1)·d(-1))(辛伐他汀組)或生理鹽水灌胃(對照組)，6個月后處死所有動物。留取靜脈血備行酶聯(lián)免疫吸附(ELISA)檢測分析白細(xì)胞介素(IL)-1β的表達(dá)；取膝關(guān)節(jié)股骨行常規(guī)石蠟包埋，經(jīng)Van Gieson(VG)染色及國際骨性關(guān)節(jié)炎研究協(xié)會(OARSI)評分，評價軟骨退變情況，免疫組化染色檢測IL-1β的表達(dá)；對脛骨軟骨下骨行Micro-CT分析骨密度(BMD)、相對體積(BV/TV)、骨小梁厚度(Tb.Th)、骨小梁數(shù)量(Tb.N)及結(jié)構(gòu)模型指數(shù)(SMI)。結(jié)果①血清學(xué)指標(biāo)：辛伐他汀組和對照組IL-1β水平顯著高于基線組，辛伐他汀組顯著低于對照組(P<0.05)；②關(guān)節(jié)軟骨組織學(xué)評價：與基線組相比，對照組關(guān)節(jié)軟骨出現(xiàn)退變表現(xiàn)，OARSI評分顯著升高(P<0.05)，辛伐他汀組與對照組無顯著差別；③免疫組化染色結(jié)果提示辛伐他汀組和對照組關(guān)節(jié)軟骨IL-1β的表達(dá)水平顯著高于基線組，但辛伐他汀組和對照組無顯著區(qū)別；④軟骨下骨Micro CT檢測結(jié)果：辛伐他汀組及對照軟骨下骨BMD、Tb.Th顯著高于基線組，SMI顯著低于基線組(P<0.05)，辛伐他汀組與對照組無顯著差別。結(jié)論辛伐他汀系統(tǒng)性干預(yù)可降低DH豚鼠血IL-1β水平，但不能抑制其膝關(guān)節(jié)軟骨自發(fā)性退變及軟骨下骨骨量和微觀結(jié)構(gòu)的改變。

〔關(guān)鍵詞〕骨性關(guān)節(jié)炎；辛伐他??；白細(xì)胞介素-1β

原發(fā)性骨性關(guān)節(jié)炎(OA)是中老年最常見的骨關(guān)節(jié)疾病，據(jù)世界衛(wèi)生組織統(tǒng)計(jì)，65歲以上女性人群OA的發(fā)病率為70%，男性為60%〔1，2〕。45歲以上人群OA發(fā)病率為26.6%，其中膝關(guān)節(jié)OA發(fā)病率為13.8%，在所有關(guān)節(jié)中最高〔3～5〕。研究提示辛伐他汀(SIM)體外干預(yù)可抑制白細(xì)胞介素(IL)-1誘發(fā)的軟骨細(xì)胞衰老和炎癥反應(yīng)〔6〕，體內(nèi)干預(yù)關(guān)節(jié)腔內(nèi)注射可以部分阻止關(guān)節(jié)失穩(wěn)誘發(fā)的大鼠繼發(fā)性關(guān)節(jié)炎進(jìn)程〔7〕。通過系統(tǒng)給藥觀察SIM對原發(fā)性O(shè)A模型的干預(yù)效果目前尚未見報(bào)道，本研究分析SIM對DH豚鼠OA進(jìn)程的干預(yù)效果及可能機(jī)制。

1 材料與方法

1.1試劑與藥品SIM(浙江瑞邦藥業(yè)，國藥準(zhǔn)字H20000007)，大鼠IL-1b ELISA試劑盒(上海鑫樂生物，xl-Er0187)，Van Gieson染液(上海哈靈生物科技有限公司)，IL-1β多克隆抗體(武漢博士德生物技術(shù)有限公司，BA2782)。

1.2實(shí)驗(yàn)動物及處理18只3個月齡SPF級雌性DH豚鼠(北京維通利華實(shí)驗(yàn)動物技術(shù)有限公司，SCXK京，2012-0001)，飼養(yǎng)于河北聯(lián)合大學(xué)實(shí)驗(yàn)動物中心屏障實(shí)驗(yàn)室，于室溫20℃自然光照條件下自由飲食水。隨機(jī)分為3組，每組6只，基線對照組(BL組)于實(shí)驗(yàn)開始時處死，其余兩組分別給予SIM(SIM組，20 mg·kg-1·d-1)或生理鹽水(對照組)灌胃干預(yù)，9個月齡時處死所有動物。處死前留取靜脈血，備行ELISA檢測。取膝關(guān)節(jié)脛骨備行Micro-CT分析，股骨制備常規(guī)石蠟切片，備行Van Gieson(VG)染色。

1.3ELISA檢測血清IL-1水平用ELISA法檢測血清IL-1β的含量，酶標(biāo)儀450 nm處讀取OD值。以標(biāo)準(zhǔn)品濃度為橫坐標(biāo)，以O(shè)D值為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，通過標(biāo)準(zhǔn)曲線及各樣本的OD值，計(jì)算IL-1β量。

1.4VG 染色及組織學(xué)評分膝關(guān)節(jié)標(biāo)本經(jīng)10%甲醛固定，15%乙二胺四乙酸(EDTA)-2Na脫鈣3個月，針刺確定標(biāo)本軟化后，石蠟包埋制備5 μm厚度切片，行VG染色，光鏡下觀察關(guān)節(jié)軟骨退變情況。采用國際骨性關(guān)節(jié)炎研究協(xié)會(OARSI)評分標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行組織學(xué)評分。主要通過觀察關(guān)節(jié)軟骨結(jié)構(gòu)(0～8分)、軟骨基質(zhì)著色(0～6分)、軟骨細(xì)胞分布及數(shù)量(0～3分)、潮線是否完整(0～1)及有否骨贅形成(0～3分)等5個方面對軟骨退變程度進(jìn)行量化分析〔8〕，退變越嚴(yán)重分值越高，每組6個樣本分別由兩位經(jīng)過專業(yè)培訓(xùn)的實(shí)驗(yàn)人員遵循雙盲原則進(jìn)行評分，然后計(jì)算出每個樣本的均值。

1.5免疫組織化學(xué)染色觀察IL-1β在軟骨組織中的表達(dá)石蠟切片經(jīng)60℃烤箱烘烤30 min，二甲苯脫蠟，梯度酒精水化，3%H2O2室溫下孵育6～8 min，阻斷內(nèi)源性過氧化物酶活性，磷酸鹽緩沖液(PBS)沖洗，滴加IL-1β一抗試劑(20 μl，稀釋比例1∶100)，置于4℃冰箱中12 h過夜；32℃烤箱中復(fù)溫20 min，PBS沖洗后每張切片滴加20 μl酶二抗聚合物，室溫下孵育30～40 min；PBS洗后滴加30 μl二氨基聯(lián)苯胺(DAB)顯色，顯微鏡下觀察，適時終止；蘇木素復(fù)染8 min，0.5%鹽酸酒精分化10 s，自來水沖洗30 min返藍(lán)；切片經(jīng)梯度酒精脫水，二甲苯透明，中性樹膠封片。參照以往研究〔9〕，對IL-1β在關(guān)節(jié)軟骨中的表達(dá)進(jìn)行半定量評分，分別按照陽性細(xì)胞表達(dá)比例高低(由低到高0～5分)及表達(dá)強(qiáng)度(由低到高0～3分)評分，兩者之和為最終得分。樣本量及雙盲原則同OARSI組織學(xué)評分。

1.6軟骨下骨Micro-CT分析應(yīng)用SkyScan 1076 Micro-CT，在40 kVp及250 μA的條件下對脛骨軟骨下骨進(jìn)行掃描檢測，收集數(shù)據(jù)，并利用Micro-CT配套軟件對掃描圖像進(jìn)行三維重建及結(jié)果分析。興趣區(qū)為軟骨下骨骨板下0.5～4 mm，直徑為9 μm的圓柱體(皮質(zhì)骨內(nèi)側(cè)的松質(zhì)骨)。主要檢測指標(biāo)包括：骨密度(BMD)、骨小梁相對體積(BV/TV)、骨小梁厚度(Tb.Th)、結(jié)構(gòu)模型指數(shù)(SMI)。

1.7統(tǒng)計(jì)學(xué)方法應(yīng)用SPSS19.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行單因素方差分析及LSD-t檢驗(yàn)。

2結(jié)果

2.1血清IL-1β水平SIM組〔(122.17±14.81)pg/ml〕和對照組IL-1β水平〔(138.31±9.39)pg/ml〕顯著高于BL組〔(103.83±11.09)pg/ml〕，SIM組顯著低于對照組(P<0.05)。

2.2膝關(guān)節(jié)軟骨大體觀察BL組多數(shù)標(biāo)本關(guān)節(jié)軟骨面光滑，少數(shù)標(biāo)本關(guān)節(jié)面稍顯粗糙，欠光滑，部分區(qū)域光澤暗淡；對照組關(guān)節(jié)面失去光澤，關(guān)節(jié)面粗糙，有破壞，關(guān)節(jié)液渾濁、量多，關(guān)節(jié)面出現(xiàn)破潰；SIM組與對照組無明顯差異。

2.3組織學(xué)觀察及評分BL組軟骨表面完整，軟骨基質(zhì)染色較均一，個別標(biāo)本存在局部著色較淺，軟骨細(xì)胞結(jié)構(gòu)正常，層次清楚，分布規(guī)則，個別標(biāo)本軟骨細(xì)胞減少，排列紊亂；對照組關(guān)節(jié)表面較粗糙，個別標(biāo)本有潰瘍形成，軟骨細(xì)胞排列紊亂，基質(zhì)著色不均一，纖維化及蛋白多糖丟失較前增加，并浸潤至深層，軟骨細(xì)胞克隆明顯呈細(xì)胞巢狀。與BL組相比，對照組和SIM組IL-1β陽性著色細(xì)胞較多，著色更深。見圖1。

2.4OARSI評分結(jié)果與BL組(1.58±0.97)相比，對照組關(guān)節(jié)軟骨出現(xiàn)退變表現(xiàn)，OARSI評分(6.50±1.79)顯著升高(P<0.05)，SIM組(5.83±1.99)與對照組比較無顯著差別。

2.5免疫組化染色結(jié)果IL-1β在軟骨細(xì)胞內(nèi)及細(xì)胞外基質(zhì)均有陽性表達(dá)，表層軟骨較深層軟骨表達(dá)更明顯，見圖2。評分結(jié)果提示SIM組和對照組關(guān)節(jié)軟骨IL-1β的表達(dá)水平(4.58±0.97、4.83±0.88)顯著高于BL組(2.33±0.98)，但SIM組和對照組無顯著區(qū)別。

2.6micro-CT分析結(jié)果見表1。SIM組及對照組軟骨下骨BMD、Tb.Th顯著高于BL組，SMI顯著低于BL組(P<0.05)，SIM組與對照組無顯著差異。BV/TV三組間無顯著差異。

圖1　VG染色結(jié)果(×200)

圖2　免疫組化染色及評分結(jié)果(×200)

指標(biāo)BL組對照組SIM組BMD(mg/cm3)631.8±40.9707.2±30.71)714.5±28.61)BV/TV(%)41.8±2.842.2±3.742.6±3.6Tb.Th(μm)98.7±9.1114.3±7.81)113.2±11.21)SMI(μm)1.43±0.330.97±0.281)1.03±0.261)

與BL組比較：1)P<0.05

3討論

DH豚鼠作為原發(fā)性O(shè)A模型，相關(guān)實(shí)驗(yàn)表明，軟骨的降解與人類的發(fā)展非常相似，在自然病程、誘發(fā)因素、治療干預(yù)方面能很好地模擬發(fā)病過程〔10，11〕。以往研究表明，該模型大致在3～4個月齡發(fā)生OA病理改變〔12，13〕，因此本研究選取3個月齡動物作為基線組，發(fā)現(xiàn)3個月齡DH豚鼠多數(shù)標(biāo)本無明顯OA表現(xiàn)，部分標(biāo)本出現(xiàn)細(xì)胞減少，基質(zhì)丟失現(xiàn)象。與3個月齡相比，9個月齡DH豚鼠發(fā)生明顯的OA病理改變，關(guān)節(jié)面粗糙不平，基質(zhì)減少，細(xì)胞丟失，克隆多見，OARSI評分顯著升高。

研究證實(shí)，關(guān)節(jié)滑液中IL-1β的含量與骨關(guān)節(jié)炎病情發(fā)展呈正相關(guān)，IL-1通過生產(chǎn)一氧化氮下調(diào)細(xì)胞外基質(zhì)的合成和上調(diào)基質(zhì)金屬蛋白酶(MMP)的合成引起軟骨分解〔14～16〕。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，隨著OA發(fā)展，IL-1β在DH豚鼠外周血和關(guān)節(jié)軟骨中的表達(dá)水平均顯著升高。

軟骨下骨的組織結(jié)構(gòu)的生物力學(xué)特性的變化是OA病理改變之一。本次研究采用Micro-CT分析發(fā)現(xiàn)DH豚鼠OA進(jìn)展過程中，BMD與Tb.Th增加，SMI降低。這些改變一方面可能與豚鼠正常生長有關(guān)，另一方面，可能是OA進(jìn)展的始動因素或反饋效應(yīng)之一，這一問題的闡明尚有待深入研究。

SIM作為降脂類藥物，因表現(xiàn)出包括保護(hù)軟骨細(xì)胞等多種降脂之外的作用潛能而備受關(guān)注。Lazzerini等〔17〕證實(shí)SIM可以抑制IL-1β誘導(dǎo)的人軟骨細(xì)胞炎癥反應(yīng)中MMP-3的高表達(dá)，Dombrecht等〔18〕則發(fā)現(xiàn)SIM可以劑量依賴得形式降低IL-1β及腫瘤壞死因子(TNF)-α刺激的人軟骨細(xì)胞IL-6及IL-8的水平。Yudoh等〔6〕提示SIM體外干預(yù)可抑制IL-1誘發(fā)的軟骨細(xì)胞的衰老和炎癥反應(yīng)，Aktas等〔7〕發(fā)現(xiàn)關(guān)節(jié)腔內(nèi)注射SIM可以通過抑制MMP-3水平部分阻止關(guān)節(jié)失穩(wěn)誘發(fā)的大鼠繼發(fā)性關(guān)節(jié)炎進(jìn)程。本研究發(fā)現(xiàn)，SIM雖然可以降低外周血IL-1β水平，但對DH豚鼠OA進(jìn)展無顯著影響，對軟骨下骨的作用亦不明顯。體外或局部干預(yù)與系統(tǒng)性給藥干預(yù)效果的區(qū)別可能主要源于口服SIM經(jīng)過肝臟代謝到達(dá)關(guān)節(jié)軟骨局部組織的血藥濃度更低，這一點(diǎn)在關(guān)于SIM抗骨質(zhì)疏松(OP)的相關(guān)研究中亦有述及〔19，20〕。因此，靶向性更強(qiáng)的SIM可能更具備應(yīng)用前景。

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〔2014-12-19修回〕

(編輯苑云杰)

〔中圖分類號〕R684.3

〔文獻(xiàn)標(biāo)識碼〕A

〔文章編號〕1005-9202(2016)06-1291-03；

doi：10.3969/j.issn.1005-9202.2016.06.005

通訊作者：田發(fā)明(1980-)，男，博士，副教授，碩士生導(dǎo)師，主要從事骨質(zhì)疏松與骨關(guān)節(jié)退變研究。

基金項(xiàng)目：河北省高等學(xué)校科學(xué)研究計(jì)劃(No.QN20131007)；河北省自然科學(xué)基金(No.H2013209255)

1華北理工大學(xué)醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)研究中心

第一作者：趙海勇(1975-)，男，碩士，主要從事骨關(guān)節(jié)退行性疾病研究。