王兵 黃靈 倪海濱

1.浙江省腫瘤醫(yī)院腹部腫瘤外科，浙江杭州310022；2.浙江省人民醫(yī)院胃腸外科，浙江杭州310015

胃癌患者呼出氣冷凝液及腫瘤組織中P53蛋白的檢測

王兵1黃靈1倪海濱2

1.浙江省腫瘤醫(yī)院腹部腫瘤外科，浙江杭州310022；2.浙江省人民醫(yī)院胃腸外科，浙江杭州310015

目的研究胃癌患者呼出氣冷凝液（exhaled breath condensate，EBC）中及腫瘤標(biāo)本切片P53蛋白的表達(dá)及其臨床意義。方法收集2010年1月～2015年12月胃癌手術(shù)后腫瘤標(biāo)本切片和EBC，采用免疫組化（SP）法檢測腫瘤標(biāo)本切片和對照正常胃標(biāo)本切片中的P53蛋白表達(dá)水平，采用免疫酶法檢測胃癌呼出氣體P53蛋白的水平，采用SPSS19.0統(tǒng)計(jì)軟件分析P53蛋白檢測陽性率。結(jié)果胃癌手術(shù)后腫瘤標(biāo)本切片中P53陽性率為60.6%，腫瘤標(biāo)本切片陽性高于對照組（P＜0.01）；胃癌患者呼出氣體中P53蛋白濃度為（50.81±14.25）ng/L，胃癌患者比正常對照組高（P＜0.01）；Ⅱ+Ⅲ+Ⅳ期胃癌患者EBC中P53蛋白濃度較Ⅰ期高；胃癌組織中P53蛋白檢測的敏感性和特異性為60.7%和90.0%，EBC中為42.4%和93.4%，兩種檢測途徑無顯著性差異（P＞0.05）。結(jié)論胃癌組織及EBC中P53蛋白檢測可用于胃癌的輔助診斷及病情監(jiān)測。

胃癌；P53蛋白；呼出氣冷凝液；腫瘤組織

胃癌是最常見的人類惡性腫瘤之一［1-2］，我國胃癌的發(fā)病率為23.96/10萬，目前胃癌的發(fā)病率呈上升趨勢。由于胃癌早期診斷較為困難，存活率一直較低。胃癌患者標(biāo)本切片檢測在胃癌的早期診斷、病情程度判斷、胃癌治療療效評價(jià)、胃癌轉(zhuǎn)移和復(fù)發(fā)的治療以及預(yù)后估計(jì)等方面起重要作用。胃癌患者呼出氣冷凝液（exhaled breath condensate，EBC）檢測方法［3-4］是一種新的無痛無創(chuàng)呼吸道呼出氣體的方法，具有無痛收集容易、患者易接受、可重復(fù)進(jìn)行等優(yōu)點(diǎn)。檢測EBC中胃癌腫瘤標(biāo)志物，或許是找到胃癌早期篩查的一種新途徑。腫瘤抑癌基因p53在腫瘤的發(fā)生機(jī)制中起重要作用，通過對66例胃癌患者腫瘤切片及患者呼出氣冷凝液（EBC）中P53蛋白表達(dá)水平研究，現(xiàn)報(bào)道如下。

1 資料與方法

1.1 臨床資料

采用回顧性分析，根據(jù)有無胃癌疾病分類［5］將研究對象分為胃癌組66例和健康對照組60例。胃癌組66例均選自2010年1月～2015年12月浙江省腫瘤醫(yī)院住院患者，胃癌患者均經(jīng)手術(shù)方式，臨床免疫組化結(jié)果診斷為胃癌，其中男52例，女14例，年齡40～80歲，平均60歲。

1.2 病理分型

腺癌44例，鱗癌22例。66例胃癌患者按照全球抗癌聯(lián)盟2009年制定的TNM分期標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行分期［6］，Ⅰ期44例，Ⅱ期12例，Ⅲ期8例，Ⅳ期2例。選取本科門診體檢健康者60例作為對照組。其中男42例，女18例，年齡30～80歲，平均60歲。胃癌組和對照組排除嚴(yán)重心肝肺功能疾病、心腦血管等慢性疾病。胃癌標(biāo)本切片和健康正常對照組性別、年齡對比無統(tǒng)計(jì)差異［7］。

1.3 標(biāo)本收集和處理

研究胃癌患者呼出氣冷凝液收集采用EcoScreen冷凝器采集，測試者漱口，單鼻子平靜呼吸氣體，呼出氣在-25℃收集管中，可冷凝變?yōu)樗獱钗铮?5 min后，拔出收集管融化后可收集到3 mL左右呼出氣冷凝液，裝入真空無菌試管內(nèi)，置于-80℃冰箱內(nèi)保存，檢驗(yàn)時解凍。呼出氣冷凝液收集前2 h，不做肺活量檢查和運(yùn)動，收集保證測試一次完成，以避免影響檢測結(jié)果。收集我院病理科胃癌患者的石蠟切片，病理明確胃癌的為測定組，取腫瘤遠(yuǎn)端4 cm以外經(jīng)病理，顯微鏡檢查沒有癌細(xì)胞的胃組織作為正常對照組。

1.4 檢測方法

1.4.1 采用免疫組化（SP）法檢測腫瘤蛋白胃癌切片和腫瘤遠(yuǎn)端4 cm以上無癌組織中P53蛋白的檢測［8-9］結(jié)果判定：顏色為棕黃和棕褐色，P53蛋白表達(dá)為陽性。位于細(xì)胞中分析；P53蛋白表達(dá)陽性細(xì)胞的計(jì)算數(shù)：每個標(biāo)本隨機(jī)選取15個高倍顯微鏡，計(jì)算數(shù)2000個細(xì)胞，陽性細(xì)胞百分率，陽性細(xì)胞百分率≥30%為陽性，＜30%為陰性，是按照國際病理陰陽性計(jì)數(shù)標(biāo)準(zhǔn)計(jì)分［10-11］。

1.4.2 采用免疫酶法檢測呼出氣冷凝液中P53蛋白采用免疫酶法，正常組檢測平均值加2.5倍的標(biāo)準(zhǔn)差為正常參考值水平，EBC中P53＜60.03 ng/L。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

采用SPSS19.0統(tǒng)計(jì)軟件分析。胃癌切片組和健康對照組P53蛋白檢測陽性表達(dá)比較，使用χ2檢驗(yàn)；胃癌切片組和對照組EBC中P53蛋白水平，幾種類型胃癌P53蛋白水平比較，采用t檢驗(yàn)；四種分期胃癌EBC中P53蛋白表達(dá)量比較，采用t檢驗(yàn)；P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 胃癌腫瘤標(biāo)本切片中P53蛋白表達(dá)

P53蛋白免疫組化染色陽性信號為棕黃色顆粒，主要定位于細(xì)胞核。見封三圖2。

2.2 胃癌組腫瘤切片及EBC中P53蛋白表達(dá)水平

見表1、2。本組研究結(jié)果顯示，P53蛋白在胃癌患者腫瘤切片中的表達(dá)陽性率為60.6%（40/66），胃癌組比對照組高（P＜0.01），在Ⅰ期和Ⅱ+Ⅲ+Ⅳ期的陽性表達(dá)率分別為63.6%和54.5%，P53蛋白在胃癌不同病理類型及不同病理分期表達(dá)差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。胃癌組EBC中P53蛋白的含量為（50.81±14.25）ng/L，對照組為（33.69±12.17）ng/L，胃癌組較對照組高（P＜0.01）；在鱗癌和腺癌EBC中P53蛋白的水平分別為（50.31± 14.25）ng/L、（51.63±13.97）ng/L，兩者比較無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＞0.05）；Ⅰ期和Ⅱ+Ⅲ+Ⅳ期胃癌EBC的P53蛋白的水平分別為（47.06±7.11）ng/L、（58.33±21.38）ng/L，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。

表1 胃癌組和對照組腫瘤標(biāo)本切片陽性表達(dá)率比較及EBC含量的比較

表2 胃癌組腫瘤切片陽性及EBC中P53蛋白含量與臨床病理關(guān)系

2.3 腫瘤組織與EBC中P53蛋白檢測的敏感性、特異性

見表3。胃癌組腫瘤組織中P53蛋白檢測的敏感性和特異性為60.7%和90.0%，EBC中為42.4%和93.4%，兩種檢測途徑無顯著性差異（P＞0.05）。

表3 腫瘤組織P53蛋白蛋白陽性率和陰性率比較

3 討論

生物體內(nèi)一種抑制細(xì)胞轉(zhuǎn)變癌細(xì)胞的基因，p53是主要抑癌基因。細(xì)胞中癌基因可分為致癌基因（oncogene）和抑癌基因，只要一方突變轉(zhuǎn)變，癌變可能會發(fā)生。人類p53基因在17號染色體p13，全長16～20 kb，由11個外顯子組成，合成轉(zhuǎn)錄2.8 kb的mRNA，轉(zhuǎn)錄成蛋白質(zhì)為P53，為細(xì)胞核內(nèi)磷酸化蛋白。截止目前研究人類腫瘤相關(guān)性最高的基因是p53基因，過去一直認(rèn)為p53是一種癌基因，1989年幾位學(xué)者研究起癌基因作用的是突變的p53，后來證實(shí)抑癌基因是野生型的p53［12-14］。P53蛋白由393個氨基酸殘基構(gòu)成，在細(xì)胞內(nèi)以四聚體的形式存在，凋亡期為20～30min。正常情況下，細(xì)胞中P53蛋白的含量很低，因其半衰期短，所以很難檢出來，但在生長增值的細(xì)胞中，可升高10～100倍以上。維持細(xì)胞正常生長發(fā)育和抑制惡性增殖中野生型P53蛋白起著重要作用，因而被稱為“基因衛(wèi)士”的稱號。p53基因控制細(xì)胞染色體DNA的完整性，如果細(xì)胞中染色體DNA遭到損害，P53蛋白和基因的DNA的相應(yīng)結(jié)合部位結(jié)合，起特殊轉(zhuǎn)錄因子的作用，激活p21基因合成轉(zhuǎn)錄，細(xì)胞轉(zhuǎn)錄停滯于G1期；解鏈酶的活性被抑制；并與復(fù)制因子A相互作用，控制DNA的復(fù)制和修復(fù)。如果修復(fù)重組失敗，P53蛋白開動程序性凋亡過程誘導(dǎo)細(xì)胞自殺，癌變傾向的突變細(xì)胞生成被阻止，細(xì)胞惡變得到控制。p53基因突變后，細(xì)胞構(gòu)象影響到轉(zhuǎn)錄編譯功能和P53蛋白的磷酸化過程，野生型p53抑制腫瘤增殖的作用將失去，此時突變基因具備癌基因的功能。突變的和野生的P53蛋白相結(jié)合，合成的這種異類蛋白不能結(jié)合DNA，致癌基因轉(zhuǎn)錄失控導(dǎo)致腫瘤發(fā)生。目前主要通過胃癌組織、血液和痰標(biāo)本等檢測p53基因的變異，而通過EBC檢測p53基因突變是最近的研究報(bào)道，有研究報(bào)告EBC中檢測p53基因變異率為35.4%［15-16］。

P53蛋白在胃癌切片中表達(dá)和臨床病理研究關(guān)系，大部分人認(rèn)為P53蛋白可作為胃癌預(yù)后的一項(xiàng)指標(biāo)［17-18］。有研究發(fā)現(xiàn)P53蛋白在胃癌患者的腫瘤組織中表達(dá)陽性率為55%［19］，胃癌患者沒有采取放化療，P53蛋白表達(dá)為陽性，存活期陰性比陽性長，兩者有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，表明胃癌腫瘤組織中P53蛋白的表達(dá)與患者的預(yù)后相關(guān)［20］。本研究顯示，P53蛋白在胃癌患者腫瘤切片中表達(dá)陽性率為60.6%（40/66），胃癌切片組高于對照組（P＜0.01），Ⅰ期和Ⅱ+Ⅲ+Ⅳ期的陽性表達(dá)率分別為63.6%和54.5%，不同病理類型及不同病理分期P53蛋白表達(dá)無顯著性差異。目前對于EBC中P53蛋白的檢測報(bào)道較少，我們研究顯示胃癌組EBC中P53蛋白的水平顯著高于正常對照組（P＜0.05），在不同病理類型EBC中P53蛋白的水平無顯著性差異，Ⅱ+Ⅲ+Ⅳ期EBC中P53蛋白的表達(dá)水平高于Ⅰ期（P＜0.05）。通過腫瘤組織及EBC兩種檢測途徑對P53蛋白的表達(dá)進(jìn)行檢測，敏感性及特異性無顯著性差異，提示腫瘤組織及EBC中P53蛋白檢測可作為胃癌診斷，病情判斷和評價(jià)預(yù)后的指標(biāo)。

有研究表明胃癌患者突變型p53蛋白高表達(dá)，DNA修復(fù)能力減弱［21］。胃癌的發(fā)生和轉(zhuǎn)移與突變型p53蛋白密切相關(guān)。胃癌腫瘤標(biāo)本及EBC中P53蛋白檢測對胃癌的診斷有臨床研究意義，對于胃癌分期、治療效果評價(jià)和預(yù)后估計(jì)也是值得今后進(jìn)一步研究的課題。

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Determ ination of P53 protein in EBC and tumor tissues in the patients w ith gastric cancer

WANG Bing1HUANG Ling1NIHaibin2
1.Department of Abdominal Tumor Surgery，Zhejiang Tumor Hospital，Hangzhou 310022，China；2.Gastrointestinal Surgery，Zhejiang Province People's Hospital，Hangzhou 310015，China

Objective To study the expression and clinical significance of P53 proteins in tumor specimen slices and exhaled breath condensate（EBC）in the patientswith gastric cancer.M ethods Tumor specimen slices and EBC after the surgery of gastric cancer from January 2010 to December 2015 were collected.SPwas applied to determine the expression level of P53 protein in tumor specimen slices and controlled normal gastric specimen slices.Immunoenzyme technique was applied to determine the level of P53 protein in the exhaled breath of gastric cancer.SPSS19.0 statistical software was applied to analyze the positive expression rate of P53 protein determination.Results Statistical analysis rate of P53 positive expression in tumor specimen slices after the surgery of gastric cancer was 60.6%，and the positive rate in tumor specimen sliceswas higher than that in the control group（P＜0.01）；the concentration of P53 protein in the exhaled breath in the patients with gastric cancer was（50.81±14.25）ng/L，which was higher than that in the control group（P＜0.01）；P53 protein concentration in EBC in the patients with gastric cancer phaseⅡ+Ⅲ+Ⅳwas higher than phaseⅠgastric cancer；the sensitivity and specificity of P53 protein determination in tumor tissue in the gastric cancer group were 60.7%and 90.0%，and 42.4%and 93.4%in EBC.There was no significant difference in the two determination ways（P＞0.05）.Conclusion P53 protein determination in tumor tissue and EBC in the patients with gastric cancer can be applied in the adjuvant diagnosis and diseasemonitoring of gastric cancer.

Gastric cancer；P53 protein；Exhaled breath condensate（EBC）；Tumor tissues

R735.2

A

1673-9701（2016）18-0009-03

2016-02-20）

浙江省醫(yī)藥衛(wèi)生科技計(jì)劃項(xiàng)目（2015KYA012）