馮笑琪，林娜娜，謝燕媚，紀澤泉（廣州醫(yī)科大學(xué)附屬第二醫(yī)院，廣東廣州510260）

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腺病毒Smad 7轉(zhuǎn)染對阿霉素腎病大鼠蛋白尿的影響

馮笑琪，林娜娜，謝燕媚，紀澤泉
（廣州醫(yī)科大學(xué)附屬第二醫(yī)院，廣東廣州510260）

摘要：目的在阿霉素（ADR）腎病大鼠模型中，探討過表達Smad 7對腎病蛋白尿及其病理的影響。方法本實驗用單次尾靜脈注射建立阿霉素腎病模型，通過構(gòu)建重組腺病毒介導(dǎo)外源性Smad 7基因，單側(cè)腎動脈灌注轉(zhuǎn)染Smad 7至靶腎臟。用熒光顯微鏡檢測Smad 7重組腺病毒的轉(zhuǎn)染效果，用鄰苯三酚紅比色法測定大鼠24 h尿蛋白，HE染色檢測各組腎臟病理改變。結(jié)果①用6.5 mg/kg ADR一次性尾靜脈注射SD大鼠可成功構(gòu)建腎病模型；4周末似微小病變型腎病。②單側(cè)腎動脈灌注能有效將介導(dǎo)Smad 7的重組腺病毒轉(zhuǎn)染至大鼠靶腎臟。③4周末腎病重組腺病毒（Ad-Smad7）組尿蛋白（38.4±6.0）較ADR組（69.58±10.63）減少（P<0.05）。④熒光顯微鏡顯示腎病Ad-smad7組大鼠靶腎中，Ad-Smad7主要在腎小管表達，腎小球表達少。⑤腎病Ad-Smad7組腎臟病理改變輕微，腎病Ad-GFP組、ADR組病理較嚴重，出現(xiàn)類似局灶節(jié)段性腎小球硬化的慢性腎臟病病理表現(xiàn)。結(jié)論單側(cè)腎動脈灌注有效地使重組腺病毒介導(dǎo)的Smad 7轉(zhuǎn)染至大鼠靶腎臟，使Smad 7在該腎過表達，可減輕腎病大鼠蛋白尿，并改善阿霉素腎病病理。

關(guān)鍵詞：重組腺病毒；Smad 7；腎??；蛋白尿

腎纖維化包括腎小球硬化和腎小管間質(zhì)纖維化，是各種慢性腎臟病的共同病理過程。TGF-β/Smads信號通路是目前公認的主要通路之一，其下游的Smad 7起負反饋調(diào)節(jié)作用。在動物實驗中，應(yīng)用通用的大鼠模型，大鼠阿霉素腎病各階段病理與人的微小病變型腎病、局灶節(jié)段性腎小球硬化相似[1]，有助于進一步研究TGF-β/Smads通路的機制。腎小球上皮細胞及腎小管細胞對蛋白有選擇性濾過作用，所以阿霉素腎病的蛋白尿不僅反映腎病病程發(fā)展，也提示其病理情況。前期細胞實驗表明，系膜細胞中過表達Smad 7可抑制AngII誘導(dǎo)的系膜細胞增殖及炎癥反應(yīng)[2]。本實驗用大鼠阿霉素腎病模型，構(gòu)建重組腺病毒（adenovirus）介導(dǎo)外源性Smad 7基因，通過從腹主動脈向單側(cè)腎動脈灌注，阻斷遠心端、近心端血流，腎動脈灌注將外源性Smad 7轉(zhuǎn)染至靶腎臟[3]，驗證靶腎過表達Smad 7對抑制大鼠蛋白尿，改善腎病病理變化的影響。

1　材料與方法

1.1實驗動物與材料

采用Spragoe-Dawleg（SD）系雄性大鼠，SPF級，購買于廣東省醫(yī)學(xué)實驗動物中心。動物實驗在廣州醫(yī)科大學(xué)實驗動物中心進行，注冊編號為SYXK（粵）2010-0104。鹽酸阿霉素（adriamycin，ADR），為深圳萬樂藥業(yè)有限公司產(chǎn)品，批號H44024359。重組腺病毒（Ad-Smad7、Ad-GFP）購買于漢恒生物科技有限公司。大鼠手術(shù)器械一套、10%水合氯醛、40單位胰島素針（美國BD公司）等。

1.2模型的建立及分組

隨機取40只大鼠，體重150～180 g。ADR腎病模型一次性尾靜脈注射ADR 6.5 mg/kg，注射后1、4 及10周末檢測24 h尿蛋白，模型組尿蛋白與正常對照組之間差異有統(tǒng)計學(xué)意義，出現(xiàn)病理學(xué)改變證明模型構(gòu)建成功。實驗分正常對照組（Con組）、ADR腎病組（ADR組）、ADR腎病+Ad-Smad7組（腎病Ad-Smad7組）、腎病+Ad-GFP組（腎病Ad-GFP組）和ADR腎病+假手術(shù)組(腎病sham 組)，每組8只。ADR注射1周末，腎病Ad-Smad7組通過夾閉腹主動脈近心端、遠心端，由腹主動脈向單側(cè)腎動脈灌注Ad-Smad7；同法建立腎病Ad-GFP組；腎病sham組開腹后相同時間內(nèi)單純夾閉腹主動脈；Con組尾靜脈注射等容積的生理鹽水。

1.3觀察指標(biāo)及檢測方法

1.3.1腎病模型的尿生化檢測ADR注射后1、4 及10周末用代謝籠分別收集24 h尿液，記錄24 h尿量，3 000 r/min離心5 min后暫存于4℃冰箱，用鄰苯三酚紅比色法檢測24 h尿蛋白。

1.3.2構(gòu)建腎病Ad-Smad7組、腎病Ad-GFP組及腎病sham組在ADR注射1周末，每組隨機選取8只模型鼠，術(shù)前1天禁食不禁飲。按4 ml/kg水合氯醛麻醉，作倒T字開口，逐層開腹，找左腎部位，分離左腎靜脈，顯露術(shù)野后，找到下腔靜脈與腹主動脈，分別游離出下腔靜脈和腹主動脈。細絲線分別游離腹主動脈近心、遠心端。備好重組腺病毒，胰島素針。分別用動脈夾夾閉游離好的腹主動脈近心端及遠心端，將5×109pfu/ml重組腺病毒（Ad-Smad7/Ad-GFP）均速地從腹主動脈灌注入左腎動脈，灌注完立即退針，按壓約5min。按壓同時稍提起左腎靜脈絲線，短暫阻斷左腎血流，延長腺病毒與該腎的接觸時間。阻斷血流注射病毒總時間控制在10 min以內(nèi)。確認清理干凈后關(guān)腹，肌肉層連續(xù)縫合，皮膚間斷縫合。連續(xù)肌注10萬u青霉素3 d，放回籠里保暖。

1.3.3腎臟標(biāo)本采集Con組和ADR組分別于ADR注射后4周末及10周末取腎，腎病Ad-Smad7組、腎病Ad-GFP組、腎病sham組于4周末取腎。切取腎臟后剝離腎包膜，部分腎組織置于4%多聚甲醛做冷凍切片熒光檢測，部分腎皮質(zhì)置于10%甲醛做病理檢查，HE染色；其余腎組織置于液氮保存。

1.3.4冷凍切片熒光顯微鏡檢測Ad-Smad7 4%多聚甲醛固定的腎組織過夜，蔗糖溶液脫水，直至腎組織沉降到容器底部。預(yù)冷冷凍切片機，溫度調(diào)至-22℃，切片厚度為45μm。按需要切取適量腎組織，加PBS泡于6孔板中。病理級玻片預(yù)先過明膠，以防脫片。每張玻片用抗熒光淬滅封片劑封片，熒光顯微鏡觀察拍照。

1.3.5HE染色切片在二甲苯中脫蠟；依次放入100%、95%、85%、70%酒精，各級為2～5 min。最后經(jīng)蒸餾水轉(zhuǎn)入染液；蘇木精染液染色10 min；水洗玻片上多余染液，0.5%～1.0%鹽酸酒精（70%酒精配制）分色片刻。鏡檢控制，直至細胞核及核內(nèi)染色質(zhì)清晰為止；流水沖洗，或在碳酸鋰飽和液中短時間堿化，蒸餾水短洗；0.1%~0.5%伊紅染液染色1～5 min；依次經(jīng)70%、85%、95%、100%酒精脫水；二甲苯透明（2次），共約10 min；迅速滴加適量中性樹膠，加蓋玻片封固。

1.4統(tǒng)計學(xué)方法

采用SPSS 17.0統(tǒng)計軟件進行數(shù)據(jù)分析。計量資料用均數(shù)±標(biāo)準差（±s）表示，組間兩兩比較采用LSD法檢驗，P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2　結(jié)果

2.1阿霉素腎病模型24 h尿蛋白檢測

分別取Con組、ADR組1周末、4周末、10周末24 h尿，ADR組1周末24 h尿蛋白升高，4周末升至較高水平，與同時間點Con組比較顯著升高，模型構(gòu)建成功；4周末ADR組與1周末ADR組比較顯著升高。10周末稍降低，但仍較同時間點Con組高。Con組各時間點尿蛋白差異無統(tǒng)計學(xué)意義，見圖1。

2.2正常對照組與模型組病理檢測

Con組腎小球內(nèi)皮、毛細血管清晰，血管球與腎球囊無黏連（見圖2A）；ADR組腎小球系膜基質(zhì)增多，毛細血管腔狹窄或破壞，毛細血管叢與囊壁黏連（見圖2B）。

2.34周末各組大鼠尿蛋白比較

ADR注射4周末，與Con組比較，ADR組24 h尿蛋白顯著升高。與ADR組比較，Ad-Smad7轉(zhuǎn)染后大鼠24 h尿蛋白減少，差異有統(tǒng)計學(xué)意義；與腎病Ad-GFP組、腎病sham組比較，腎病Ad-Smad7組大鼠24 h尿蛋白也減少，差異有統(tǒng)計學(xué)意義。ADR組、腎病Ad-GFP組、腎病sham 3組尿蛋白比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義。見圖3。

2.4各組腎組織冷凍切片熒光鏡檢

腎病Ad-GFP組的熒光鏡檢可見腎小管上皮細胞有綠色熒光，表明腺病毒已轉(zhuǎn)染至小管上皮細胞。與Con組、ADR組比較，Ad-Smad7在5×109pfu/ml時轉(zhuǎn)染效果明顯，而腎病sham組與ADR組相似，僅有輕微均勻的自發(fā)熒光。見圖4。

圖1　Con組、ADR組各時間點24 h尿蛋白

圖2　Con組、ADR組4周HE染色病理圖（×400）

圖3　4周末各組大鼠24 h尿蛋白比較

圖4　腎臟冷凍切片熒光鏡檢Ad-Smad7（×400）

2.5各組大鼠腎臟病理改變

Con組見腎小球系膜細胞、毛細血管清晰，血管球與腎球囊無黏連；與Con組比較，ADR組腎小球系膜基質(zhì)增多，毛細血管腔狹窄或破壞，毛細血管叢與囊壁黏連，部分腎小球有新月體形成；腎病Ad-GFP組腎小球球囊變形，毛細血管球萎縮，部分血管腔閉塞，腎小管上皮細胞腫脹，排列紊亂，部分脫失；腎病sham組腎小球毛細血管成分葉狀，系膜細胞增殖，與ADR組相似；腎病Ad-Smad7組血管球和腎球囊結(jié)構(gòu)分明，內(nèi)皮細胞、系膜細胞均勻分布，較ADR組病理改變減輕。見圖5。

圖5　各組腎臟病理HE染色（×400）

3　討論

腎組織纖維化和炎癥是慢性腎臟病病理過程，可發(fā)展為腎小球硬化。各種致病因素長期持續(xù)刺激腎小球，使內(nèi)皮細胞受損，血管塌陷，系膜細胞增殖，細胞外基質(zhì)（ECM）堆積，導(dǎo)致腎小球硬化。多條信號通路參與腎小球硬化過程，包括TGF-β/Smad信號通路，MAPK通路，Wnt通路等。其中Smad2、3、4、7 為TGF-β1的下游效應(yīng)蛋白，Smad7為負反饋調(diào)節(jié)蛋白。有研究顯示細胞內(nèi)Smad7的水平是決定TGF-β1反應(yīng)性的主要因素，它通過干擾TβRⅠ型受體對Smad2、Smad3蛋白的磷酸化,或招募E3泛素連接酶（如Smurf1/2）導(dǎo)致活化的TβRⅠ型受體泛素化標(biāo)記，對TGF-β1/Smad通路起負反饋調(diào)節(jié)作用[4-5]。

本研究前期在AngII刺激腎小球系膜細胞（glomerular mesangial cell，GMC）增殖的研究表明，Smad 7通過抑制活性氧（reactive oxygen species，ROS）的產(chǎn)生，抑制AngII對NF-κB的激活，增加IκBα的蛋白表達并使核內(nèi)表達增多，促進GMC凋亡，緩解其增殖。梗阻性腎病大鼠及細胞實驗均發(fā)現(xiàn)，過表達Smad 7后miR29b重新表達，Smad 7能抑制糖化終產(chǎn)物和AngII引起的microRNAs的表達，阻斷腎硬化的發(fā)展[6]。Chung等[7]的研究表明，過表達Smad 7可抑制糖化終產(chǎn)物誘導(dǎo)的Smad 3磷酸化，提示過表達Smad 7可作為糖尿病腎病治療的靶點。本實驗通過腺病毒介導(dǎo)Smad 7基因轉(zhuǎn)染腎病大鼠，觀察Smad 7干預(yù)后對模型大鼠蛋白尿及腎病病理的影響。

阿霉素作為一種蒽環(huán)類抗腫瘤抗生素，具有強烈的細胞毒作用，直接損傷腎臟細胞。它的醌式結(jié)構(gòu)，在腎內(nèi)代謝還原成半醌式自由基，后者與氧結(jié)合產(chǎn)生ROS，促使腎小管上皮細胞脂質(zhì)過氧化，濾過膜結(jié)構(gòu)、功能受損，產(chǎn)生蛋白尿。此外阿霉素還有心臟毒性、胃腸道反應(yīng)等副作用，劑量過大會造成動物死亡，存活率降低[8-9]。因此，經(jīng)過預(yù)實驗，本研究采用一次性尾靜脈注射6.5 mg/kg ADR的給藥方式，減少藥物血管外滲的機會，也減輕胃腸道反應(yīng)。24 h蛋白尿檢測結(jié)果顯示，ADR組大鼠于阿霉素注射1周末即出現(xiàn)蛋白尿。研究顯示基因表達在大鼠腎臟可持續(xù)約3周[10]，所以本實驗從ADR注射1周末開始轉(zhuǎn)染Smad 7重組腺病毒，4周末檢測轉(zhuǎn)染效果。

腺病毒介導(dǎo)外源性基因轉(zhuǎn)染至大鼠腎臟定向表達的研究表明，腺病毒的感染效率高，用包裝細胞進行擴增，一次包裝所得的滴度較高（純化后為1011pfu/ml），純化后的腺病毒可直接進行動物活體注射[11]，因此，本實驗用腺病毒為載體介導(dǎo)Smad 7基因?qū)Π⒚顾啬I病大鼠進行干預(yù)。關(guān)于腺病毒活體注射的研究顯示，不同的注射方式感染率有明顯差異。單純靜脈注射通過血循環(huán)可使腺病毒經(jīng)過腎臟，但病毒會同時感染多個器官，到達腎臟的腺病毒減少。為了使病毒感染大鼠并具有腎臟靶向性，實驗人員通過直接將重組腺病毒由腹主動脈向左側(cè)腎動脈灌注，暫時阻斷腹主動脈遠心端、近心端血流（近心端至右腎動脈下方，遠心端至左腎動脈下方），在兩者間進針即可使腺病毒灌注至左腎，并適當(dāng)延長灌注時間[3，12]。

各組大鼠腎臟冰凍切片的熒光顯微鏡檢結(jié)果顯示，Con組、ADR組僅有輕微均勻的自發(fā)熒光，與前兩者比較，腎病Ad-Smad7和腎病Ad-GFP均見陽性表達區(qū)，Ad-Smad7組位于腎小管上皮細胞及小管間質(zhì)，Ad-GFP主要位于腎小管上皮細胞。實驗表明5×109pfu/ml時轉(zhuǎn)染效果最明顯，且不引起大鼠過早死亡。腎病sham組與ADR組相似，僅有輕微均一的自發(fā)熒光。由此可見介導(dǎo)Smad 7的腺病毒已成功轉(zhuǎn)染至大鼠靶腎臟。

腺病毒介導(dǎo)基因轉(zhuǎn)染至大鼠的研究顯示，基因表達在大鼠腎臟內(nèi)可持續(xù)約3周。灌注重組腺病毒Smad7后，即實驗4周末，腎病Ad-Smad7組24 h尿蛋白與ADR組、腎病Ad-GFP組、腎病sham組比較明顯減少，提示過表達Smad 7基因可抑制腎病蛋白尿。Liu等[13]研究表明，小鼠高血壓腎病模型通過非侵入的超聲微泡技術(shù)，強力霉素誘導(dǎo)Smad 7表達的質(zhì)粒注入到腎臟后顯示，Smad 7提前干預(yù)能防止AngII引起的進行性腎損傷，抑制蛋白尿和血肌酐的增高。Wang[14]等研究顯示通過下調(diào)Smad7蛋白，過表達的miR21能促進糖尿病腎病中TGF-β1誘導(dǎo)的腎硬化。有腎病模型研究發(fā)現(xiàn)小管間質(zhì)損傷和腎小球病變一樣決定著慢性腎臟病的進展，但其機制仍未十分清楚,如腎大部分切除模型、Heymann腎炎，他們實驗表明持續(xù)的蛋白尿與腎小管損傷密切相關(guān)[15]。而本實驗中Smad 7也正是在腎小管上皮細胞表達，可能Smad 7通過小管上皮細胞抑制TGF-β/Smad通路，從而抑制阿霉素腎病的進展，減輕腎病蛋白尿。

實驗檢測各組腎病大鼠腎臟病理改變，Con組見腎小球系膜細胞、毛細血管清晰，血管球與腎球囊無黏連；與Con組比較，ADR組腎小球系膜基質(zhì)增多，毛細血管腔狹窄或破壞，毛細血管叢與囊壁黏連，個別腎小球有新月體形成；腎病Ad-GFP組與ADR組相似，毛細血管球萎縮，腎小管上皮細胞腫脹，排列紊亂，球囊黏連；腎病sham組腎小球毛細血管成分葉狀，系膜細胞增殖；腎病Ad-Smad7組血管球和腎球囊結(jié)構(gòu)較分明，內(nèi)皮細胞、系膜細胞分布較均勻，與ADR組比較有明顯減輕?？梢?，過表達Smad 7可緩解阿霉素腎病病理損害。

本實驗顯示Smad 7重組腺病毒通過腹主動脈定向灌注大鼠腎臟，使Smad 7在靶腎過表達，可減輕阿霉素腎病大鼠蛋白尿及改善腎臟病理情況，表明Smad 7可作為干預(yù)靶點，為腎硬化的防治提供新的實驗依據(jù)。

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（張蕾編輯）

Effect of adenovirus-mediated Smad7 gene transfer on proteinuria of Adriamycin-induced nephropathy rat model

Xiao-qi Feng,Na-na Lin,Yan-mei Xie,Ze-quan Ji
(The Second Affiliated Hospital,Guangzhou Medical University,Guangzhou,Guangdong 510260,China)

Abstract:Ojective To investigate the effect of overexpression of Smad7 on proteinuria and renal pathology in the Adriamycin-induced nephropathy (ADN) rat model.Methods ADN model was established by single tail intravenous injection of Adriamycin (ADR).Smad7 gene was transferred by means of infusing a recombinant adenovirus into the left renal artery.Recombinant adenovirus-Smad7 (Ad-Smad7) was detected under fluorescence microscope.HE staining was used to examine renal pathological changes of each group.Pyrogallol red colorimetry was used to detect 24-h urinary protein.Results SD rats received a single intravenous injection of ADR (6.5 mg/kg),which constructed the ADN model.The pathology was similar to minimal change nephropathy at the fourth weekend.Unilateral renal artery infusion was efficient to transfer Ad-Smad7 to the target kidney.Urinary protein of the Ad-Smad7 group (38.4± 6.0) decreased compared to the ADR group (69.58±10.63) at the fourth weekend (P < 0.05).Smad7 was mainly expressed in renal tubular epithelia in the Ad-Smad7 group,scarcely seen in glomeruli.The pathological changes of the Ad-Smad7 group were mild,while the changes of the Ad-GFP and ADR groups were similar to focal segmental glomerulosclerosis.Conclusions Ad-Smad7 can be transferred to the target kidney through unilateral renal artery infusion,and overexpression of Smad7 can ameliorate proteinuria and pathological changes of Adriamycin-induced nephropathy.

Keywords:recombinant adenovirus; Smad7; nephropathy; proteinuria

收稿日期：2015-10-28

文章編號：1005-8982（2016）06-0001-05

DOI:10.3969/j.issn.1005-8982.2016.06.001

中圖分類號：R725.7

文獻標(biāo)識碼：A