魏麗瑤，岳春燕，彭?。ㄖ心洗髮W(xué)湘雅醫(yī)院普外科，湖南長(zhǎng)沙410008）

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胰島素樣生長(zhǎng)因子結(jié)合蛋白7過表達(dá)對(duì)人乳腺癌細(xì)胞系-7增殖的影響及其機(jī)制研究

魏麗瑤，岳春燕，彭健
（中南大學(xué)湘雅醫(yī)院普外科，湖南長(zhǎng)沙410008）

摘要：目的探究過表達(dá)胰島素樣生長(zhǎng)因子結(jié)合蛋白7（IGFBP7）對(duì)人乳腺癌細(xì)胞系-7（MCF-7）增殖的影響及其機(jī)制。方法采用LipofectamineTM2000將pIRES2-ZsGreen1-IGFBP7質(zhì)?；騪IRES2-ZsGreen1空白質(zhì)粒轉(zhuǎn)染進(jìn)MCF-7乳腺癌細(xì)胞，并用熒光顯微鏡鑒定細(xì)胞轉(zhuǎn)染；實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)（Real-time PCR）對(duì)轉(zhuǎn)染48 h后IGFBP7蛋白進(jìn)行定量；細(xì)胞凋亡實(shí)驗(yàn)檢測(cè)轉(zhuǎn)染24、48和72 h后各組細(xì)胞增殖情況；Western bolt檢測(cè)轉(zhuǎn)染48 h后各組細(xì)胞（蛋白激酶B/雷帕霉素靶蛋白）（AKT/mTOR）信號(hào)通路相關(guān)蛋白的表達(dá)。結(jié)果Real-time PCR的檢測(cè)結(jié)果提示經(jīng)過IGFBP7轉(zhuǎn)染的細(xì)胞IGFBP7 mRNA表達(dá)水平明顯升高；細(xì)胞凋亡實(shí)驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn)，與空白處理組和空白質(zhì)粒轉(zhuǎn)染組比較，IGFBP7過表達(dá)組細(xì)胞增殖能力明顯降低；Western bolt檢測(cè)結(jié)果發(fā)現(xiàn)，AKT蛋白的磷酸化水平明顯下降，且其下游的mTOR表達(dá)明顯下降（P<0.05）。結(jié)論IGFBP7過表達(dá)對(duì)MCF-7乳腺癌細(xì)胞的增殖具有抑制效果，可能是通過對(duì)AKT/mTOR信號(hào)通路的抑制達(dá)到對(duì)MCF-7的抑制。

關(guān)鍵詞：實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)；胰島素樣生長(zhǎng)因子結(jié)合蛋白7；增殖；蛋白激酶B

胰島素樣生長(zhǎng)因子結(jié)合蛋白（insulin like growth factor binding proteins，IGFBPs），是一種對(duì)哺乳動(dòng)物細(xì)胞中的胰島素樣生長(zhǎng)因子（insulin like growth factors，IGFs）的生物利用度具有調(diào)節(jié)作用的蛋白質(zhì)，因此在細(xì)胞的分化、增殖和生長(zhǎng)等代謝過程中，IGFBPs具有極為重要的作用。目前研究發(fā)現(xiàn)，人體內(nèi)有7種IGFBPs的亞型[1]。根據(jù)其對(duì)IGF的親和力的不同將其分為低親和力的IGFBP7～10和高親和力的IGFBP1～6[2]。低親和力的IGFBPs與IGFs的親和力僅是高親和力IGFBP的1/25～1/5。在低親和力IGFBPs中最先被證實(shí)的是IGFBP7。

IGFBP7在人體中的分布較為廣泛，諸如脾臟、大小腸以及卵巢等組織器官中均有表達(dá)，但研究[3]發(fā)現(xiàn)若組織發(fā)生腫瘤樣變，其表達(dá)水平將發(fā)生下調(diào)甚至缺失，如在肝癌、前列腺癌以及乳腺癌等惡性腫瘤中；在正常的乳腺導(dǎo)管以及小葉上皮細(xì)胞中IGFBP7也有表達(dá)，在發(fā)生衰老的乳腺上皮細(xì)胞中則出現(xiàn)IGFBP7過表達(dá)現(xiàn)象[3]，乳腺癌組織中IGFBP7的表達(dá)卻明顯降低，并且與癌組織的惡性程度之間呈負(fù)相關(guān)[4]。由此可見，胰島素樣生長(zhǎng)因子結(jié)合蛋白7能作為特異性標(biāo)志物從病理學(xué)和血清學(xué)方面診斷乳腺腫瘤，同時(shí)IGFBP7有可能是一腫瘤抑制基因，可能成為腫瘤治療的新靶點(diǎn)。因此，本實(shí)驗(yàn)通過在乳腺癌MCF-7細(xì)胞中過表達(dá)IGFBP7，研究IGFBP7的過表達(dá)對(duì)乳腺癌細(xì)胞增殖的影響。

1　材料與方法

1.1材料與試劑

pIRES2-ZsGreen1-IGFBP7質(zhì)粒、人乳腺癌細(xì)胞系-7（michigan cancer foundation-7，MCF-7）由本實(shí)驗(yàn)室保存，胎牛血清、達(dá)爾伯克必需基本培養(yǎng)基（dulbecco's minimum essential medium，DMEM）培養(yǎng)基購(gòu)買于杭州四季青公司，胰酶、噻唑藍(lán)、二甲基亞砜（dimethyl sulfoxide，DMSO）購(gòu)買于南京凱基生物公司，質(zhì)粒提取試劑盒購(gòu)買于美國(guó)Omega Bio-Tek公司，LipofectamineTM2000轉(zhuǎn)染試劑購(gòu)買于美國(guó)Invitrogen公司，兔抗人IGFBP7、辣根過氧化物酶標(biāo)記的羊抗兔IgG購(gòu)自美國(guó)Sigma公司，增強(qiáng)化學(xué)發(fā)光法（enhanced chemiluminescence，ECL）顯色試劑盒來自南京凱基公司。

1.2儀器與設(shè)備

超凈工作臺(tái)購(gòu)自蘇州基團(tuán)安泰空氣技術(shù)公司，微量移液器購(gòu)自德國(guó)Eppendorf公司，電熱恒溫干燥箱購(gòu)自上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備公司，聚合酶鏈反應(yīng)（polymerase chain reaction，PCR）儀購(gòu)于德國(guó)Eppendorf公司，電子天平購(gòu)自于德國(guó)精密儀器廠，恒溫水浴鍋購(gòu)自海爾公司，凝膠成像系統(tǒng)購(gòu)自美國(guó)Kodak公司。

1.3質(zhì)粒抽提

采用Endo-Free Plasmid Mini KitⅡ進(jìn)行質(zhì)粒抽提：取搖菌后菌液離心收集，加入500μl SolutionⅠ重懸，加入500μl SolutionⅡ裂解，加入250μl冰浴Buffer N3中和生成白色沉淀，取上清液加入內(nèi)毒素吸附緩沖液去內(nèi)毒素，加入無水乙醇，離心吸附柱離心收集，加入500μl Buffer HB除蛋白質(zhì)，700μl 2次DNA Wash Buffer脫鹽，最后洗脫，酶標(biāo)儀檢測(cè)。

1.4MCF-7細(xì)胞培養(yǎng)

用10%的胎牛血清DMEM培養(yǎng)基，在37℃、5%二氧化碳CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)MCF-7乳腺癌細(xì)胞，待細(xì)胞增殖80%～90%時(shí)，用胰酶消化傳代。

1.5細(xì)胞轉(zhuǎn)染

在24孔板中接種MCF-7細(xì)胞，5×104個(gè)/孔，于第2天使用LipofectamineTM2000將pIRES2-Zs-Green1-IGFBP7質(zhì)粒或pIRES2-ZsGreen1空白質(zhì)粒轉(zhuǎn)染進(jìn)MCF-7乳腺癌細(xì)胞，分為空白對(duì)照組、空白質(zhì)粒轉(zhuǎn)染組和IGFBP7質(zhì)粒轉(zhuǎn)染組，置于37℃、5%二氧化碳CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)6 h換液，繼續(xù)培養(yǎng)24 h后，熒光顯微鏡觀察轉(zhuǎn)染率。

1.6對(duì)IGFBP7的mRNA表達(dá)水平進(jìn)行測(cè)定

使用GAPDH作為PCR檢測(cè)的內(nèi)參指標(biāo)，引物設(shè)計(jì)如下：IGFBP7正向引物5'-TGCCATGCATCCAATTCCCA-3'，反向引物5'-TGGAGGTTTATAGC TCGGCA-3'；GAPDH正向引物：5'-TGCACCACCAA CTGCTTAGC-3'，反向引物：5'-GGCATGGACTGTGG TCATGAG-3'。反應(yīng)條件設(shè)定為：95℃預(yù)變性5 min，95℃變性30s，58℃退火30s，共42個(gè)循環(huán)，最后95℃繼續(xù)延伸10 min。

1.7細(xì)胞凋亡實(shí)驗(yàn)

在96孔板中加入MCF-7細(xì)胞，過夜培養(yǎng)，3組細(xì)胞分別轉(zhuǎn)染24、48和72 h后，再每孔中加入噻唑藍(lán)20μl，繼續(xù)4 h培養(yǎng)，再加入DMSO 150μl，應(yīng)用自動(dòng)酶標(biāo)儀在570 nm處測(cè)定各組細(xì)胞的光密度（optical density，OD）值，對(duì)各組細(xì)胞的生存活力及增殖能力進(jìn)行評(píng)估。

1.8Western blot檢測(cè)蛋白表達(dá)

取40μg總蛋白于10%的聚丙烯酰胺凝膠中電泳，用半干式電印跡將蛋白轉(zhuǎn)移至硝酸纖維素膜，5%脫脂牛奶封閉1 h后，分別加入相應(yīng)一抗，4℃過夜，洗膜后分別加入辣根過氧化物酶標(biāo)記的二抗，37℃孵育1 h，洗膜后加ECL，將膜放入X線片暗盒、壓片、顯影、定影，以GAPDH的表達(dá)作為參照，比較目的條帶的灰度值與內(nèi)參條帶的灰度值。

1.9統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 19.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，用單因素ANOVA統(tǒng)計(jì)法對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，組間用最小顯著性差異法進(jìn)行兩兩比較，P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2　結(jié)果

2.1表達(dá)載體的細(xì)胞轉(zhuǎn)染

LipofectamineTM2000轉(zhuǎn)染試劑轉(zhuǎn)染48 h后，熒光顯微鏡觀察轉(zhuǎn)染情況，質(zhì)粒轉(zhuǎn)染成功，且轉(zhuǎn)染率> 70%。見圖1。

2.2轉(zhuǎn)染后MCF-7細(xì)胞中IGFBP7mRNA的表達(dá)

轉(zhuǎn)染48 h后，RT-PCR檢測(cè)各組細(xì)胞的IGFBP7 mRNA水平，空白處理組和空白質(zhì)粒轉(zhuǎn)染組比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.121），IGFBP7組細(xì)胞與空白處理組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P =0.012），且IGFBP7 mRNA水平升高。IGFBP7組細(xì)胞和空白質(zhì)粒轉(zhuǎn)染組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.003），IGFBP7 mRNA水平升高。見圖2。

2.3MCF-7細(xì)胞的增殖能力

噻唑藍(lán)細(xì)胞活力檢測(cè)結(jié)果顯示，空白質(zhì)粒轉(zhuǎn)染組與空白處理組細(xì)胞活力比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.312），空白質(zhì)粒轉(zhuǎn)染組略升高3%（見圖3）。IGFBP7組細(xì)胞活力與空白處理組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.005），低于空白處理組；與空白質(zhì)粒轉(zhuǎn)染組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.001），低于空白質(zhì)粒轉(zhuǎn)染組，其中72 h最為明顯（見圖4），IGFBP7可抑制MCF-7細(xì)胞增殖。

2.4IGFBP7過表達(dá)對(duì)MCF-7細(xì)胞中蛋白激酶B/雷帕霉素靶蛋白信號(hào)通路的影響

Western blot檢測(cè)過表達(dá)轉(zhuǎn)染IGFBP7的MCF-7細(xì)胞中在蛋白激酶B（protein kinase B，AKT）的蛋白表達(dá)，結(jié)果顯示3組在AKT的蛋白表達(dá)方面差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，但AKT蛋白磷酸化狀態(tài)，IGFBP7組減弱，同時(shí)下游的mTOR蛋白表達(dá)也減弱。見圖5。3）

圖1　質(zhì)粒轉(zhuǎn)染細(xì)胞48 h熒光效果圖

圖2　轉(zhuǎn)染后48 h后各組細(xì)胞IGFBP7 mRNA的表達(dá)

圖3　各組MCF-7細(xì)胞增殖比較

圖4　24、48和72 h各組MCF-7細(xì)胞增殖情況比較

圖5　IGFBP7對(duì)MCF-7細(xì)胞中AKT/mTOR信號(hào)通路的影響

3　討論

胰島素樣生長(zhǎng)因子結(jié)合蛋白7作為IGFBP超家族中的一員，在細(xì)胞的分化、增殖和生長(zhǎng)等代謝過程中具有極為重要的作用。其中大量的研究證實(shí)IGFBP7的表達(dá)與多種癌癥的發(fā)生相關(guān)[5-9]，是多種腫瘤的抑癌因子。

乳腺癌是常見的惡性腫瘤之一，其病死率高居女性癌癥首位，而在我國(guó)，乳腺癌的發(fā)病率不僅逐年上升，而且日趨年輕化。雖然目前對(duì)于乳腺癌的治療取得了一定的進(jìn)展，但乳腺癌的發(fā)病率的增長(zhǎng)速度仍不容樂觀。

IGFBP7可抑制多種腫瘤細(xì)胞的增殖，但其生物分子機(jī)制不盡相同。近年來研究表明，AKT/mTOR通路在腫瘤細(xì)胞增殖、血管新生和轉(zhuǎn)移以及對(duì)放化療的拮抗起重要作用，其在乳腺癌中經(jīng)常被激活，乳腺癌中這條信號(hào)通路的活化高達(dá)70%。目前的研究結(jié)果顯示，AKT/mTOR信號(hào)通路的被激活可能是導(dǎo)致惡性腫瘤發(fā)生的一個(gè)重要原因，其主要是對(duì)細(xì)胞的周期產(chǎn)生影響從而對(duì)細(xì)胞的增殖發(fā)生改變。AKT/ mTOR信號(hào)通路的活化與腫瘤細(xì)胞的發(fā)展有著密切的相關(guān)性[10]。也有研究指出AKT以及下游的mTOR，將腫瘤細(xì)胞的增殖起到抑制作用[11]。本次研究中，通過過表達(dá)IGFBP7，對(duì)AKT/mTOR信號(hào)通路進(jìn)行抑制，達(dá)到抑制細(xì)胞活力和增殖的目的。

本研究中IGFBP7在MCF-7乳腺癌細(xì)胞中出現(xiàn)過表達(dá)，對(duì)轉(zhuǎn)染細(xì)胞株的增殖和活力水平進(jìn)行檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，轉(zhuǎn)染組細(xì)胞的活力和增殖能力明顯下降，同時(shí)伴隨著IGFBP7的過表達(dá)，MCF-7乳腺癌細(xì)胞中的AKT/mTOR信號(hào)通路被抑制，IGFBP7的過表達(dá)與MCF-7乳腺癌細(xì)胞之間呈現(xiàn)負(fù)相關(guān)。

參考文獻(xiàn)：

[1] Baxter RC.IG F binding proteins in cancer:mechanistic and clinical insights[J].Nat Rev Cancer,2014,14(5):329-341.

[2] Kim HS,Nagalla SR,Oh Y.Identification of a family of low-affinity insulin-like growth factor binding proteins (IGFBPs):characterization of connective tissue growth factor as a member of the IGFBP super family[J].Proc Natl Acad Sci USA,1997,94(24):12981-12986.

[3] Burger AM,Leyland-Jones B,Banerjee K.Essential roles of IGFBP-3 and IGFBP-rPI in breast cancer[J].Eur J Cancer,2005,41(11):1515-1527.

[4] Ivan B,Florence L,Sengul T.Molecular profiling of inflammatory breast cancer:identifi-cation of a poor-prognosis gene expression signature[J].Clin Cancer Res,2004,10(20):6789-6795.

[5] Chen QJ,Zhou HM,Chen J,et al.Using a modified TA cloning method to crease entry clones[J].Anal Biochem,2006,359:120-125.

[6] Yen TY,Li KP,Ou SC.Construction of an infectious plasmid clone of muscovy duck parvovirus by TA cloning and creation of a partially attenuated strain[J].Avian Pathol,2015,44(2):124-128.

[7] Benatar T,Yang W,Amemiya Y,et al.IGFBP7 reduces breast tumor growth by induction of senescence and apoptosis pathway[J].Breast Cancer Res Treat,2012,133(2):563-573.

[8] Suzuki H,Igarashi S,Nojima M,et al.IGFBP7 is a p53-responsive gene specifically silenced in colorectal cancer with CpG island methlator phenotype[J].Carcinogenesis,2010,31(3):342-349.

[9] Vizioli MG,Sensi M,Miranda C,et al.IGFB7:an onco-suppressor gene in thyroid carcinogenesis[J].Oncogene,2010,29(26):3835-3844.

[10] Kim EY,Kim A,Kim SK,et al.Inhibition of mTORC1 induces loss of E-cadherin through AKT/GSK-3β signaling-mediated up-regulation of E-cadherin repressor complexes in non-small cell lung cancer cells[J].Respir Res,2014,15:26.

[11] Li X,Yang Q,Yu H,et al.LIF promotes tumorigenesis and metastasis of breast cancer through the AKT-mTOR pathway[J].Oncotarget,2014,5(3):788-801.

（申海菊編輯）

Effect of IGFBP7 overexpression on proliferation of breast cancer cell line MCF-7

Li-yao Wei,Chun-yan Yue,Jian Peng
(Xiangya Hospital,Central South University,Changsha,Hunan 410008,China)

Abstract:Objective To investigate the effect of insulin-like growth factor binding protein 7(IGFBP7) on proliferation of human breast cancer cell line MCF-7 and its mechanism.Methods Plasmid pIRES2-ZsGreen1-IGFBP7 or empty plasmid pIRES2-ZsGreen1 was transfected into MCF-7 cells using LipofectamineTM2000 and the cell transfection efficiency was examined by fluorescence microscopy.Real-time fluorescent quantitative PCR (RTFQPCR) was used to quantify the expression of IGFBP7.MTT was performed to evaluate the effect of IGFBP7 on proliferation and apoptosis of MCF-7 cells at 24,48 and 72 hours after transfection.The expression of relevant proteins of AKT/mTOR signaling pathway was analyzed by Western blot.Results The IGFBP7 mRNA level increased significantly after IGFBP7 transfection.Compared with the controls,cell proliferation noticeably decreased in the IGFBP7-transfected group.Western bolt analysis indicated that the AKT phosphorylation was down-regulated,and the mTOR level dropped markedly (P < 0.05).Conclusions Overexpression of IGFBP7 could down-regulate the proliferation of MCF-7 cells,possibly via inhibiting the AKT/mTOR signaling pathway.

Keywords:real-time quantitative polymerase chain reaction; insulin-like growth factor binding protein 7; proliferation; protein kinase B

[通信作者]彭健，E-mail：970266784@qq.com；Tel：13607441906

收稿日期：2015-12-02

文章編號(hào)：1005-8982（2016）06-0015-04

DOI:10.3969/j.issn.1005-8982.2016.06.004

中圖分類號(hào)：R737.9

文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A