吳賢敏 武鵬 葉凡 李志春 楊開顏 林昶 陳曉云▲

1.溫州醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院耳鼻咽喉-頭頸外科，浙江溫州325000；2.福建醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院耳鼻咽喉-頭頸外科，福建福州350004；3.溫州醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院病理科，浙江溫州325000

IFN-γ和IL-1在鼻咽血管纖維瘤中的表達(dá)及其意義

吳賢敏1武鵬1葉凡1李志春2楊開顏3林昶2陳曉云1▲

1.溫州醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院耳鼻咽喉-頭頸外科，浙江溫州325000；2.福建醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院耳鼻咽喉-頭頸外科，福建福州350004；3.溫州醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院病理科，浙江溫州325000

目的檢測干擾素-γ（interferon-γ，IFN-γ）和白細(xì)胞介素-1（interleukin 1，IL-1）在鼻咽血管纖維瘤中的表達(dá)水平，探討IFN-γ和IL-1在鼻咽血管纖維瘤骨質(zhì)破壞機(jī)制中的作用。方法應(yīng)用免疫組化SP法檢測IFN-γ和IL-1在2000～2012年期間20例鼻咽血管纖維瘤和2015年3～6月期間10例正常下鼻甲組織中的表達(dá)。結(jié)果IFN-γ和IL-1蛋白在JNA中的陽性表達(dá)率均為100%，明顯高于IFN-γ和IL-1蛋白在下鼻甲組織中的陽性表達(dá)率20%（P均＜0.05）。IFN-γ和IL-1蛋白的表達(dá)與JNA臨床分期無關(guān)（P＞0.05）。結(jié)論IFN-γ和IL-1在鼻咽血管纖維瘤組織中陽性表達(dá)率較高，可能是參與鼻咽血管纖維瘤骨質(zhì)破壞的相關(guān)因素。

干擾素-γ；白細(xì)胞介素-1；鼻咽血管纖維瘤；免疫組化

鼻咽血管纖維瘤（juvenile nasopharyngeal angiofibroma，JNA）為鼻咽部最常見的良性腫瘤，常發(fā)生于10～25歲的青年男性，由大量的血管、彈性纖維及致密結(jié)締組織組成，Liang等［1］認(rèn)為其本質(zhì)是血管錯(cuò)構(gòu)瘤。雖然JNA是良性腫瘤，但其破壞顱底及周圍骨質(zhì)可導(dǎo)致嚴(yán)重的并發(fā)癥。JNA破壞顱底骨質(zhì)進(jìn)行擴(kuò)張性生長的機(jī)制尚未清楚。最近在研究病理性骨質(zhì)破壞性疾病中發(fā)現(xiàn)IFN-γ和IL-1在膽脂瘤型中耳炎骨質(zhì)破壞中發(fā)揮重要作用［2-4］。JNA的骨質(zhì)破壞過程與膽脂瘤的骨質(zhì)破壞過程有許多相似之處，它們都是良性腫瘤，都會破壞顱底骨質(zhì)進(jìn)行擴(kuò)張性生長。本實(shí)驗(yàn)擬應(yīng)用免疫組化染色SP法檢測IFN-γ和IL-1在JNA組織中的表達(dá)，探討其在JNA骨質(zhì)破壞機(jī)制中的作用，現(xiàn)報(bào)道如下。

1 材料與方法

1.1 材料來源

20例鼻咽血管纖維瘤標(biāo)本來自于2000～2012年福建醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院病理科，福建省耳鼻喉研究所石蠟包埋存檔蠟塊。鼻咽血管纖維瘤組：鼻咽血管纖維瘤患者標(biāo)本共20例，術(shù)后病理診斷均為鼻咽血管纖維瘤，患者年齡11～35歲，平均18.5歲，其中男20例，女0例。按Metin等［5］的腫瘤分期標(biāo)準(zhǔn)：Ⅰ期7例，Ⅱ期6例，Ⅲ期6例，Ⅳ期1例。對照組10例下鼻甲組織術(shù)后診斷為下鼻甲慢性炎癥，患者年齡18～40歲，平均25歲，其中男5例，女5例。標(biāo)本來自2015年3～6月溫州醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院耳鼻喉-頭頸外科，在內(nèi)窺鏡下取鼻中隔偏曲伴下鼻甲肥大患者的下鼻甲組織。標(biāo)本均是24 h內(nèi)取材，應(yīng)用4%甲醛固定，常規(guī)石蠟包埋，4μm厚連續(xù)切片。

1.2 試劑

兔抗人IFN-γ單克隆抗體購自SANTA CRUZ公司和兔抗人IL-1多克隆抗體購自北京博奧森生物技術(shù)有限公司。

1.3 免疫組織化學(xué)染色

操作嚴(yán)格按照說明書進(jìn)行，步驟如下：①烤片，68℃，20min；②常規(guī)二甲苯脫蠟，梯度酒精脫水；二甲苯Ⅰ20 min-二甲苯Ⅱ20 min-100%酒精Ⅰ10 min-100%酒精Ⅱ10min-95%酒精5 min-80%酒精5 min-70%酒精5 min；③阻斷滅活內(nèi)源性過氧化物酶：3% H2O237℃孵育10min，PBS沖洗3×5min；④抗原修復(fù)：置0.01M枸櫞酸緩沖液（pH 6.0）中煮沸（95℃，15～20min），自然冷卻20min以上，再用冷水沖洗缸子，加快冷卻至室溫，PBS沖洗3×5 min；⑤正常羊血清工作液封閉，37℃10 min，傾去勿洗；⑥滴加一抗4℃冰箱孵育過夜，PBS沖洗3×5min（用PBS緩沖液代替一抗作陰性對照）；滴加生物素標(biāo)記二抗，37℃孵育30 min，PBS沖洗3×5min；⑦滴加辣根過氧化物酶標(biāo)記的鏈霉素卵白素工作液，37℃孵育30min，PBS沖洗3×5min；⑧DAB/H2O2反應(yīng)染色，自來水充分沖洗后，蘇木素復(fù)染，常規(guī)脫水，透明，干燥，封片。用PBS代替第一抗體作為陰性對照，用已知陽性片做陽性對照。

1.4 免疫組化結(jié)果判斷［6］

IFN-γ和IL-1的陽性染色者細(xì)胞胞漿有棕黃色顆粒沉著，陽性細(xì)胞數(shù)：0分為無陽性細(xì)胞，1分為陽性細(xì)胞數(shù)＜25%，2分為陽性細(xì)胞數(shù)占25%～50%，3分為陽性細(xì)胞數(shù)占51%～75%，4分為陽性細(xì)胞數(shù)占＞75%。染色強(qiáng)度：0分為無染色，1分為弱染色，2分為中等強(qiáng)度染色，3分為強(qiáng)染色。計(jì)算各抗體的陽性細(xì)胞數(shù)和染色強(qiáng)度得分，以3～7分為陽性。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

應(yīng)用SPSS13.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行分析，IFN-γ和IL-1陽性表達(dá)率采用χ2檢驗(yàn)或者精確概率法進(jìn)行比較，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 IFN-γ和IL-1的陽性表達(dá)

主要位于JNA血管壁內(nèi)皮細(xì)胞和基質(zhì)成纖維細(xì)胞的胞漿中，呈棕黃色。IFN-γ和IL-1在下鼻甲組織中弱表達(dá)或無表達(dá)，弱表達(dá)顆粒主要位于成纖維細(xì)胞胞漿、血管內(nèi)皮細(xì)胞的胞漿和漿液性腺體中，著色強(qiáng)度不一，見封三圖1。分別對JNA組和下鼻甲組的IFN-γ和IL-1陽性表達(dá)率分別進(jìn)行比較，見表1～2。JNA組中的IFN-γ的陽性表達(dá)率為100%（20/20），下鼻甲組中的IFN-γ陽性表達(dá)率為20%（2/10），JNA組中的IFN-γ表達(dá)水平明顯高于下鼻甲組，差異有高度統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）。JNA組中的IL-1的陽性表達(dá)率為100%（20/20），下鼻甲組中IL-1的陽性表達(dá)率為20%（2/10），JNA組中的IL-1表達(dá)水平明顯高于下鼻甲組，差異有高度統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）。

表1 IFN-γ蛋白在JNA組織和下鼻甲組織中的表達(dá)情況

表2 IL-1蛋白在JNA組織和下鼻甲組織中的表達(dá)情況

2.2 IFN-γ和IL-1蛋白在鼻咽血管纖維瘤的不同臨床分期中的陽性表達(dá)率

本研究表明IFN-γ和IL-1在鼻咽血管纖維瘤的不同臨床分期中的表達(dá)比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），見表3、4。

表3 IFN-γ在JNA的不同臨床分期中的表達(dá)情況

表4 IL-1在JNA的不同臨床分期中的表達(dá)情況

3 討論

IFN-γ對于破骨細(xì)胞的調(diào)控有不同的觀點(diǎn)，有研究顯示［7］IFN-γ通過快速降解RANK的銜接蛋白-TRAF6來干擾細(xì)胞內(nèi)RANKL信號的傳導(dǎo)，抑制破骨細(xì)胞的形成。然而Gao等［8］報(bào)道IFN-γ會刺激破骨細(xì)胞形成，使MHC-Ⅱ抗原的表達(dá)上調(diào)，進(jìn)一步刺激T細(xì)胞的活化，活化的T細(xì)胞可以產(chǎn)生大量的TNF-α和RANKL，這兩項(xiàng)研究認(rèn)為IFN-γ這種間接作用已經(jīng)超過其對破骨細(xì)胞前體的抑制作用，進(jìn)一步導(dǎo)致破骨細(xì)胞的形成，造成骨質(zhì)破壞。Kohara H等［9］研究發(fā)現(xiàn)IFN-γ直接抑制破骨細(xì)胞生成和誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡Fas/FasL信號提供，導(dǎo)致骨吸收的間接調(diào)控，這是在炎癥部位對骨破壞的保護(hù)作用。金玲爽等［10］報(bào)道在膽脂瘤中耳炎患者外周血中檢測IFN-γ，顯示IFN-γ促進(jìn)慢性中耳炎骨質(zhì)破壞，其結(jié)果與馬志超等［11］研究結(jié)果相似。IL-1（interleukin-1，IL-1）是一種單核因子，最主要由活化的單核-巨噬細(xì)胞產(chǎn)生，成纖維細(xì)胞和朗罕氏細(xì)胞也可合成和分泌IL-1。IL-1的生物學(xué)活性比較廣泛，可作用于機(jī)體的各個(gè)系統(tǒng)。IL-1可刺激骨細(xì)胞產(chǎn)生前列腺素E2（PGE2），然后PGE2再刺激破骨細(xì)胞，促進(jìn)骨質(zhì)的破壞吸收［12］。Zhang H等［13］研究發(fā)現(xiàn)IL-1受體拮抗劑阻斷肌源性干細(xì)胞分化為破骨細(xì)胞和骨吸收，而且IL-1α可進(jìn)一步增強(qiáng)破骨細(xì)胞分化和骨吸收。Hienz SA等［14］研究發(fā)現(xiàn)腫瘤壞死因子-α、IL-1β、PGE2促進(jìn)破骨細(xì)胞的活性，特別是在出現(xiàn)炎癥時(shí)如發(fā)現(xiàn)牙周炎狀態(tài)。有研究顯示白細(xì)胞介素-1β是重要的促炎性細(xì)胞因子，其參與了RA的發(fā)病機(jī)制，主要引起關(guān)節(jié)炎癥和關(guān)節(jié)軟骨破壞［15-18］。RuscittiP等［19］研究證明白細(xì)胞介素（IL）1β是最強(qiáng)大的促炎細(xì)胞因子之一，是一種強(qiáng)刺激因素，在體外和體內(nèi)通過刺激破骨細(xì)胞RANKL上調(diào)，促進(jìn)骨吸收。已有研究報(bào)道，IL-1存在于膽脂瘤上皮、基質(zhì)，明顯表達(dá)于鄰近膽脂瘤的單核細(xì)胞、骨細(xì)胞、角化的上皮細(xì)胞，于正常的外耳道皮膚也有表達(dá)，但在正常皮膚的表達(dá)明顯低于膽脂瘤上皮［20］。雖然有研究證明無論有無膽脂瘤，IL-1均可導(dǎo)致慢性中耳炎骨質(zhì)吸收。但也有研究顯示，當(dāng)膽脂瘤存在時(shí)，骨破壞的范圍更大，程度更嚴(yán)重［3］。本研究結(jié)果顯示，IFN-γ和IL-1蛋白在JNA中的陽性表達(dá)率均為100%，明顯高于IFN-γ和IL-1蛋白在下鼻甲組織中的陽性表達(dá)率20%，兩者間有明顯的統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。但是本研究中IFN-γ和IL-1在鼻咽血管纖維瘤的不同臨床分期中的表達(dá)比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），表明IFN-γ和IL-1蛋白與鼻咽血管纖維瘤的擴(kuò)張性生長無顯著相關(guān)。我們推測IL-1刺激成骨細(xì)胞產(chǎn)生前列腺素E2、IL-6可刺激破骨細(xì)胞前體細(xì)胞的分化，而前列腺素E2和IL-6又可刺激骨吸收，導(dǎo)致骨質(zhì)破壞。IFN-γ可能刺激破骨細(xì)胞形成，使MHC-Ⅱ抗原的表達(dá)上調(diào)，進(jìn)一步刺激T細(xì)胞的活化，活化的T細(xì)胞可以產(chǎn)生大量的TNF-α和RANKL，IFN-γ這種促進(jìn)作用形成破骨細(xì)胞，導(dǎo)致骨質(zhì)破壞。本研究認(rèn)為IL-1和TNF-γ在JNA骨質(zhì)破壞中可能參與兩種主要病理過程：①刺激成骨細(xì)胞產(chǎn)生前列腺素等炎癥介質(zhì)；②通過刺激破骨細(xì)胞，減少糖蛋白合成，增加糖蛋白降解，并產(chǎn)生膠原酶和其他中性蛋白酶，釋放骨鈣等，從而導(dǎo)致骨質(zhì)的破壞。IFN-γ和IL-1雖然與鼻咽血管纖維瘤的擴(kuò)張性生長無顯著相關(guān)，但I(xiàn)FN-γ和IL-1蛋白在JNA組織中有較高的陽性表達(dá)率，我們推測其可能是參與JNA骨質(zhì)破壞的影響因素，其具體機(jī)制有待進(jìn)一步研究。

［1］Liang J，Yi Z，Liang P.The nature of juvenile nasopharyngeal angiofibroma［J］.Otolaryngol Head Neck Surg，2000，123（4）：475-481.

［2］劉洋，俞琳琳，韓軍，等.金屬硫蛋白2及白細(xì)胞介素1α和6在中耳膽脂瘤組織中的表達(dá)及意義［J］.中華耳鼻咽喉頭頸外科雜志，2012，47（10）：831-835.

［3］Kuczkowski J，Sakowicz-Burkiewicz M，Izycka-wieszewska E，et al.Expression of tumor necrosis factor-a，interleukin-1a，interleukin-6 and interleukin-10 in chronic otitismedia with bone osteolysis［J］.ORL JOtorhinolaryngol Relat Spec，2011，73（2）：93-99.

［4］Lee ZH，Lee SE，Kim CW，et al.IL-1alpha stimulation of osteoclast survival through the PI 3-kinase/Akt and ERK pathways［J］.JBiochem（Tokyo），2002，131（1）：161-166.

［5］Metin?nerci，Oguz?gretmenoglu，Taskin Yücel.Juvenile nasopharyngeal angiofibroma：A revised staging system［J］. Rhinology，2006，44（1）：39-45.

［6］Axiotis CA，Monteagudo C，Merino MJ，et al.Immunohistochemical detection of P-glycoprotein in endometrial adenocarcinoma［J］.Am JPathol，1991，138（4）：799-806.

［7］Takayanagi H，Sato K，Takaoka A，et al.Interplay between interferon and other cytokine systems in bonemetabolism［J］. Immunol Rev，2005，208（2）：181-193.

［8］Gao Y，Grassi F，Ryan MR.IFN-stimulates osteoclast formation and bone loss in vivo via antigen-driven T cell activation［J］.JClin Invest，2007，117（1）：122-132.

［9］Kohara H，Kitaura H，F(xiàn)ujimura Y，et al.IFN-γdirectly inhibits IFN-γ-induced osteoclastogenesis in vitro and in vivo and induces apoptosismediated by Fas/Fas ligand interactions［J］.Immunol Lett，2011，137（1-2）：53-61.

［10］金玲爽，沈志忠，林玨龍，等.IFN-γ和IL-4在膽脂瘤中耳炎患者外周血細(xì)胞中的表達(dá)及意義［J］.臨床耳鼻咽喉頭頸外科雜志，2009，23（16）：753-754.

［11］馬志超，熊觀霞.白細(xì)胞介素-17和干擾素-r與慢性中耳炎骨質(zhì)破壞的關(guān)系［J］.中山大學(xué)學(xué)報(bào)（醫(yī)學(xué)科學(xué)版），2010，31（4）：561-566.

［12］Ahn JM，Huang CC，Abramson M.Third place-Resident Basic ScienceAward 1990.Interleukin-1 causing bone destruction inmiddle ear［J］.Otolaryngol Head Neck Surg，1990，103（4）：527-536.

［13］Zhang H，Huang Y，Wang S，et al.Myeloid-derived suppressor cells contribute to bone erosion in collagen-in duced arthritis by differentiating to osteoclasts［J］.JAutoimmun，2015，65：82-89.

［14］Hienz SA，Paliwal S，Ivanovski S.Mechanisms of bone re sorption in periodontitis［J］.J Immunol Res，2015，2015：615486.

［15］Qi J，Ye X，Ren G.Pharmacological efficacy of anti-IL-1βscFv，F(xiàn)ab and full-length antibodies in treatment of rheumatoid arthritis［J］.Mol Immunol，2014，57（2）：59-65.

［16］Schett G，Gravallese E.Bone erosion in rheumatoid arthritis：Mechanisms，diagnosis and treatment［J］.Nat Rev Rheumatol，2012，8（11）：656-664.

［17］Redlich K，Smolen JS.Inflammatory bone loss：Pathogenesis andtherapeutic intervention［J］.Nat Rev Drug Discov，2012，11（3）：234-250.

［18］Takayanagi H.New developments in osteoimmunology［J］. Nat Rev Rheumatol，2012，8（11）：684-689.

［19］Ruscitti P，Cipriani P，Carubbi F，et al.The role of IL-1β in the bone loss during rheumatic diseases［J］.Mediators Inflamm，2015，2015：78238

［20］Akimoto R，Pawankar R，Yagi T，etal.Acquired and congenital cholesteatoma：Determination of tumornecros is factor-alpha，intercellular adhesion molecule-1，interleukin-1-alpha and lymphocyte functional antigen-1 in the inflammatory process［J］.ORL JOtorhinolaryngol Relat Spec，2000，62（5）：257-265.

Expression and significance of interferon-γand interleukin-1 in juvenile nasopharyngeal angiofibroma

WU Xianmin1WU Peng1YE Fan1LIZhichun2YANG Kaiyan3LIN Chang2CHEN Xiaoyun1
1.Department of Otorhinolaryngology and Head and Neck Surgery，the First Affiliated Hospital ofWenzhou Medical U-niversity，Wenzhou 325000，China；2.Department of Otorhinolaryngology and Head and Neck Surgery，the First Affiliated Hospital of Fujian Medical University，F(xiàn)uzhou 350004，China；3.Departmentof Pathology，the First Affiliated HospitalofWenzhou Medical University，Wenzhou 325000，China

Objective To investigate the expression of interferon-γand interleukin-1 in human juvenile nasopharyngeal angiofibroma tissues.M ethods Twenty juvenile nasopharyngeal angiofibroma samples collected from 2000 to 2012 and ten normal inferior turbinatemueosa specimens collected from March to June 2015 were enrolled in this study，and expressions of IFN-γand IL-1 were determined by immunohistochemistry.Results The positive rate of IFN-γand IL-1 proteins all was 100%in JNA，obviously higher than that in normal inferior turbinatemueosa which the positive rate was20%（P＜0.05）.The expression of IFN-γand IL-1 protein had no relationship with clinic staging of JNA（P＞0.05）. Conclusion This study reveals that the positive rate of IFN-γand IL-1 are markedly increased in the juvenile nasopharyngeal angiofibroma and are closely related to bone resorption induced by juvenile nasopharyngeal angiofibroma.

Interferon-γ；Interleukin-1；Juvenile nasopharyngeal angiofibroma；Immunohistochemistry

R739.63

A

1673-9701（2016）18-0001-03

2016-03-10）

浙江省溫州市公益性科技計(jì)劃項(xiàng)目（Y20140596）

▲通訊作者