吳華東 熊園平 江紅群

南昌大學(xué)第一附屬醫(yī)院耳鼻咽喉頭頸外科(南昌330006)

獲得性中耳膽脂瘤是耳鼻咽喉科較為常見的一種慢性中耳疾病，非真性腫瘤，其角質(zhì)形成細(xì)胞的異常增殖和遷移可導(dǎo)致鄰近組織結(jié)構(gòu)的侵蝕，輕者可造成外耳、中耳結(jié)構(gòu)破壞、聽力下降、面癱等并發(fā)癥；嚴(yán)重者病變可侵及內(nèi)耳甚至顱內(nèi)，造成如眩暈、硬膜外膿腫、腦膿腫等嚴(yán)重并發(fā)癥，甚至死亡。中耳膽脂瘤在組織學(xué)上表現(xiàn)為角蛋白碎片和復(fù)層鱗狀上皮的混合體,主要由3種成分構(gòu)成：基質(zhì)旁組織、上皮基質(zhì)和含大量角蛋白碎片的囊性內(nèi)容物。手術(shù)是目前獲得性膽脂瘤的唯一有效治療方法，但膽脂瘤手術(shù)后仍有復(fù)發(fā)的可能性。目前膽脂瘤的發(fā)病機(jī)制暫不明確，主流的發(fā)病機(jī)制學(xué)說有：袋狀內(nèi)陷理論、上皮遷移理論、鱗狀化生理論和基底細(xì)胞增生理論。但這些理論學(xué)說尚無法完全解釋膽脂瘤的過度增殖、遷移、分化改變、侵襲性和復(fù)發(fā)性的臨床特性，因此深入了解膽脂瘤發(fā)病的分子機(jī)制和危險(xiǎn)因素，以降低甚至解除疾病的發(fā)生、發(fā)展及復(fù)發(fā)，甚至尋找可行的非手術(shù)治療方案，成為了目前研究熱點(diǎn)。本文就獲得性中耳膽脂瘤相關(guān)基礎(chǔ)研究進(jìn)展進(jìn)行綜述。

1 細(xì)胞因子與獲得性膽脂瘤

獲得性膽脂瘤幾乎都存在于感染和炎癥環(huán)境中，復(fù)雜環(huán)境下產(chǎn)生的細(xì)胞因子對(duì)膽脂瘤的發(fā)生、發(fā)展起重要作用，研究表明膽脂瘤組織中高表達(dá)的磷酸化表皮生長(zhǎng)因子受體（Phosphorylated epidermal growth factor receptor，pEGFR）參與了膽脂瘤的形成和發(fā)展[1，2]。Liu等人的研究發(fā)現(xiàn)pEGFR，磷酸化蛋白激酶B（protein kinase B，p-Akt）、細(xì)胞周期蛋白D1（cyclinD1）和增殖細(xì)胞核抗原（proliferating cell nuclear antigen，PCNA）在膽脂瘤組織中都呈現(xiàn)為高表達(dá)，且p-EGFR、p-Akt、cyclinD1的表達(dá)與PCNA的表達(dá)呈顯著正相關(guān)。隨后他們建立了人外耳道角質(zhì)形成細(xì)胞（External auditory canal keratinocytes，EACKs）模型，發(fā)現(xiàn)表皮生長(zhǎng)因子（Epidermal growth factor，EGF）可顯著促進(jìn)EACKs的增殖，且可引起CyclinD1表達(dá)的上調(diào)。而EGFR抑制劑AG1478和磷脂酰肌醇-3-激酶（Phosphatidylinositol-3-kinase，PI3K）抑制劑 Wortmannin對(duì)EGF誘導(dǎo)的EACKs增殖有明顯的抑制作用。由此他們推斷EGF通過激活EGFR/PI3K/Akt/CyclinD1信號(hào)通路，參與了膽脂瘤上皮的過度增殖[2]。另一項(xiàng)研究發(fā)現(xiàn)肝素結(jié)合型表皮生長(zhǎng)因子樣生長(zhǎng)因子（heparin-binding EGF-like growth factor，HB-EGF）相比外耳道正常皮膚組織在膽脂瘤中也呈高表達(dá)，且與膽脂瘤骨破壞程度呈正相關(guān)，提示HB-EGF可能參與了膽脂瘤上皮角質(zhì)形成細(xì)胞的增殖和膽脂瘤骨破壞機(jī)制[3]，但其中的確切通路與機(jī)制仍需進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)探討。

中耳膽脂瘤上皮細(xì)胞的過度增殖還與角質(zhì)細(xì)胞生長(zhǎng)因子（Keratinocyte growth factor，KGF）有關(guān)，Yamamoto-Fukuda等人通過在動(dòng)物模型中耳內(nèi)長(zhǎng)期重復(fù)轉(zhuǎn)染KGF cDNA，成功誘導(dǎo)了中耳膽脂瘤的發(fā)生[4]。KGF還可能通過誘導(dǎo)pp63的表達(dá)，促進(jìn)膽脂瘤干細(xì)胞和/或祖細(xì)胞的增殖活性、抑制膽脂瘤基底層祖細(xì)胞的分化，從而引起膽脂瘤上皮的增生[5]。膽脂瘤組織中的角質(zhì)形成細(xì)胞還可分泌甲狀旁腺激素相關(guān)蛋白(Parathyroid hormone associated protein，PTHrP)，并通過核因子-κB受體活化因子配體（Receptor Activator of Nuclear Factor-κB Ligand，RANKL）信號(hào)通路參與中耳膽脂瘤的骨吸收過程[6]。血管生成生長(zhǎng)因子，如成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子α（Fibroblast growth factor，F(xiàn)GF-α）、轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β（Transforming growth factor-β，TGF-β）、轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-α（Transforming growth factor-α，TGF-α）和血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子（Vascular endothelial growth factor，VEGF），則與膽脂瘤基質(zhì)周圍血管生成密切相關(guān)，這些細(xì)胞因子在支持角質(zhì)形成細(xì)胞持續(xù)遷移到鼓室的過程中起著至關(guān)重要作用，參與膽脂瘤的擴(kuò)張[7]。

此外，Mzczepanski等人發(fā)現(xiàn)膽脂瘤組織中胞內(nèi)高表達(dá)的高遷移率族蛋白B1（high-mobility box 1，HMGB1）在應(yīng)激或壞死時(shí)可從胞內(nèi)釋放出來，與角質(zhì)形成細(xì)胞中過度表達(dá)的晚期糖基化終產(chǎn)物受體（Receptor for Advanced Glycation Endproduct，RAGE）結(jié)合，導(dǎo)致角質(zhì)形成細(xì)胞增殖、遷移和白細(xì)胞介素（Interleukin,IL）-8的分泌，參與膽脂瘤的形成和骨破壞[8]。隨后Chi等人在膽脂瘤上皮細(xì)胞外檢測(cè)到了HMGB1和凋亡膽脂瘤角質(zhì)細(xì)胞釋放的DNA片段，發(fā)現(xiàn)當(dāng)它們同時(shí)存在時(shí)可顯著誘導(dǎo)膽脂瘤角質(zhì)形成細(xì)胞產(chǎn)生腫瘤壞死因子-α（tumor necrosis factor，TNF-α）和IL-1b，導(dǎo)致膽脂瘤的骨吸收和破壞[9]。這些研究表明，細(xì)胞因子在膽脂瘤的生物學(xué)行為中有著重要作用，與膽脂瘤進(jìn)展和骨破壞密切相關(guān)。

2 感染和獲得性膽脂瘤

獲得性膽脂瘤常常與病原體的感染相生相伴，當(dāng)感染發(fā)生時(shí)與人非特異性免疫有關(guān)的病原體識(shí)別受體(Pathogen recognition receptor，PRR)可通過識(shí)別病原體表達(dá)的病原體相關(guān)分子模式,誘導(dǎo)一系列免疫反應(yīng)的發(fā)生，從而參與膽脂瘤的發(fā)生、發(fā)展。研究發(fā)現(xiàn)PRR家族中Toll樣受體4（Toll-like receptors 4,TLR4）在獲得性膽脂瘤中表達(dá)增加且與疾病嚴(yán)重程度呈正相關(guān)。構(gòu)建的小鼠動(dòng)物模型發(fā)現(xiàn)，與野生型小鼠對(duì)比，缺乏TLR4表達(dá)基因的小鼠IL-1β、TNF-α、NF-κB和RANKL和抗酒石酸酸性磷酸酶（tartrate-resistant acid phosphatase，TRAP）mRNA表達(dá)水平降低，從而減少了體內(nèi)破骨細(xì)胞的形成，減輕了對(duì)實(shí)驗(yàn)性獲得性膽脂瘤所致的骨破壞和聽力損失[10]。與TLRs類似，髓系細(xì)胞觸發(fā)受體(triggering receptors expressed on myeloid cells，TREM)是與炎癥反應(yīng)相關(guān)的受體家族，研究發(fā)現(xiàn)TREM-2在獲得性膽脂瘤組織中表達(dá)明顯升高，其表達(dá)水平與膽脂瘤的骨破壞程度呈正相關(guān)。而敲除小鼠的TREM-2基因可減輕實(shí)驗(yàn)獲得性膽脂瘤的成熟以及膽脂瘤引起的骨破壞。這項(xiàng)研究認(rèn)為，TREM-2可能是通過激活TLR-4信號(hào)通路放大炎癥反應(yīng)、促進(jìn)金屬基質(zhì)蛋白酶（Matrix metallo proteinases,MMPs）的分泌以及激活膽脂瘤組織中的破骨細(xì)胞三個(gè)方面參與膽脂瘤的發(fā)生發(fā)展。然而這項(xiàng)研究對(duì)TREM-2激活TRL-4信號(hào)通路的證據(jù)不夠充分，仍需要更有說服力的實(shí)驗(yàn)證明[11]。MMP-2和MMP-9是一組能降解細(xì)胞外基質(zhì)的蛋白水解酶,研究表明MMP-2和MMP-9在膽脂瘤組織中表達(dá)明顯高于正常皮膚組織，與膽脂瘤的發(fā)生、發(fā)展及骨質(zhì)破壞有關(guān)[12]。另外一項(xiàng)研究提示Rho激酶可能在細(xì)胞分化中起重要作用,其活性降低和表達(dá)減弱可能導(dǎo)致了角質(zhì)形成細(xì)胞過度增殖和低分化[13]。

膽脂瘤的持續(xù)性和復(fù)發(fā)性臨床特點(diǎn)與膽脂瘤標(biāo)本中廣泛存在細(xì)菌生物膜有關(guān)。因局部或全身應(yīng)用的抗生素難以清除中耳生物膜內(nèi)的固著的細(xì)菌，在某種情況下，這些生物膜內(nèi)的固著細(xì)菌可重新游離，引起疾病的遷延不愈和復(fù)發(fā)。目前越來越多的證據(jù)發(fā)現(xiàn)生物膜廣泛存在于膽脂瘤標(biāo)本中，支持了生物膜與膽脂瘤之間的聯(lián)系[14]。對(duì)膽脂瘤感染中的微生物種類研究發(fā)現(xiàn)，最常見的病原菌為銅綠假單胞菌[15]，Si等人將小鼠自體皮片移植入中耳腔再向中耳腔內(nèi)注入銅綠假單胞菌，6周后92%的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物發(fā)生了膽脂瘤[16]。誘導(dǎo)性膽脂瘤沙土鼠模型中，伴隨銅綠假單胞菌感染的動(dòng)物與未感染組相比，前者膽脂瘤的大小和侵襲性增加[17]，這些研究都表明膽脂瘤與銅綠假單胞菌感染存在密切聯(lián)系。最近一項(xiàng)對(duì)膽脂瘤和正常中耳微生物區(qū)系的基因測(cè)序技術(shù)研究顯示，膽脂瘤基質(zhì)和膽脂瘤附近未累及的粘膜中存在著多種微生物的感染[18]，因此獲得性膽脂瘤的發(fā)生發(fā)展可能是多種微生物感染共同導(dǎo)致的結(jié)果，但目前通過微生物感染種類對(duì)獲得性膽脂瘤發(fā)病機(jī)制的研究較少，仍需進(jìn)一步探尋。

3 基因組學(xué)改變與獲得性膽脂瘤

與正常皮膚相比，膽脂瘤組織中有多種細(xì)胞增殖標(biāo)記物表達(dá)上調(diào)，如細(xì)胞角蛋（Cytokeratin，CK）16、Ki67、PCNA等，證明了膽脂瘤上皮具有高增殖活性。Lin等人報(bào)道了中耳膽脂瘤細(xì)胞中β-鏈蛋白(β-catenin)的表達(dá)顯著增加，激活Wnt/β-catenin通路，可誘導(dǎo)CK16、CK18、Ki67和增殖細(xì)胞核抗原的表達(dá)，促進(jìn)膽脂瘤上皮細(xì)胞增殖[19]。全基因微陣列分析發(fā)現(xiàn)，和正常外耳道皮膚對(duì)比，膽脂瘤中有811個(gè)基因上調(diào)，334個(gè)基因下調(diào)。多種在腫瘤中下 調(diào) 的 抑 癌 基 因 ，如 ：CDH18.19、ID4、PAX3、LAMC2、TRAF2B等在膽脂瘤中也下調(diào)。在炎癥中起重要作用的KRT6B、SPP1和S100A7A顯著上調(diào)。CK5/6、CK14以及MMPs、PAX3、SP5、TFAP2B等轉(zhuǎn)錄因子在膽脂瘤中下調(diào)[20]。另一項(xiàng)對(duì)膽脂瘤組織DNA差異表達(dá)分析發(fā)現(xiàn)，其中有104個(gè)基因表達(dá)上調(diào)，178個(gè)基因表達(dá)下調(diào)，其囊括了受體結(jié)合、細(xì)胞通訊與運(yùn)動(dòng)、維生素代謝、細(xì)胞因子介導(dǎo)炎癥等各個(gè)方面，實(shí)時(shí)PCR技術(shù)證實(shí)了其中部分關(guān)鍵基因：TCN1、PI3、IL-8、IGF-2、KLKI3、HSP90B、ARGE基因上調(diào)，而DCD、CCL27基因下調(diào)[21]。這些上調(diào)或下調(diào)的基因都可作為未來研究的重要方向。細(xì)胞型Fas相關(guān)死亡域蛋白樣白介素-1B轉(zhuǎn)換酶抑制蛋白（c-FLIP）是一種凋亡抑制蛋白，可使細(xì)胞凋亡受抑制，常常在人類惡性腫瘤和良性增生性上皮疾病中高表達(dá)，Chung等人在膽脂瘤中也發(fā)現(xiàn)了c-FLIP的高表達(dá)，且與細(xì)胞增殖標(biāo)記物KI-67的高表達(dá)具有顯著正相關(guān)性，提示細(xì)胞凋亡和抗凋亡間的平衡性的改變?cè)谀懼龅陌l(fā)病機(jī)制中起一定作用[22]。

總而言之，對(duì)獲得性膽脂瘤基因組的研究表明有許多分子調(diào)節(jié)網(wǎng)絡(luò)參與了疾病的發(fā)生，這些調(diào)節(jié)節(jié)點(diǎn)在未來可能成為藥物治療的靶點(diǎn)。

4 micro-RNA與獲得性膽脂瘤

micro-RNA是一種長(zhǎng)度約20-24個(gè)核苷酸的非編碼單鏈RNA分子，在控制細(xì)胞功能，包括細(xì)胞分化、增殖和凋亡方面發(fā)揮重要作用。Zang等人發(fā)現(xiàn)miR-203a在膽脂瘤組織中表達(dá)下調(diào)，其下調(diào)導(dǎo)致了其直接靶基因轉(zhuǎn)錄因子Bmil的上調(diào)，Bmi1可促進(jìn)角質(zhì)形成細(xì)胞的增殖，防止膽脂瘤細(xì)胞過早衰老和死亡，此外，Bmi1還可增強(qiáng)p-Akt的表達(dá)，通過這兩種作用機(jī)制從而促進(jìn)了膽脂瘤上皮細(xì)胞的生長(zhǎng)、增殖[23]。MiR-21因在多種癌癥組織中高表達(dá)而廣為人知，其可通過抑制抑癌基因的表達(dá)而導(dǎo)致細(xì)胞的異常增殖，常被認(rèn)為是一種致癌miRNA；let-7miRNA在許多實(shí)體器官腫瘤中表達(dá)下調(diào)，并通過靶向癌基因發(fā)揮腫瘤抑制作用。Chen和Qin等人發(fā)現(xiàn)膽脂瘤組織中的miR-21和let-7amiRNA的表達(dá)水平明顯高于正常皮膚，且這種現(xiàn)象在兒童膽脂瘤中尤為明顯，他們的研究認(rèn)為膽脂瘤中高表達(dá)的let-7miRNA可能通過抑制HMGA2的表達(dá)，導(dǎo)致角質(zhì)形成細(xì)胞凋亡增加和膽脂瘤細(xì)胞增殖減少，miR-21的上調(diào)則導(dǎo)致了膽脂瘤的高增殖和侵襲性特點(diǎn)，因此膽脂瘤的高增值但卻表現(xiàn)為良性的性質(zhì)是由于let-7a microRNA和miR-21之間的動(dòng)態(tài)平衡所致，但這一點(diǎn)仍有待完全確定[24]。隨后Zhang等人發(fā)現(xiàn)let-7a模擬物的過表達(dá)抑制了miR-21的表達(dá)。相反，抑制let-7a可促進(jìn)miR-21的表達(dá)。證實(shí)了microRNA let-7a可通過使角質(zhì)形成細(xì)胞周期阻滯于G0/G1期從而抑制其增殖和誘導(dǎo)其凋亡兩種機(jī)制抑制膽脂瘤的生長(zhǎng)，且let-7a還可抑制膽脂瘤角質(zhì)形成細(xì)胞的遷移和侵襲[25]。在隨后的研究中他們進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)抑制miR-21也可促進(jìn)let-7a miRNAs的表達(dá)，表明miR-21和let-7a miRNAs之間還存在除下游靶點(diǎn)以外的相互調(diào)節(jié)機(jī)制[26]。最近Xie等人利用miRNA微陣列技術(shù)比較了獲得性中耳膽脂瘤和正常皮膚的miRNA表達(dá)譜[27]，發(fā)現(xiàn)膽脂瘤組織中共有44個(gè)上調(diào)的miRNA(miRNA-21-3p、miRNA-584-5p、miRNA-16-1-3p等)和175個(gè)下調(diào)的 miRNA(miRNA-10a-5p、miRNA-152-5p、miRNA-203b-5p等)。血管生成在膽脂瘤的擴(kuò)張中作用也必不可少[6]，在人膽脂瘤周圍成纖維細(xì)胞分泌的外泌體中，miR-106b-5p表達(dá)的下調(diào)，對(duì)鄰近內(nèi)皮細(xì)胞中血管緊張素II的抑制作用減弱，以此促進(jìn)膽脂瘤新生血管形成，從而調(diào)節(jié)膽脂瘤的發(fā)展[28]。

5 獲得性膽脂瘤中的干細(xì)胞

Nagel等人首次報(bào)道了在膽脂瘤組織中發(fā)現(xiàn)干細(xì)胞群體：中耳膽脂瘤干細(xì)胞（Middle Ear Cholesteatoma derived Stem Cells,ME-CSC）。它們具有自我更新、形成神經(jīng)球和分化為中胚層和外胚層細(xì)胞型的能力。相比健康外耳道皮膚來源的干細(xì)胞，ME-CSC具有更高的TLR4表達(dá)和對(duì)炎癥刺激的敏感性。將其置于模擬膽脂瘤的微環(huán)境中還能夠分化為角質(zhì)形成細(xì)胞樣細(xì)胞。隨后，進(jìn)一步對(duì)比MECSC和外耳道皮膚干細(xì)胞，發(fā)現(xiàn)ME-CSC的TLR4的表達(dá)顯著增加的同時(shí)，伴隨著TNF-α，IL-1α，IL-1?，IL-6和IL-8的脂多糖（lipopolysaccharide,LPS）依賴性促炎基因表達(dá)顯著增強(qiáng)。與TNFα處理的外耳道皮膚干細(xì)胞相比，用TNFα刺激ME-CSC導(dǎo)致IL-6，IL-8以及TNFα本身的表達(dá)水平顯著提高。他們認(rèn)為這是由于ME-CSCs中存在一個(gè)由TNF-α驅(qū)動(dòng)NF-κB從而激活的放大炎癥的正反饋循環(huán)[29]。進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)TLR4拮抗劑LPS-RS可使MECSC的IL-1?，IL-6和TNFα表達(dá)幾乎完全喪失，從而阻斷ME-CSCs對(duì)炎癥的放大反應(yīng)[30]。這些發(fā)現(xiàn)表明了膽脂瘤干細(xì)胞的存在及在膽脂瘤中的作用，為膽脂瘤的臨床治療提供了可能的干預(yù)方向。

6 結(jié)論與展望

本文對(duì)獲得性膽脂瘤的基礎(chǔ)研究進(jìn)行了較為全面的總結(jié)和綜述，但其具體發(fā)病機(jī)制仍需進(jìn)一步研究和闡明，目前對(duì)膽脂瘤的基礎(chǔ)研究更進(jìn)一步提示了炎癥介質(zhì)、局部感染、基因組學(xué)改變和膽脂瘤干細(xì)胞與膽脂瘤的生物學(xué)行為密切相關(guān)。這些研究結(jié)果，為我們后續(xù)膽脂瘤的干預(yù)和治療提供了理論基礎(chǔ)。