伍　潔，柳風(fēng)序 ，李雪欣，姚海濤

(1.牡丹江市第二人民醫(yī)院，黑龍江 牡丹江 157013；2．佳木斯大學(xué)，黑龍江 佳木斯 154007)

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BRAF基因突變與結(jié)直腸腺癌病理及臨床預(yù)后的意義①

伍潔1，柳風(fēng)序2，李雪欣2，姚海濤2

(1.牡丹江市第二人民醫(yī)院，黑龍江 牡丹江 157013；2．佳木斯大學(xué)，黑龍江 佳木斯 154007)

摘要：目的:BRAF基因突變對結(jié)直腸腺癌病理及臨床治療的意義。方法:收集我院 2014年1~12月經(jīng)病理科診斷手術(shù)的166例原發(fā)結(jié)直腸腺癌組織標(biāo)本及61例癌旁正常組織。用PCR-DNA直接測序法檢測BRAF突變情況。結(jié)果:①癌組織中BRAF基因突變率9.04%，常見類型BRAF-V600E，癌旁正常組織無基因突變。②癌組織分級低突變率較組織分級高的患者突變率高，癌組織有淋巴轉(zhuǎn)移患者BRAF基因突變率較無轉(zhuǎn)移患者的高，兩者差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。③癌組織BRAF基因突變率與患者性別、年齡、發(fā)病部位無相關(guān)性(P>0.05)。有遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移的患者BRAF基因突變率比無遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移的明顯增高，但差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。結(jié)論:結(jié)直腸癌患者中，癌組織BRAF基因突變率明顯高于旁正常組織，與癌組織的分化程度、淋巴轉(zhuǎn)移有相關(guān)性，有器官轉(zhuǎn)移的患者BRAF基因突變多見，提示與患者腫瘤轉(zhuǎn)移有關(guān)，預(yù)后不良。

關(guān)鍵詞:BRAF基因；結(jié)直腸癌；病理；臨床預(yù)后

各地資料顯示隨著人民生活水平提高，飲食結(jié)構(gòu)改變，結(jié)直腸癌成為消化道常見的惡性腫瘤，我國CRC患者發(fā)病率以每年3.9%速度遞增，已經(jīng)占惡性腫瘤的第3位，患者確診后5年存活率僅為55%左右[1]。很多研究證實(shí)了RAS-BRAF-MAPK細(xì)胞信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路激活與惡性腫瘤的發(fā)病、進(jìn)展和惡性程度密切相關(guān)。原癌基因BRAF蛋白作為一種基因編碼的絲/蘇氨酸特異性激酶，是該通路細(xì)胞內(nèi)重要信號轉(zhuǎn)導(dǎo)因子,使腸道凋亡誘導(dǎo)因子失活造成細(xì)胞過渡增殖，促進(jìn)組織分化、血管生成和侵襲轉(zhuǎn)移等導(dǎo)致惡性腫瘤的發(fā)生[2]。隨著對CRC發(fā)病分子的生物學(xué)機(jī)制和基因突變的不斷深入研究，靶向藥物治療有效降低了患者死亡率提高生存質(zhì)量的同時，也出現(xiàn)了臨床耐藥[3]。大量臨床證實(shí)KRAS、BRAF基因突變患者在抗EGFR靶向治療中無效，預(yù)后生存差，只有BRAF基因野生型患者才能從抗EGFR單克隆抗體治療中獲益[4]。BRAF基因是否成為臨床耐藥和不良預(yù)后的預(yù)測性指標(biāo)，與療效及預(yù)后的關(guān)系尚有爭議[5]，本文旨在探討術(shù)后的結(jié)直腸腺癌組織中BRAF基因突變情況與臨床病理的相關(guān)性，并分析其對臨床治療和預(yù)后的影響，以下為研究過程回顧。

1材料與方法

1.1材料

收集我院2014年1~12月經(jīng)病理科診斷手術(shù)166例原發(fā)結(jié)直腸癌腺癌組織標(biāo)本及其癌旁正常組織(距腫瘤邊緣<5cm)61例作為對照組。年齡19～76歲，平均(49.9±10.1)歲?；颊咝g(shù)前均未行放、化療。

1.2實(shí)驗方法

1.2.1組織DNA分子提?。篋NA小量抽提試劑盒(純化柱式)購自碧云天生物技術(shù)研究所[6]。對病例癌組織、癌旁正常組織石蠟標(biāo)本切8μm厚10張水展后用膜片撈出，同時切取4μm厚一張，行HE染色顯微鏡下觀察腫瘤細(xì)胞集中區(qū)域。采用激光共聚焦切割儀選取對應(yīng)區(qū)域?qū)⑶衅夏[瘤組織歸入0.5mLEP管中脫蠟醇化，加入細(xì)胞裂解液55℃水浴過夜，50μL蛋白酶K消化，沉淀洗鹽，-20℃冰箱保存?zhèn)溆茫颖拘袧舛?、純度測定稀釋后行PCR檢測。

1.2.2PCR產(chǎn)物擴(kuò)增純化：由上海碧云天生物技術(shù)有限公司利用軟件Premier5.0設(shè)計PCR引物序列如下：BRAF基因第15號外顯子：上游引物5'-CTCTTCCATAATGCTTGCTCTGATAGG-3'下游引物5'-GTGAGAAAAATAGCCTCAATTCTTACC-3'擴(kuò)增片段長度為318bp。PCR反應(yīng)體系50μL，反應(yīng)條件為：95℃預(yù)變性 5min；94℃ 變性30s；60℃退火 30s，72℃延伸 60s，共30個循環(huán)；最后72℃ 延伸10min；降至4℃結(jié)束反應(yīng)。于美國BIO-RAD 580BR PCR儀器上進(jìn)行基因擴(kuò)增。用純化試劑盒將PCR產(chǎn)物純化。取5μLPCR產(chǎn)物經(jīng)2%瓊脂糖凝膠電泳，溴化乙啶染色，紫外燈下檢測觀察，照相存盤。

1.2.3DNA分子直接測序：將檢測有單一條帶的樣本送公司測序，測序結(jié)果經(jīng)人工校對記錄后用DNAMAN6.0軟件對測序圖譜分析，與基因庫BRAF基因序列比較總結(jié)結(jié)果。

1.3統(tǒng)計學(xué)方法

采用SPSS19.0 統(tǒng)計軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，采用χ2檢驗，以P<0.05表示差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2結(jié)果

2.1癌組織中B-RAF基因突變率為(15/166)9.04%。癌旁正常腸組織無基因突變。15外顯子上突變類型有6種：常見突變類型為BRAF-V600E(11/15)，有1例第014號標(biāo)本是多位點(diǎn)串聯(lián)突變。見表1。

表1　結(jié)直腸癌BRAF基因15外顯子突變類型

2.2癌組織BRAF基因突變組織分級低12.09%(11/91)的患者較組織分級高5.33%(4/75)患者突變率高，兩者差異有統(tǒng)計學(xué)意義(χ2=6.79，P<0.05)。有淋巴轉(zhuǎn)移患者12.37% (13/97)突變率較無轉(zhuǎn)移2.90%(2/69)患者突變率高，兩者差異有統(tǒng)計學(xué)意義(χ2=5.85，P<0.05)。 見表2。

表2　癌組織中BRAF基因突變狀態(tài)與臨床病理相關(guān)性

2.349例有遠(yuǎn)處器官轉(zhuǎn)移的患者BRAF基因突變率14.29%(7/49)比無轉(zhuǎn)移的患者突變率6.84%(8/117)增高顯著，因(χ2=2.74，P>0.05)無統(tǒng)計學(xué)意義。癌組織中患者性別(χ2=3.65，P>0.05)、年齡(χ2=3.58，P>0.05)、發(fā)病部位(χ2=2.82，P>0.05)、浸潤深度(χ2=1.94，P>0.05)的BRAF基因突變率與生存無相關(guān)性。 見表2。

3討論

本研究檢測癌組織中BRAF基因突變率(15/166)9.04%，符合目前文獻(xiàn)BRAF基因突變率約4%～13%[7]。15例BRAF基因突變患者中有93.33%(14/15)為第600個脫氧核苷酸突變， BRAF-V600E突變有11例為常見突變類型。癌組織分化程度低(χ2=6.79，P<0.05)、有淋巴轉(zhuǎn)移患者BRAF基因突變率高(χ2=5.85，P<0.05)。由于大多數(shù)病人術(shù)后3～5年會有復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移風(fēng)險，腫瘤分化程度越低、有淋巴轉(zhuǎn)移提示患者腫瘤惡性程度越高、分期都較晚復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移風(fēng)險大。早期檢測KRAS、BRAF等基因突變情況指導(dǎo)臨床用藥[8]。結(jié)直腸癌患者術(shù)后的生存不排除受腫瘤的病理類型、分期和治療手段、藥物敏感程度、心態(tài)因素、經(jīng)濟(jì)條件、個體差異等諸多因素影響，實(shí)驗證實(shí)BRAF基因突變患者藥物治療效果差，生存時間短[3]。遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移患者中BRAF基因突變率14.29%(7/49)比無轉(zhuǎn)移的患者突變率6.84%(8/117)增高顯著，提示與腫瘤轉(zhuǎn)移有關(guān)，由于有遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移屬于晚期患者即使進(jìn)行原發(fā)灶和轉(zhuǎn)移灶手術(shù)治療，患者復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移風(fēng)險高治療效果差預(yù)后不良[4]。差異無統(tǒng)計學(xué)意義(χ2=2.74,P>0.05)。目前研究認(rèn)為腫瘤的發(fā)生由復(fù)雜的網(wǎng)絡(luò)系統(tǒng)調(diào)控，所有信號通路之間存在相互交叉，破壞其中某一通路可使得信號轉(zhuǎn)導(dǎo)從這個網(wǎng)絡(luò)中其它的通路進(jìn)行，阻斷一個受體或者激酶就能阻斷任何信息傳導(dǎo)是不客觀的。說明除了BRAF基因外NRAS、CRAF基因及P13K/AKT、RalGDS途徑等也可以調(diào)控EGFR信號通路激活形成腫瘤。沒有一種腫瘤只存在一個治療靶點(diǎn), 往往是多個位點(diǎn)同時起作用, 也是目前臨床靶向治療耐藥的主要原因[3]。開發(fā)多靶點(diǎn)藥物和細(xì)胞毒藥物聯(lián)合用藥，隨著患者生存時間延長，藥物的毒副作用也明顯，生存質(zhì)量得不到提高，患者因不能耐受藥物反應(yīng)、經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)沉重而放棄用藥，是目前CRC死亡率居高不下的主要原因。因此隨著BRAF基因臨床耐藥和不良預(yù)后的預(yù)測性指標(biāo)相關(guān)研究不斷深入發(fā)展[9]，如何阻斷BRAF/MAPK信號通路對結(jié)直腸癌患者的治療和預(yù)后的影響仍需進(jìn)一步探討。

綜上所述, BRAF基因突變研究短短幾年，目前的基因檢測手段及分子靶向治療藥物費(fèi)用昂貴，為了減輕患者經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)，提高靶向治療效果，希望本研究能促進(jìn)結(jié)直腸癌患者在選擇治療方案前早期檢測相關(guān)基因狀態(tài)，同時做好藥敏試驗，為臨床用藥提供準(zhǔn)確理論依據(jù)[10]，相信未來靶向藥物更加合理地應(yīng)用臨床，腫瘤的個體化治療真正由理想變?yōu)楝F(xiàn)實(shí)，造福于廣大結(jié)直腸癌患者。

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The significance of BRAF genetic mutations with pathological and clinical prognosis in colorectal cancer patients

WUJie1,LIUFeng-xu2,LIXue-xin2,YAOHai-tao2

(1.The Second People’s Hospital, Mudanjiang 157013，China; 2. The Basic Medical School, Jiamusi University, Jiamusi 154007, China)

Abstract：Objective：To study the correlation about the expression of BRAF genetic mutations with clinical pathological in colorectal cancer patients; and to analyze its significance of clinical treatment and prognosis.Methods：166 samples of colorectal adenocarcinoma tissues and 61samples of normal tissues adjacent to carcinoma were selected from affiliated hospitals of Jiamusi University during 2014. The PCR-DNA direct sequencing method is used to detect the BRAF genetic mutations situation in intestinal tissues. Results：①Among colorectal cancer patients, there were 9.04%(15/166) BRAF genetic mutations rates. BRAFV600E is mutation type of Common . Normal intestinal tissue adjacent to carcinoma was no BRAF genetic mutations. ② The mutations rates of BRAF genetic in cancer tissues of tissues low differentiation are higher than that of high differentiation (P<0.05). The lymphatic metastasis mutations rates of BRAF genetic in cancer tissues were higher than no metastasis (P<0.05). ③ The mutations rates of BRAF genetic have no relationship with gender, age, primary cancer location，infiltration depth, clinical stage and distant metastasis(P>0.05). Conclusion：In colorectal cancer patients, the cancer tissues have BRAF genetic mutations, and normal intestinal tissue adjacent to carcinoma was no BRAF genetic mutations. The situation of BRAF genetic mutations in colorectal cancer has correlation relationship with cancerous tissues differentiation degree and lymph node metastases. The BRAF genetic mutationsin cancer tissues of distant metastasis are higher than those with no metastasis. There are some relationship the patients with tumor metastasis，with prompt poor prognosis.

Key words:BRAF genetic; colorectal cancer; pathological；clinical prognosis

(收稿日期：2015-05-14)

中圖分類號：R735.3+5

文獻(xiàn)標(biāo)識碼：B

文章編號：1008-0104(2016)01-0069-03

作者簡介：伍潔(1973～)女，黑龍江牡丹江人，碩士，副主任醫(yī)師。主要從事消化道腫瘤及內(nèi)科治療研究。通訊作者：姚海濤(1964～)男，黑龍江佳木斯人，碩士，教授，碩士研究生導(dǎo)師。E-mail:jmsdxyht1228@163.com。

注：柳風(fēng)序為佳木斯大學(xué)在校本科生。