孟　楠，馬珊珊，王欣欣，姚　寧，邢　衢，宋及時，黃團結(jié)，關方霞1,#

1)鄭州大學第一附屬醫(yī)院干細胞研究室 鄭州450052　2)鄭州大學生命科學學院干細胞研究室 鄭州 450001

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氯化鋰聯(lián)合hUC-MSCs移植對阿爾茨海默病小鼠的治療作用

孟楠1)，馬珊珊2)，王欣欣1)，姚寧2)，邢衢2)，宋及時2)，黃團結(jié)2)，關方霞1,2)#

1)鄭州大學第一附屬醫(yī)院干細胞研究室 鄭州4500522)鄭州大學生命科學學院干細胞研究室 鄭州 450001

關鍵詞氯化鋰；Wnt/β-catenin通路；干細胞移植；阿爾茨海默?。恍∈?/p>

摘要目的：研究氯化鋰(LiCl)聯(lián)合人臍帶間充質(zhì)干細胞(hUC-MSCs)移植對阿爾茨海默病小鼠(APP+轉(zhuǎn)基因小鼠)的干預作用。方法：PCR鑒定為APP+轉(zhuǎn)基因小鼠40只隨機分為4組：APP+組、hUC-MSCs移植組、LiCl注射組、聯(lián)合處理組(LiCl注射+hUC-MSCs移植)。處理1個月后，Morris水迷宮檢測小鼠的認知水平，酶標儀法和分光光度法檢測小鼠血清中超氧化物歧化酶(SOD)活性和丙二醛(MDA)含量，qRT-PCR和Western blot法檢測小鼠海馬組織中Wnt/β-catenin通路相關因子的表達。結(jié)果：與APP+組比較，LiCl注射組APP+小鼠逃避潛伏期縮短，穿越平臺次數(shù)增多，平臺所在象限停留時間延長，MDA含量下降，小鼠海馬組織中β-catenin、c-Myc mRNA和蛋白表達量增加，GSK-3β mRNA和蛋白表達量降低(P均<0.05)； hUC-MSCs移植可使APP+小鼠血清中SOD活性升高(P均<0.05)，其他指標的變化與LiCl注射組相同；LiCl注射聯(lián)合hUC-MSCs移植對平臺所在象限停留時間、MDA含量、c-Myc蛋白表達的影響具有協(xié)同效應(P<0.05)。結(jié)論：LiCl聯(lián)合 hUC-MSCs移植對APP+轉(zhuǎn)基因小鼠具有明顯的治療作用。

Effect of lithium chloride combined with hUC-MSCs transplantation on Alzheimer's disease mouse

MENGNan1),MAShanshan2),WANGXinxin1),YAONing2),XINGQu2),SONGJishi2),HUANGTuanjie2),GUANFangxia1,2)

1)StemCellLaboratory,theFirstAffiliatedHospital,ZhengzhouUniversity,Zhengzhou4500522)StemCellLaboratory,SchoolofLifeSciences,ZhengzhouUniversity,Zhengzhou450001

Key wordslithium chloride;Wnt/β-catenin pathway;stem cell transplantation;Alzheimer′s disease;mouse

AbstractAim: To research the effects of lithium chloride(LiCl) combined with human umbilical cord mesenchymal stem cells(hUC-MSCs) transplantation on Alzheimer's disease model mice(APP+transgenic mice) and the potential mechanism. Methods: A total of 40 APP+mice identified by PCR were allocated into 4 groups randomly：APP+group, hUC-MSCs group, LiCl group and LiCl combined with hUC-MSCs group.After 1 month, all mice were to study the learning and memory ability by Morris water maze test, the activity of superoxide dismutase(SOD) and the concentration of malonaldehyde(MDA) in the serum were determined by microplate spectrophotometer and ultraviolet spectrophotometer, the mRNA and proteins associated with Wnt/β-catenin pathway were detected by qRT-PCR and Western blot. Results: Compared with APP+group, the escaping latency was significantly shorter, the times of crossing platform was significantly increased and the time spent in the platform quadrant was significantly longer，MDA concentration was decreased,the expressions of β-catenin and c-Myc mRNA and proteins in the hippocampus tissue were increased, while GSK-3β mRNA and proteins expression was decreased in LiCl group; in hUC-MSCs group,the changing trend of the indexes mentioned above were similar with the LiCl group, and the activity of SOD in serum increased; hUC-MSCs transplantation and LiCl had synergistic effects on the time spent in the platform quadrant, MDA concentration and c-Myc protein expression(P<0.05). Conclusion: LiCl combined with hUC-MSCs transplantation has therapeutic effects on APP+transgenic mice.

阿爾茨海默病(Alzheimer′s disease，AD)是與年齡直接相關的癡呆類型，影響著全世界約3 500萬人口，預計到2050年患者將達到1億[1]。因此，AD是世界范圍內(nèi)亟待解決的健康問題[2]。隨著干細胞在再生醫(yī)學中的應用，關于干細胞治療AD的研究也越來越多。人臍帶間充質(zhì)干細胞(human umbilical cord mesenchymal stem cells，hUC-MSCs)具有取材方便、低免疫原性、倫理學爭議小[3]等特點。前期研究[4]發(fā)現(xiàn)hUC-MSCs移植可以明顯改善APP+轉(zhuǎn)基因小鼠的學習記憶能力，但其分子機制尚不明確。研究[5]顯示激活Wnt/β-catenin通路可以促進成人腦內(nèi)神經(jīng)發(fā)生，調(diào)節(jié)突觸形成與發(fā)育。氯化鋰(lithium chloride，LiCl)是Wnt/β-catenin通路激活劑，可以直接抑制GSK-3β，促進β-catenin在細胞內(nèi)累積[6]。此外，LiCl作為治療雙相情感障礙最重要的藥物[7]，在臨床應用已有100多年，其安全性已得到有效證實。因此，該研究以APP+轉(zhuǎn)基因小鼠為模型，觀察LiCl聯(lián)合hUC-MSCs移植對AD的治療作用，并初步探討其分子機制。

1材料與方法

1.1試劑及儀器hUC-MSCs由課題組前期凍存。DMEM/F12培養(yǎng)基購自寶信生物科技有限公司，胎牛血清購自美國Gemini公司，LiCl購自美國Sigma公司，DNA小提試劑盒、Trizol、反轉(zhuǎn)錄試劑盒、qRT-PCR試劑盒購自TaKaRa公司，APP、GSK-3β、β-catenin、c-Myc引物由生工生物工程(上海)股份有限公司合成，兔抗人GSK-3β、β-catenin、c-Myc多克隆抗體購自武漢三鷹生物技術有限公司，血清SOD活性測定試劑盒及血清MDA含量測定試劑盒購自南京建成生物公司。

1.2APP+轉(zhuǎn)基因小鼠的來源及鑒定4月齡清潔級APP695v717I轉(zhuǎn)基因小鼠購自中國協(xié)和醫(yī)科大學動物所。剪取小鼠尾巴約0.5 cm，用DNA小提試劑盒提取DNA，PCR擴增APP基因(擴增引物為：5’-CCCTGAACCTGAAACATAAAAT-3’和5’-GC TACGAAAATCCAACCTACAA-3’，產(chǎn)物大小284 bp)，瓊脂糖凝膠電泳。經(jīng)PCR鑒定，共獲得40只APP+小鼠。

1.3實驗分組及處理將APP+轉(zhuǎn)基因小鼠隨機分為APP+組、hUC-MSCs移植組、LiCl注射組、聯(lián)合處理組，每組10只。hUC-MSCs移植組：APP+小鼠尾靜脈注射細胞濃度為5×106mL-1的第3代hUC-MSCs細胞懸液0.2 mL；LiCl注射組：APP+小鼠每天腹腔注射0.03 g/kg的LiCl，連續(xù)注射1個月；聯(lián)合處理組：APP+小鼠先尾靜脈注射hUC-MSCs細胞懸液，再連續(xù)1個月每天腹腔注射LiCl；APP+組：尾靜脈注射0.2 mL生理鹽水。

1.4小鼠學習記憶能力的測定小鼠用Morris水迷宮水池直徑120 cm，平臺直徑9 cm，分為4個象限，平臺所在象限為第一象限，水池內(nèi)水不透明，水溫控制在19～20 ℃，水放至淹沒平臺1 cm，每個象限最長實驗時間為60 s，實驗結(jié)束后在平臺上停留10 s，擦干，回籠。每只小鼠每天在不同象限固定位置入水，連續(xù)訓練5 d，3次/d；第6天開始進行空間探索實驗，即撤去平臺，分別從4個象限將小鼠于訓練時的固定位置放入水池中，觀察并利用攝像采集器記錄小鼠游泳軌跡，統(tǒng)計穿越平臺次數(shù)、逃避潛伏期(即第一次到達平臺所在位置所用時間)和平臺所在象限停留時間。

1.5小鼠血清SOD活性、MDA含量的測定Morris水迷宮實驗結(jié)束后，各組分別隨機選取3只小鼠，活體心臟取血，3 000 r/min離心5 min，收集上清，-80 ℃保存。根據(jù)試劑盒說明書推薦方法，采用酶標儀法測定小鼠血清SOD活性，采用分光光度法檢測血清MDA含量。

1.6小鼠海馬組織中Wnt通路相關基因mRNA的檢測Morris水迷宮實驗結(jié)束后，各組分別選取3只小鼠，處死后取出腦組織，分離出海馬，組織勻漿。根據(jù)說明書設定的程序采用qRT-PCR檢測Wnt通路相關基因mRNA的表達。以小鼠GAPDH為內(nèi)參。Trizol裂解法提取組織總RNA，分光光度計測RNA濃度，然后于-80 ℃條件下分裝保存；取500 ng總RNA用反轉(zhuǎn)錄試劑盒合成cDNA，以此為模板，進行熒光定量PCR。引物序列及產(chǎn)物大小見表1。反應結(jié)束后觀察擴增曲線和溶解曲線，采用比較CT法(ΔΔCT)進行數(shù)據(jù)分析。每組3個復孔，每個目的mRNA重復測定3次。

表1　引物序列及產(chǎn)物

1.8統(tǒng)計學處理采用SPSS 19.0處理數(shù)據(jù)，應用析因設計的方差分析對4組小鼠的水迷宮實驗結(jié)果、海馬組織中Wnt/β-catenin通路相關基因mRNA及蛋白表達水平、血清中SOD活性及MDA含量進行比較，檢驗水準α=0.05。

2結(jié)果

2.14組小鼠學習記憶能力的比較見表2。與APP+組相比，其他3組小鼠的逃避潛伏期縮短，穿越平臺次數(shù)以及平臺所在象限停留時間均增加，且聯(lián)合處理組改變更為明顯。

表2　4組小鼠學習記憶能力測試結(jié)果

2.24組小鼠血清SOD活性及MDA含量的比較

見表3。與APP+組相比，hUC-MSCs移植使小鼠血清中SOD活性增加，MDA含量下降，LiCl注射對血清中SOD活性無明顯影響；但可使MDA含量降低，且與hUC-MSCs移植存在協(xié)同作用。

2.34組小鼠海馬組織中Wnt/β-catenin通路相關基因mRNA的表達見表4。LiCl注射和hUC-MSCs移植可使APP+小鼠海馬組織中β-catenin、c-Myc mRNA表達量升高， GSK-3β mRNA表達量下降，但兩者之間無交互作用。

表3　4組小鼠血清SOD活性及MDA含量的比較

表4　4組小鼠海馬組織中

2.44組小鼠海馬組織中Wnt/β-catenin通路相關蛋白的表達見圖1、表5。

APP+：APP+組；MSC：hUC-MSCs移植組；Li：LiCl注射組；Li+M：聯(lián)合處理組。圖1　4組小鼠海馬組織中Wnt通路相關蛋白的表達

組別nGSK-3ββ-cateninc-MycAPP+組31.44±0.040.60±0.030.39±0.02hUC-MSCs移植組31.28±0.021.20±0.030.84±0.03LiCl注射組30.85±0.051.44±0.071.12±0.02聯(lián)合處理組30.62±0.062.15±0.061.96±0.06F注射(P)166.917(<0.001)328.284(<0.001)590.151(<0.001)F移植(P)8.576(0.008)177.072(<0.001)286.769(<0.001)F交互(P)2.638(0.120)1.225(0.281)25.228(<0.001)

由圖1、表5可以看出，LiCl注射和hUC-MSCs移植可增強小鼠海馬組織中β-catenin、c-Myc蛋白的表達， 降低GSK-3β蛋白的表達，兩者聯(lián)合處理對c-Myc蛋白表達的影響具有協(xié)同作用。

3討論

前期研究[8]發(fā)現(xiàn)LiCl對脊髓損傷大鼠具有修復作用，但是LiCl對AD的治療作用國內(nèi)尚無報道。該研究顯示，LiCl腹腔注射能明顯提高APP+轉(zhuǎn)基因小鼠的認知能力，與文獻[9-10]結(jié)論一致；而且與單獨治療組相比，hUC-MSCs移植聯(lián)合LiCl的治療效果更明顯。

AD的一種病理機制為自由基引起的過氧化損傷。有研究[11]顯示，干細胞移植可以有效降低阿爾茨海默病小鼠血清中過氧化終末產(chǎn)物MDA的含量，增加血清中SOD活性。此次實驗進一步證實了該項結(jié)論。該研究結(jié)果顯示，LiCl腹腔注射能有效降低APP+小鼠血清MDA含量，但無提高SOD活性的作用；LiCl聯(lián)合hUC-MSCs對MDA含量的影響具有協(xié)同作用

目前，干細胞治療AD的可能機制主要有細胞替代[12]、介導清除β淀粉樣蛋白、分泌神經(jīng)營養(yǎng)因子、抗炎及免疫調(diào)節(jié)等[13]。研究[14]發(fā)現(xiàn)hUC-MSCs移植可以促進β-catenin、c-Myc的表達，降低GSK-3β的表達，表明hUC-MSCs移植可能通過激活Wnt/β-catenin通路，從而提高APP+轉(zhuǎn)基因小鼠的認知能力。LiCl也可以通過激活Wnt/β-catenin通路對AD起到治療作用[6]。此次試驗證實了上述結(jié)論，但兩者聯(lián)合應用雖然可以改善相關指標，但是并無明顯的協(xié)同作用?？赡艿脑驗椋孩賹嶒灥臉颖玖坑邢?，可能還不足以揭示兩者之間的協(xié)同作用。②LiCl和hUC-MSCs對AD的聯(lián)合治療作用可能并不僅僅通過激活Wnt/β-catenin通路實現(xiàn)，或者由于其他因素的干擾導致兩者對Wnt/β-catenin通路的協(xié)同作用表現(xiàn)不明顯。

綜上所述，hUC-MSCs移植可以激活Wnt/β-catenin通路，提高血清SOD活性，降低血清MDA含量，改善APP+小鼠的認知能力；LiCl腹腔注射亦可激活Wnt/β-catenin通路，降低血清中MDA含量，對AD起到治療作用；兩者聯(lián)合治療效果有協(xié)同增強的趨勢，具體機制有待進一步探索。

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中圖分類號R592

#通信作者，女，1969年2月生，博士，教授，研究方向：干細胞與神經(jīng)修復，E-mail:guanfangxia@126.com

doi：10.13705/j.issn.1671-6825.2016.02.005

*國家自然科學基金資助項目81471306，U1404313；河南省高?？萍紕?chuàng)新團隊項目15IRTSTHN022；河南省科技創(chuàng)新人才計劃項目154

200510008