劉　超　朱耀明

(三峽大學第一臨床醫(yī)學院　宜昌市中心人民醫(yī)院胃腸外科,湖北　宜昌　443000)

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益生菌對潰瘍性結(jié)腸炎模型大鼠腸黏膜Toll樣受體表達的影響及其意義

劉超朱耀明

(三峽大學第一臨床醫(yī)學院宜昌市中心人民醫(yī)院胃腸外科,湖北宜昌443000)

〔摘要〕目的探討益生菌對葡聚糖硫酸鈉誘導的潰瘍性結(jié)腸炎模型大鼠腸黏膜Toll樣受體(TLR)的影響及其臨床意義。方法40只SD大鼠隨機分為正常對照組、模型組、益生菌組和美沙拉嗪組。對照組正常飼養(yǎng)，不予任何處理；模型組、益生菌組和美沙拉嗪組給予含5%葡聚糖硫酸鈉飲用水10 d建立潰瘍性結(jié)腸炎模型，益生菌組和美沙拉嗪組于第11天分別給予酪酸梭菌活菌和美沙拉嗪灌胃治療14 d。14 d后處死所有大鼠，觀察疾病活動指數(shù)，進行組織學評分，RT-PCR法檢測TLR2和TLR4的表達，免疫組化方法檢測轉(zhuǎn)轉(zhuǎn)錄因子(NF)-κB的活性。結(jié)果模型組的疾病活動指數(shù)和組織學評分顯著高于對照組，益生菌組和美沙拉嗪組低于模型組(P<0.05)。模型組TLR2和TLR4的表達顯著高于對照組，益生菌組和美沙拉嗪組高于對照組且低于模型組(P<0.05)，而益生菌組和美沙拉嗪組間差異不顯著(P>0.05)。模型組NF-κB的活性顯著高于對照組，益生菌組和美沙拉嗪組高于對照組且低于模型組(P<0.05)，而益生菌組和美沙拉嗪組間差異不顯著(P>0.05)。結(jié)論潰瘍性結(jié)腸炎模型大鼠中TLR表達異常，NF-κB的活性增加，益生菌及美沙拉嗪制劑可降低潰瘍性結(jié)腸炎模型大鼠TLR表達和NF-κB的活性，是治療潰瘍性結(jié)腸炎的有效方法。

〔關(guān)鍵詞〕潰瘍性結(jié)腸炎；Toll樣受體；益生菌；酪酸梭菌活菌葡聚糖硫酸鈉片；葡聚糖硫酸鈉

目前，潰瘍性結(jié)腸炎發(fā)病機制尚未完全闡明〔1〕。Toll樣受體(TLR)是先天性免疫重要的跨膜受體和模式識別受體，能夠識別病原體相關(guān)分子模式，阻斷通路中各轉(zhuǎn)導節(jié)點，減弱潰瘍性結(jié)腸炎的炎癥反應(yīng)，有助于治療的評定治療作用〔2〕。益生菌是一類微生態(tài)制劑，研究表明益生菌對潰瘍性結(jié)腸炎具有緩解作用，但其作用機制尚不明確〔3〕。本研究旨在探究益生菌治療潰瘍性結(jié)腸炎的機制。

1資料與方法

1.1實驗動物及材料40只SD大鼠購于北京維通利華實驗動物中心(合格證號：SCXK(京)DBQ800)，體重230～270 g，均為雄性。引物由上海生土生物土程有限公司設(shè)計，RT-PCR試劑盒購于Fermentas公司，酶聯(lián)免疫吸附(ELISA)試劑盒購于BD公司，Marker購于天根生化科技有限公司。葡聚糖硫酸鈉購于Sigma公司，酪酸梭菌活菌片(青島東海藥業(yè)有限公司)，美沙拉嗪膠囊(葵花藥業(yè)集團佳木斯鹿靈制藥有限公司)，其他試劑為國產(chǎn)。

1.2動物模型制備及處理40只SD大鼠隨機分為正常對照組、模型組、益生菌組和美沙拉嗪組，每組10只。對照組正常飼養(yǎng)，不給予任何干預(yù)，其他三組大鼠在動物房飼養(yǎng)1 w后，給予含5%葡聚糖硫酸鈉飲用水10 d建立潰瘍性結(jié)腸炎模型，益生菌組和美沙拉嗪組于第11天分別給予酪酸梭菌活菌(700 mg·kg-1·d-1，1次/d)和美沙拉嗪(500 mg·kg-1·d-1，1次/d)灌胃給藥治療14 d，模型組等容量生理鹽水灌胃，稱取大鼠體重，觀察大便形態(tài)和便血情況。治療14 d后處死所有大鼠，切開結(jié)腸管，觀察黏膜損傷情況，分別取遠中近段組織標本進行免疫組化染色觀察及檢測核轉(zhuǎn)錄因子(NF)-κB活性，組織樣本保存在液氮罐中10 min,取出放于-80℃?zhèn)溆谩?/p>

1.3腸上皮細胞提取將腸道組織翻轉(zhuǎn)內(nèi)膜向外，用D-Hanks溶液沖洗以去除黏膜的糞便，將腸組織置于含5.0 mmol/L乙二胺四乙酸(EDTA)和0.145 mg/ml二硫蘇糖醇(DTT)的D-Hank溶液中37℃搖床 90 min，3 000 r/min離心10 min，沉淀為腸上皮細胞。

1.4檢測方法RT-PCR法：結(jié)腸組織按Trizol法提取RNA，在260/280 nm處檢測RNA的濃度，進行反轉(zhuǎn)錄，具體步驟參照RT試劑盒說明。PCR擴增引物序列，TLR2 上游：ttgctcctgcgaactcctat，下游：gctttcttgggcttcctctt；TLR4 上游：gctttcacctctgccttcac，下游：cgaggcttttccatccaata；β-actin上游：accacagtccatgccatcac，下游：tccaccaccctgttgctgta。反應(yīng)條件：94℃ 40 s，59℃ 30 s，72℃ 1 min，40個循環(huán)。取PCR產(chǎn)物用1%瓊脂糖凝膠電泳，目標mRNA的表達使用內(nèi)參β-actin進行校正。免疫組織化學方法應(yīng)用標準的三步法進行檢測，一抗為NF-κB p65亞基的單克隆抗體，二抗為山羊抗鼠IgG抗體，NF-κB活化評分在400倍高倍顯微鏡進行，每個視野中NF-κB陽性細胞百分比0%～1%為0分，2%～5%為1分，6%～10%為2分，11%～25%為3分〔4〕。

1.5疾病活動指數(shù)和組織學評分疾病活動指數(shù)，①體重下降：體重不變0分、下降1%～5%1分、下降5%～10%2分、下降10%～15%3分、下降>15%4分。②大便形態(tài)：0分為正常、2分為松散、3分為腹瀉。③便血：0分為正常、2分為隱性出血、4分為顯性出血。疾病活動指數(shù)=(體重指數(shù)+大便形狀+出血情況)/3。

組織學評分：針對處理免疫組化結(jié)果評分方法，將各組切片內(nèi)陽性的細胞數(shù)量及其染色強度轉(zhuǎn)化為相應(yīng)的數(shù)值，達到對組織染色半定量的目的，使用Σpi(i+1)表示，式中pi表示陽性細胞數(shù)量占切片中所有細胞數(shù)量的百分數(shù)；i代表著色強度。

1.6統(tǒng)計學方法采用SPSS19.0軟件進行t檢驗和χ2檢驗。

2結(jié)果

2.1各模型組疾病活動指數(shù)和組織學評分比較模型組、益生菌組、美沙拉嗪組給予含5%葡聚糖硫酸鈉飲用水7～8 d出現(xiàn)腹瀉、便血、進食量明顯減少、體質(zhì)量下降等。益生菌組、美沙拉嗪組進過灌胃治療后腹瀉、便血癥狀明顯好轉(zhuǎn)，模型組癥狀持續(xù)無減輕，體質(zhì)量下降，對照組則無上述典型癥狀出現(xiàn)，體質(zhì)量逐漸增加。模型組、益生菌組和美沙拉嗪組的疾病活動指數(shù)(8.92±1.13，3.67±0.75，4.03±0.84)及組織學評分(12.13±0.94，5.53±0.68，5.82±0.79)顯著高于對照組(0.15±0.11，0.21±0.09)，其中益生菌組和美沙拉嗪組均低于模型組(P<0.05)，而益生菌組和美沙拉嗪組間差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。

2.2組織病理學變化對照組腸腺體排列整齊，腺體間有較多杯狀細胞，固有層少量淋巴細胞浸潤。模型組腸黏膜下炎性細胞浸潤，結(jié)構(gòu)紊亂，隱窩膿腫形成，潰瘍邊緣腺體增生較重，杯狀細胞減少，下層出血水腫。益生菌組、美沙拉嗪組黏膜下層炎性細胞浸潤減少，黏膜充血水腫明顯減輕。見圖1。

對照組

模型組

益生菌組

美沙拉嗪組

2.3腸上皮細胞TLR2和TLR4的表達模型組、益生菌組和美沙拉嗪組的TLR2(0.92±0.13，0.67±0.09，0.64±0.10)和TLR4(1.13±0.14，0.53±0.09，0.52±0.09)的表達水平均顯著高于對照組(0.25±0.08，0.31±0.08)，其中益生菌組和美沙拉嗪組均低于模型組(P<0.05)，而益生菌組和美沙拉嗪組間差異不顯著(P>0.05)。

2.4NF-κB免疫組織化學結(jié)果模型組、益生菌組和美沙拉嗪組的NF-κB的活性分別為(2.43±0.54)、(0.85±0.31)、(0.82±0.29)，均顯著高于對照組的(0.41±0.28)，其中益生菌組和美沙拉嗪組均低于模型組(P<0.05)，而益生菌組和美沙拉嗪組間差異不顯著(P>0.05)。

3討論

多數(shù)學者認為潰瘍性結(jié)腸炎的發(fā)病主要與遺傳易感性、腸道菌群紊亂、腸黏膜免疫異常、感染等因素有關(guān)〔5〕。隨著對腸道微生態(tài)學及免疫學的發(fā)展，證實腸道菌群的紊亂與潰瘍性結(jié)腸炎的發(fā)病存在一定的相關(guān)性。研究顯示〔6〕，與緩解期潰瘍性結(jié)腸炎患者相比，急性期腸道有益菌明顯減少，而中間菌及有害菌大量增多，腸道菌群紊亂，炎癥持續(xù)存在。益生菌具有抑制腸道有害菌生長、毒素釋放，增大腸道蠕動頻率，促進消化，改善腸道機能，且其通過刺激腸道內(nèi)的免疫功能，將過低或過高的免疫活性調(diào)節(jié)至正常狀態(tài)，有助于增強人體免疫力，對潰瘍性結(jié)腸炎具有緩解及改善預(yù)后的作用。

TLR是天然免疫系統(tǒng)識別微生物的蛋白，在防御機制中具有重要作用，表達于天然免疫細胞和特異性免疫細胞，TLR介導的信號傳導可導致固有免疫細胞活化，分泌促炎癥細胞因子，誘導炎癥發(fā)生，同時可誘導并刺激分子表達，啟動特異性免疫應(yīng)答產(chǎn)生〔7〕。TLR能夠通過識別病原相關(guān)分子，最終激活NF-κB和絲裂原蛋白激酶，加重潰瘍性結(jié)腸炎炎癥發(fā)展〔8〕。本研究說明酪酸梭菌活菌和美沙拉嗪治療潰瘍性結(jié)腸炎療效顯著，可顯著緩解患者的腸道炎癥，調(diào)節(jié)腸道菌群平衡，恢復(fù)便狀。分析原因：酪酸梭菌活菌能耐受胃酸進入腸道，分泌腸黏膜再生和修復(fù)所需的重要營養(yǎng)物質(zhì)酪酸(丁酸)，并能促進有益菌生長，抑制腸道有害菌生長，恢復(fù)腸道菌群平衡〔9〕；抑制抗結(jié)腸抗體IgG的過度表達，降低B淋巴細胞轉(zhuǎn)化率，提高T淋巴細胞轉(zhuǎn)化率，糾正腸免疫紊亂，恢復(fù)腸免疫耐受力。美沙拉嗪是治療潰瘍性結(jié)腸炎的活性成分，對腸壁的炎癥也有顯著的抑制作用〔10〕。

本研究進一步提示潰瘍性結(jié)腸炎的發(fā)生與發(fā)展可能與TLR、NF-κB的表達有關(guān)，而酪酸梭菌活菌和美沙拉嗪可通過調(diào)節(jié)TLR、NF-κB的表達水平來改善患者癥狀。本研究說明益生菌和美沙拉嗪治療潰瘍性結(jié)腸炎效果相當。

4參考文獻

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〔2015-07-25修回〕

(編輯袁左鳴/滕欣航)

〔中圖分類號〕R574.62

〔文獻標識碼〕A

〔文章編號〕1005-9202(2016)06-1304-03；

doi：10.3969/j.issn.1005-9202.2016.06.011

通訊作者：朱耀明(1952-)，男，主任醫(yī)師，主要從事胃腸外科方面的研究。

第一作者：劉超(1982-)，男，碩士，主治醫(yī)師，主要從事胃腸外科方面的研究。