謝睿，王海波，牟海軍，徐靖宇

（遵義醫(yī)學院附屬醫(yī)院消化內科，貴州遵義563099）

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I型鈉氫交換蛋白調節(jié)細胞內酸堿平衡對胃癌細胞遷移、侵襲的影響*

謝睿，王海波，牟海軍，徐靖宇

（遵義醫(yī)學院附屬醫(yī)院消化內科，貴州遵義563099）

摘要：目的觀察I型鈉氫交換蛋白（NHE1）通過調控胃癌細胞SGC-7901內酸堿值（pH）對其遷移、侵襲的影響。方法采用共聚焦顯微鏡觀察比較用特異性阻斷劑5-（N-乙基-N-異丙基）阿米洛利（EIPA）阻斷胃癌細胞SGC-7901的NHE1功能前后胞內pH值的變化，劃痕實驗觀察細胞遷移能力的改變，transwell侵襲實驗觀察細胞侵襲能力的改變。結果共聚焦實驗發(fā)現(xiàn)對照組細胞內pHi為（7.2±0.12），EIPA阻斷劑組（5μm）為（7.01±0.23），EIPA阻斷劑組細胞內的pH值明顯降低（P<0.05）；進一步劃痕和侵襲實驗證明加入不同濃度的EIPA（5、10和20μmol）后均能有效地抑制胃癌細胞SGC-7901的遷移和侵襲能力（P<0.05，P< 0.01），并且抑制的程度與EIPA的濃度呈劑量依賴性。結論阻斷NHE1可以降低胃癌細胞pH值，進而抑制胃癌細胞的遷移和侵襲能力。

關鍵詞：NHE1；胃癌；細胞遷移；pH；細胞侵襲

胃癌是世界上最為常見的惡性腫瘤之一，其死亡率位居癌癥死因第2位，我國屬于胃癌高發(fā)大國[1]。隨著近代醫(yī)療技術的發(fā)展，胃癌的預后雖已有改善，但5年生存率依然沒有明顯提高，究其原因與胃癌高轉移率、高復發(fā)率的特性密切相關。既往研究已證實，腫瘤酸性微環(huán)境（即外酸內堿）參與了腫瘤的生存遷移等異常細胞生物學行為的調控過程[2-3]，失調的細胞內、外酸堿值（potential of hydrogen，pH）是促使腫瘤發(fā)生、發(fā)展的一個重要誘因，因此，近年來研究者們開始重視pH調控及其相關靶分子在腫瘤領域中的重要作用。鈉氫交換蛋白家族（Na+/H-exchangers，NHE)中的I型鈉氫交換蛋白（NHE1），是存在于哺乳動物細胞上調節(jié)細胞內外正常pH值的重要膜蛋白，其通過細胞內的一個H+與細胞外的一個Na+離子進行電中性跨膜轉運達到調控PH的作用[4]，雖然已有文獻報道NHE1可能參與了乳腺癌、前列腺癌等腫瘤的發(fā)生發(fā)展[5-6]，但就NHE1與消化系統(tǒng)腫瘤特別是胃癌的相關性，目前主要集中在對其表達量變化（蛋白或轉錄水平）的研究，而對于通過調控NHE的蛋白活性（即功能）來揭示對胃癌細胞異常生物學行為影響的相關研究卻鮮見報道。鑒于NHE1亞型廣泛存在于多種組織細胞中，同時，本次前期研究已發(fā)現(xiàn)NHE1在胃癌具有蛋白表達量的變化，本實驗擬通過應用NHE1特異性阻斷劑5-（N-乙基-N-異丙基）阿米洛利[5-（N-ethyl-N-isopropyl）amiloride（EIPA）]作用于胃癌細胞后，觀察其胃癌細胞內pH（intracellular pH，pHi）的變化，以及該變化對胃癌細胞遷移、侵襲行為的影響，旨在從NHE1功能調控角度，為以NHE1為靶點治療胃癌提供依據(jù)。

1　材料與方法

1.1材料

胃癌SGC-7901細胞株購于中科院上海細胞庫，實驗用BCECF/AM、Nigericin購于Intergone公司，EIPA（美國Sigma公司），1640培養(yǎng)基、小牛血清、胰酶購于美國GIBCO公司，二氧化碳CO2培養(yǎng)箱（型號3131，美國Thermo公司），倒置相差顯微鏡和激光掃描共聚焦顯微鏡均購于德國Leica公司。

1.2方法

1.2.1細胞培養(yǎng)SGC-7901細胞置于含有10%胎牛血清、100 u/L青霉素、100μg/L鏈霉素的RPMI 1640培養(yǎng)基，5%的二氧化碳CO2、37℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。每2～3 d用含0.02% EDTA的0.25%胰蛋白酶溶液消化并傳代。

1.2.2細胞內pH測定預先將特殊的Glass Coverslip載玻片酒精浸泡并在紫外燈下照射15 min后置于6孔板內接種細胞并培養(yǎng)48 h，實驗時用PSS液漂洗3次后，加入終濃度為5μmol/L的BCECF/AM（pH熒光探針），室溫避光孵育30 min，孵育結束，將BCECF-AM負載好的SGC-7901細胞轉移到一個特制的灌注室中，再用PSS液漂洗10 min，激光共聚焦顯微鏡下觀察，記錄細胞內熒光值的變化，數(shù)據(jù)采集間隔時間為30 s，掃描時間為20 min。比較EIPA（5μmol）處理前后胃癌細胞SGC-7901細胞內pH值的變化。用含有尼日利亞菌素（Nigericin）的高鉀溶液催化細胞外K+和胞內H+的跨膜交換，最終使得細胞內外pH值相等，即通過高鉀溶液的pH值即換算出腫瘤細胞的pHi。

1.2.3細胞劃痕實驗取對數(shù)生長期SGC-7901細胞，常規(guī)消化細胞后計數(shù)，用無血清培養(yǎng)基1640稀釋細胞使其密度為2×105/ml，接種于48孔板內，每孔500μl細胞懸液，放入37℃、5%二氧化碳CO2恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h，待細胞貼壁并單層平鋪長滿整個孔底部。劃痕給藥處理：取出48孔板，先用PBS清洗1次，用10μl槍頭稍微過火，呈“一”劃痕，再用PBS洗3次，徹底洗凈漂浮起來的細胞，用無血清的培養(yǎng)基配制不同濃度的EIPA刺激液加入孔板中，實驗分組：正常對照組（加入500μl無血清培養(yǎng)基）、EIPA不同濃度處理組（5、10和20μmol/L），每孔均加入總體積500μl的刺激液，繼續(xù)培養(yǎng)24 h，每組設3個復孔，找出給藥前拍照的原位置進行拍照，實驗結果用Image-plus軟件測量，藥物刺激前后劃痕兩側細胞間距離的變化，每張圖片測量5個距離點，細胞遷移距離=藥物刺激前兩邊細胞的距離-藥物刺激后兩邊細胞的距離。每孔取5個視野拍照，每次實驗至少重復3次。

1.2.4細胞侵襲實驗將人工基底膜（Matrigel）（40μl/孔）均勻地鋪在Transwell小室膜上，37℃放置6 h，待吸盡基質膠表面液體，下室加600μl 1640培養(yǎng)基，含30%胎牛血清，上室分別加入不同濃度EIPA處理液重懸的細胞懸液（細胞密度為5×105個/ml細胞）400μl/室，無血清1640培養(yǎng)基培養(yǎng)。將小室置于12空板中于37℃培養(yǎng)箱孵育24 h。后用1% PBS漂洗3次；用4%甲醛溶液固定30 min，蘇木精染色，梯度乙醇溶液逐級脫水，鄰苯二甲醛透明后，置于載玻片上封固。在光學顯微鏡下隨機挑選5個視野（×200）下的穿膜細胞數(shù)，計算平均細胞侵襲數(shù)量，以穿過濾膜的細胞數(shù)表示細胞的侵襲力，實驗分為正常對照組（加入600μl無血清培養(yǎng)基）、EIPA不同濃度處理組（5、10和20μmol/L），每次實驗至少重復3次。

1.3統(tǒng)計學方法

應用SPSS11.0軟件對數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計學分析，數(shù)據(jù)以均數(shù)±標準差（±s）表示，用t檢驗做差異的顯著性分析，P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2　結果

2.1EIPA抑制NHE1功能對胞內pH的影響

首先測量靜息狀態(tài)對照組胃癌細胞SGC-7901 的pHi值，結果顯示對照組胃癌細胞pHi為（7.20± 0.12），而加入NHE1特異性抑制劑EIPA（5μmol）阻斷NHE1的功能后，pHi變?yōu)椋?.01±0.23），相對于對照組pHi值顯著降低（P<0.05，見圖1）。表明胃癌細胞的NHE1具有調控細胞內pH的功能，并且通過EIPA抑制NHE1活性后會導致SGC-7901細胞內的pH值明顯降低，細胞明顯酸化，胞外微環(huán)境偏堿。

2.2EIPA抑制NHE1功能對胃癌細胞遷移能力的影響

與對照組遷移的距離（45.0±2.4）μm比較，加入不同濃度（5、10和20μmol）的阻斷劑EIPA作用24 h后能夠明顯抑制胃癌細胞SGC-7901的遷移能力[5μmol組：（38.0±4.5）μm；10μmol組：（30.0± 4.3）μm；20μmol組：（26.0±2.6）μm]，并且SGC-7901細胞遷移能力的抑制程度與EIPA的濃度呈劑量依賴性，結果見圖2、附表。

2.3EIPA抑制NHE1功能對胃癌細胞侵襲的能力影響

與對照組侵襲的細胞數(shù)量（100.75±9.42）個比較，加入不同濃度（5、10和20μmol）的阻斷劑EIPA 24 h作用后能夠明顯抑制胃癌細胞SGC-7901的侵襲能力（P <0.05）[5μmol組：（75.75±7.87）個；10μmol組：（46.5±4.35）個；20μmol組：（34.5±6.60）個]，并且SGC-7901細胞侵襲能力的抑制程度與EIPA的濃度呈劑量依賴性。結果見圖3、圖4。

圖1　對照組及EIPA組胃癌細胞的pHi曲線及統(tǒng)計圖

圖2　對照組及不同濃度的EIPA刺激24h后胃癌細胞的遷移距離

附表　對照組及不同濃度的EIPA刺激后胃癌細胞遷移距離統(tǒng)計表（n=4，μm，±s）

附表　對照組及不同濃度的EIPA刺激后胃癌細胞遷移距離統(tǒng)計表（n=4，μm，±s）

注：與對照組比較，1）P<0.05；2）P<0.01

分組　　對照組　5μmol組　10μmol組　20μmol組遷移距離　45.0±2.4　38.0±4.51）　30.0±4.32）　26.0±2.62）

圖3　不同濃度的EIPA刺激對胃癌細胞侵襲能力的影響

圖4　對照組及不同濃度的EIPA刺激后胃癌細胞侵襲細胞數(shù)統(tǒng)計圖

3　討論

多年來研究者們一直致力于胃癌發(fā)生發(fā)展的機制研究，以期為根治胃癌及改善胃癌預后尋找到新的治療途徑。但是胃癌的發(fā)生、發(fā)展是多基因、多步驟的過程，常規(guī)的化療、放療、免疫方法只能殺死原位的腫瘤細胞，卻無法完全控制腫瘤細胞的侵襲轉移過程，而腫瘤細胞的侵襲轉移往往又是腫瘤復發(fā)的根本原因，因此，針對腫瘤細胞侵襲轉移的相關機制研究刻不容緩。近年來的研究表明，腫瘤發(fā)生、轉移和侵潤均涉及復雜的細胞行為變化，而這些變化與細胞自身所處的腫瘤微環(huán)境特別是微環(huán)境的酸堿度密切相關。

既往研究發(fā)現(xiàn)癌細胞胞內堿性環(huán)境會促進細胞更加頻繁的新陳代謝，而外部酸性環(huán)境卻能增強腫瘤細胞遷移、侵潤轉移能力。究其原因一方面腫瘤細胞侵襲、轉移在很大程度上主要依賴于一系列蛋白酶，如金屬蛋白酶、巰基蛋白酶、絲氨酸蛋白酶及酸性蛋白酶等，他們可以去降解一系列組織屏障，在酸性環(huán)境下這些酶的活性可被增強，從而為癌細胞的侵襲創(chuàng)造條件[7-8]。另一方面，腫瘤細胞的遷移和侵襲主要的驅動力是板狀偽足，而板狀偽足主要是由肌動蛋白構成，它能夠突入細胞外基質，進而組裝成微絲網(wǎng)格，構成細胞骨架形成的驅動力。但在前述過程中，cofilin肌動蛋白和凝溶膠gelsolin蛋白的參與都是微絲組裝和解離過程中的關鍵物質，而這兩種蛋白在細胞遷移中均對pH敏感，cofilin在堿性pH中的活性高于酸性，而高濃度的質子可以激活gelsolin[9]。由此可見細胞內外的pH變化的確是調控細胞侵襲、遷移能力的重要因素，所以腫瘤酸性微環(huán)境（即外酸內堿）更有利于腫瘤細胞的侵襲、遷移。那么pH的平衡的調控機制是什么呢？進一步的研究表明胞外酸環(huán)境的形成主要依賴于胞內過量氫離子的外排行為，而NHE家族中的NHE1亞型作為胞膜上重要的氫離子交換器已被證實在細胞內外pH的調控機制中扮演重要角色。

自1989年首次克隆出人類NHE1cDNA以來[10]，到目前已知NHE基因家族中有9個亞型，它們具有相似的拓撲結構，NHE1是NHE家族中表達最為廣泛的亞型，幾乎所有的組織質膜上均有表達，被認為是一個“管家基因”。人類NHE1包含12個外顯子和11個內含子，整個cDNA全長5Kb。既往的報道證實NHE1是調控細胞外酸堿微環(huán)境的重要因子，其通過調控細胞內的一個H+與細胞外的一個Na+離子進行電中性跨膜轉運來影響細胞內外的pH平衡。在NHE1與疾病相關性的研究中，已發(fā)現(xiàn)NHE1抑制劑處理后的人類白血病細胞,其細胞內pH明顯降低，進而誘導腫瘤細胞發(fā)生凋亡[11]。同時，Lagana 等[12]發(fā)現(xiàn)用MSV轉化犬腎上皮連續(xù)細胞系，采用乙基異丙基氯毗咪處理后，細胞中NHE1的活性被明顯抑制，導致細胞內肌動蛋白應力纖維解聚合細胞骨架肌動阮重新分布，細胞偽足縮會，細胞運動被抑制。由此可見NHE1的確具有影響細胞遷移、侵襲的能力，近年來的研究還證實NHE1與前列腺癌、乳腺癌、大腸癌等腫瘤的進展、轉移均有著密切的關系[5-6]。那么，在胃癌細胞中NHE1是否也能影響細胞pH，進而影響胃癌細胞的生物學行為呢？本實驗結果發(fā)現(xiàn)對照組胃癌細胞SGC-7901胞內的pHi為7.20，采用NHE1特異性的阻斷劑EIPA阻斷NHE1的功能后，細胞內pH下降到7.01（P <0.05），提示NHE1在胃癌細胞的確具有調控細胞內pH的功能，阻斷了NHE1后的活性后細胞內的H+會因為無法外泵而導致胞內pH降低，形成一種外堿內酸，不利于癌細胞遷移、侵襲的微環(huán)境。本研究想證實細胞內的pH改變是否的確對胃癌細胞的遷移、侵襲能力具有影響，結果發(fā)現(xiàn)經(jīng)NHE1阻斷劑EIPA處理，胃癌細胞SGC-7901細胞的遷移、侵襲能力較對照組（PBS）均明顯降低，這表明NHE1受體的確通過調控胃癌細胞內pHi變化影響進而腫瘤細胞的生物學行為，抑制NHE1的活性能夠明顯抑制胃癌細胞的侵襲、轉移能力。本實驗發(fā)現(xiàn)，至少在細胞水平，胃癌細胞NHE1很可能是胃癌發(fā)生、發(fā)展中重要的調控機制，開發(fā)一種新的NHE臨床抑制劑有可能為許多疾病的治療提供新思路和新途徑。

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（張蕾編輯）

Effect of NHE1-regulated intracellular pH on invasion and migration of gastric cancer cells*

Rui Xie,Hai-bo Wang,Hai-jun Mu,Jing-yu Xu
(Department of Gastroenterology,the Affiliated Hospital,Zunyi Medical College,Zunyi,Guizhou 563099,China)

Abstract:objective To observe the effect of Na+/H+exchanger 1 (NHE1)-regulated intracellular pH on the invasion and migration of gastric cancer cell line SGC-7901.Methods The gastric cancer cell line SGC -7901 was treated with the NHE1 specific inhibitor 5-(N-ethyl-N-isopropyl) Amiloride (EIPA),the intracellular pH of SGC-7901 was measured using confocal fluorescence microscope.The migration of SGC-7901 cells was examined by scratch test.The invasion of SGC -7901 cells was examined by transwell chamber invasive test.Results The intracellular pH in the control group was (7.2±0.12),it significantly reduced to (7.01±0.23) in the 5-μmol EIPA group.EIPA of different concentrations (5 μmol,10 μmol and 20 μmol) could inhibit the invasion and migration of SGC-7901 cells in a dose-dependent manner.Conclusions NHE1 plays an important role in the regulation of intracellular pH.Blockage of NHE1 could restrain the invasion and migration of gastric cancer cells.

Keywords:NHE1; gastric cancer; cell migration; pH; cell invasion

[通信作者]徐靖宇，E-mail：xujingyu-gzzy@126.com

*基金項目：貴州省衛(wèi)生計生委科學技術基金項目（No：gzwjkj2014-2-165）

收稿日期：2015-10-07

文章編號：1005-8982（2016）06-0006-05

DOI:10.3969/j.issn.1005-8982.2016.06.002

中圖分類號：R975.6

文獻標志碼：A