魏丹蕓，張　洪，彭　銳，張　英

(武漢大學(xué)人民醫(yī)院藥學(xué)部，湖北 武漢　430060)

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ABCC2基因過表達細胞株的建立及鑒定

魏丹蕓，張洪，彭銳，張英

(武漢大學(xué)人民醫(yī)院藥學(xué)部，湖北 武漢430060)

摘要：目的構(gòu)建攜帶ABCC2基因的慢病毒載體，轉(zhuǎn)染HEK293細胞，篩選出穩(wěn)定過表達ABCC2基因的細胞株并進行鑒定，為體外實驗確定與多藥耐藥相關(guān)蛋白2(MRP2)外排轉(zhuǎn)運相關(guān)的底物藥物及其轉(zhuǎn)運機制提供細胞模型。方法根據(jù)GenBank提供的ABCC2基因cDNA序列設(shè)計引物，PCR擴增該基因并將其連接至慢病毒載體PZE-LV105,包裝病毒并感染HEK293細胞。用嘌呤霉素進行篩選得到過表達ABCC2基因的穩(wěn)轉(zhuǎn)細胞株，通過基因測序、實時熒光定量PCR(RTQ-PCR)和蛋白免疫印跡(Western blot)對穩(wěn)轉(zhuǎn)細胞進行鑒定。結(jié)果測序結(jié)果證明重組慢病毒過表達載體所攜帶的ABCC2基因序列與GenBank提供的ABCC2序列一致；RTQ-PCR分析結(jié)果顯示轉(zhuǎn)染了ABCC2基因的HEK293細胞中MRP2 的mRNA相對表達比正常HEK293細胞和空白載體對照HEK293細胞高出約320倍；蛋白免疫印跡試驗顯示，轉(zhuǎn)染了ABCC2基因的HEK293細胞中MRP2蛋白表達水平比正常HEK293細胞和空白載體對照HEK293細胞高出約150倍。結(jié)論該實驗成功構(gòu)建了穩(wěn)定過表達ABCC2基因的細胞株，該細胞株可用于初步篩選確定MRP2的特異性外排轉(zhuǎn)運底物及其轉(zhuǎn)運機制。

關(guān)鍵詞：ABCC2基因；過表達；慢病毒載體；HEK293細胞

ABCC2基因編碼的蛋白質(zhì)是一種ATP結(jié)合盒轉(zhuǎn)運蛋白，一般稱作ABCC2轉(zhuǎn)運蛋白或者多藥耐藥相關(guān)蛋白2(MRP2)。該蛋白主要分布在肝臟、膽囊、腎臟、小腸和結(jié)腸等組織細胞[1]，負(fù)責(zé)外排轉(zhuǎn)運特異性底物，尤其在很多治療性藥物和有毒性外源性物質(zhì)的膽汁排泄中發(fā)揮重要作用[2-4]。雖然ABCC2轉(zhuǎn)運蛋白的底物化合物廣泛，但其在不同的底物化合物轉(zhuǎn)運中發(fā)揮作用的大小卻不盡相同，因此，該轉(zhuǎn)運蛋白很可能與底物藥物的藥效和不良反應(yīng)等高度相關(guān)。目前，國內(nèi)外已經(jīng)有一些研究通過比較正常小鼠和ABCC2缺陷小鼠對一些藥物的轉(zhuǎn)運活性來確定ABCC2蛋白的特異性底物及其對藥物應(yīng)用的影響[5-6]，然而，通過構(gòu)建穩(wěn)定過表達ABCC2的細胞株不僅可以直觀地定量該蛋白表達水平，研究該蛋白的功能活性，減少科研成本，還可以一定程度上排除體內(nèi)其他相關(guān)轉(zhuǎn)運體的干擾。除此之外，構(gòu)建目的基因表達沉默的重組細胞也可以從另一方面反映目的蛋白的作用。因此，本研究通過分子克隆技術(shù)，構(gòu)建了穩(wěn)定過表達ABCC2的HEK293細胞株，為進一步研究確定與多藥耐藥相關(guān)蛋白2(MRP2)外排轉(zhuǎn)運相關(guān)的底物藥物及其轉(zhuǎn)運機制提供重要的實驗工具。

1材料與方法

1.1細胞HEK293細胞(購自萊德爾生物科技有限公司)；293Ta 慢病毒包裝細胞系(GeneCopoeia Cat No. Clv-PK-01)；GCI-L3 化學(xué)感受態(tài)細胞(GeneCopoeia Cat No. STK300-10)；H1299 細胞系(ATCC Cat No.CRL-5803)。

1.2試劑PRM1640和DMEM培養(yǎng)基(購自美國Gibco公司)；胎牛血清(Hyclone公司，Cat.No.SH30087.01)；0.25%胰酶-0.125%EDTA(Gibco公司)；青鏈霉素(Hyclone，Cat.No. SH30010)；PBS磷酸鉀緩沖液(Hyclone，Cat.No.SH30256.01B)；嘌呤霉素(Thermo Fisher Scientific Inc公司，貨號A1113802)；各種限制性內(nèi)切酶和T4 DNA連接酶(購自GeneCopoeia公司)；Premix Prime STARHSR試劑盒、Neasy Mini Kit試劑盒和DNA凝膠回收試劑盒(購自北京全式金生物公司)；HET高效轉(zhuǎn)染試劑盒(深圳百恩維生物科技有限公司，貨號：BW11002)；SYBR Primescript RT-PCR Kit(購自大連Takara 公司)；引物合成及測序(由GeneCopoeia公司完成)；慢病毒載體PEZ-LV105(購自GeneCopoeia公司，Cat.No.EX-Q0603-Lv105)；ABCC2抗體(購自英國ABCAM公司)；二抗Rabbit Anti-Mouse IgG(H+L)-HRP (Southern biotech 貨號：6170-05 )；Polybrene(Sigma公司產(chǎn)品，Cat. No. H9268)；其它化學(xué)試劑均購自國藥集團化學(xué)試劑有限公司，試劑為分析純。

1.3儀器單人超凈臺(AIRTECH)；CB150CoZ細胞培養(yǎng)箱(德國Binder)；CKX41倒置顯微鏡(Olympus)；電泳儀(Power Pac Basic，美國Bio-Rad公司)；高速離心機(Thermo Frescozl)；Thermo落地式培養(yǎng)搖床Forma 481(美國Thermo公司)；Odyssey infrared imaging system Odyssey雙色紅外激光成像系統(tǒng)(LI-COR)；定量PCR儀(ABI PRISM 7500 Sequence Detection System)；DU730核酸/蛋白分析儀(美國BECKMANCOULTER)；Positive clone 測序(Genecopoeia)。

1.4重組慢病毒載體質(zhì)粒的構(gòu)建與鑒定

1.4.1PCR擴增人ABCC2基因根據(jù)NCBI基因庫中提供的人類ABCC2基因序列(ACCESSION NO. ：NM_000392)并遵照引物設(shè)計原則設(shè)計相應(yīng)的引物。用于復(fù)制目的基因的PCR上游引物序列F： CTCGAG atgctggagaagttctgcaactc(大寫字母代表XhoⅠ 酶切位點)，下游引物序列R： TTCGAActagaattttgtgctgttcacattc(大寫字母代表NSPⅤ 酶切位點)。用于檢測目的基因表達的RTQ-PCR上游引物序列F：CCGTATCAGGTTTGCCAGTT，下游引物序列R：TGGAGGTGATCCAGGAAAAG。實驗中作為內(nèi)參的β-actin 的上游引物是:5'-ACAGAGCCTCGCCTTTGCC-3'，下游引物是：5'-CATGTCGTCCCAGTTGGTG-3'，引物均由GeneCopoeia公司合成。常規(guī)方法提取正常HEK239細胞中總RNA，配置反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)體系合成cDNA，以cDNA為模板，依照Premix Prime STARHSR試劑盒說明書配制PCR擴增體系溶液，PCR反應(yīng)條件為98℃ 10 s，60℃ 10 s，72℃ 30 s，30個循環(huán)。擴增產(chǎn)物行1 %瓊脂糖凝膠電泳，使用DNA凝膠回收試劑盒切膠回收RT-PCR產(chǎn)物。

1.4.2PEZ-ABCC2-LV105載體質(zhì)粒的構(gòu)建及鑒定用XhoⅠ和NSPⅤ 限制性內(nèi)切酶對ABCC2擴增產(chǎn)物及PEZ-LV105質(zhì)粒分別進行雙酶切，酶切得到的產(chǎn)物通過瓊脂糖凝膠電泳回收目的片段，用In-Fusion?HD EcoDryTmCloning Kit 做In-fusion連接反應(yīng)，將反應(yīng)體系置于37°C孵育15 min，然后50°C孵育15 min，然后置于冰上，使外源DNA片段和質(zhì)粒載體進行連接。用所得連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化感受態(tài)細菌GCI-L3，涂含氨芐霉素抗性平板，挑取克隆，搖菌過夜，提取質(zhì)粒。重組質(zhì)粒用XhoⅠ 和NSPⅤ 限制性內(nèi)切酶雙酶切初步鑒定后，由GeneCopoeia公司測序驗證，篩選出所需的重組質(zhì)粒，質(zhì)粒命名為PEZ-ABCC2-LV105。

1.4.3重組慢病毒的包裝與轉(zhuǎn)染復(fù)蘇293Ta細胞，在24孔板中以每孔2×105個細胞接種，以DMEM和胎牛血清(FBS)配制完全培養(yǎng)液(89%DMEM+10%FBS+1%青鏈霉素)。用慢病毒載體對應(yīng)的慢病毒包裝試劑盒將PEZ-ABCC2-LV105和包裝載體共轉(zhuǎn)染至293Ta細胞中。在細胞培養(yǎng)恒溫箱中孵育48 h后吸取上清培養(yǎng)液，用0.45 μm 的低蛋白結(jié)合PES過濾膜過濾該培養(yǎng)基收集病毒上清。檢測病毒滴度，分裝后在-80℃冰箱保存，待用時取出融化。將人胚胎腎細胞HEK293接種于96孔板，24 h后加入包裝好的重組慢病毒，再過24 h加0.25 mg·L-1的嘌呤霉素培養(yǎng)基于每孔，壓力篩選1周，中間換液1次。1周后倒置顯微鏡下觀察，細胞培養(yǎng)板上圈出每一個細胞群，標(biāo)記，用0.25%胰酶消化畫圈的細胞群，每一團細胞收集到新的24孔板的一個孔培養(yǎng)，繼續(xù)用0.25 mg·L-1的嘌呤霉素壓力篩選1周，做亞克隆篩選。再用倒置顯微鏡下觀察，挑選出正常生長細胞群傳代，用0.20 mg·L-1的嘌呤霉素維持1個月穩(wěn)定培養(yǎng)，獲得穩(wěn)定轉(zhuǎn)染重組質(zhì)粒細胞株。將沒有插入ABCC2基因片段的載體轉(zhuǎn)染HEK293細胞后得到的細胞作為空白載體對照。

1.5ABCC2過表達細胞株的鑒定

1.5.1實時熒光定量PCR檢測ABCC2 mRNA分別在6孔板中接種HEK293正常細胞、空白載體對照細胞和ABCC2過表達細胞，每孔約2×105個細胞。24 h后分別提取各自細胞組的總RNA，取1 μL RNA樣品50倍稀釋，在BioPhotometer plus 艾本德核酸蛋白測定儀上測定OD值，OD260/OD280的比值大于1.8，說明制備的RNA較純，無蛋白質(zhì)污染。用Primescript RT-PCR Kit將總RNA轉(zhuǎn)錄為cDNA。取三種細胞的cDNA 各5 μL，以之為模板進行Q-PCR，檢測ABCC2 mRNA的表達量變化，確認(rèn)ABCC2過表達細胞株。

1.5.2Western blotting檢測MRP2蛋白的表達水平分別在6孔板中接種HEK293正常細胞、空白載體對照細胞和ABCC2過表達細胞，每孔約2×105個細胞，24 h后收集各組的細胞，分別加入RIPA裂解，并用BCA蛋白試劑盒測定樣品蛋白含量。將提取好樣品的蛋白溶液和上樣緩沖液按2∶1混合，煮沸5 min。冷卻后以12 000 rpm離心10 min(4℃)。然后在10% SDS-PAGE上電泳分離，80 V恒壓50 min，120 V恒壓電泳至溴酚藍剛出膠底部止，轉(zhuǎn)膜至PVDF膜上，用時120 min，電壓100 mA。分別用一抗兔抗鼠ABCC2(1∶1 000)和GAPDH(1∶1 000)于4℃孵育過夜，封閉1 h，再于羊抗兔二抗中避光孵育1 h，TBST洗膜后，在奧德賽雙色紅外激光成像系統(tǒng)進行掃描分析。

2結(jié)果

2.1重組慢病毒質(zhì)粒PEZ-ABCC2-LV105的鑒定RT-PCR擴增ABCC2基因開放讀碼框ORF序列，目的片段大小為4 638 bp，通過1%瓊脂糖凝膠電泳在分子量為4 000～5 000 bp處出現(xiàn)清晰可見單一條帶，與目的片段大小相符(圖1)。用內(nèi)切酶Xho Ⅰ 和NSP Ⅴ 對重組慢病毒質(zhì)粒PEZ-ABCC2-LV105進行雙酶切處理后，1% 瓊脂糖凝膠電泳分析處理得到的產(chǎn)物，在分子量4 000～5 000 bp與目的片段相同位置和約8 000 bp(空載體PEZ-LV105大小8 745 bp)的位置分別出現(xiàn)單一條帶，符合預(yù)期結(jié)果(圖2)。PEZ-ABCC2-LV105經(jīng)雙酶切得到的目的片段經(jīng)堿基測序與ABCC2 NM_000392.3序列完全一致，表明已成功構(gòu)建重組慢病毒質(zhì)粒PEZ-ABCC2-LV105。

圖1PCR擴增ABCC2基因電泳結(jié)果

注：1.Maker；2.ABCC2基因擴增產(chǎn)物。

圖2PEZ-ABCC2-LV105重組質(zhì)粒的雙酶切鑒定目的片段

注：1.Maker；2.PEZ-LV105質(zhì)粒；3.PEZ-ABCC2-LV105質(zhì)粒。

2.2重組質(zhì)粒PEZ-ABCC2-LV105的mRNA 表達水平的檢測分別從HEK293正常細胞、空白載體轉(zhuǎn)染細胞和重組ABCC2過表達細胞中提取RNA，通過RT-PCR以GAPDH為內(nèi)參測定ABCC2 mRNA在各細胞中的表達水平。將正常HEK293細胞的ABCC2基因表達量作為對照，數(shù)值設(shè)為1，轉(zhuǎn)染了PEZ-ABCC2-LV105重組質(zhì)粒的細胞中ABCC2 mRNA的表達量比正常組高出約320倍，P<0.01，結(jié)果見圖3。

圖3　RT-PCR測定各組細胞

注：與正常HEK293細胞相比，*P<0.01；與空白載體對照細胞比較，#P<0.01。

2.3Western blot檢測ABCC2蛋白表達水平以GAPDH蛋白為內(nèi)參，檢測HEK293正常細胞、空白載體轉(zhuǎn)染細胞和重組ABCC2過表達細胞中ABCC2蛋白的表達水平，結(jié)果顯示轉(zhuǎn)染了ABCC2基因的HEK 293細胞中ABCC2蛋白表達量相對于正常HEK293細胞顯著增高(見圖4a)。經(jīng)歸一化處理后，灰度分析結(jié)果見圖4b。

圖4　Western blot檢測各組

注：與正常HEK293細胞相比，*P<0.01；與空白載體對照細胞比較，#P<0.01；1.正常HEK293細胞；2.轉(zhuǎn)染空載體PEZ-LV105的HEK293 細胞；3.轉(zhuǎn)染PEZ-ABCC2-LV105重組質(zhì)粒的HEK293細胞。

3討論

多藥耐藥相關(guān)蛋白(MRP)家族是參與多相有機離子運輸?shù)闹饕狝TP結(jié)合盒(ABC)轉(zhuǎn)運蛋白家族之一[7]。雖然目前該蛋白家族為人所知的MRP1-9都被證實具有相似的蛋白序列、結(jié)構(gòu)、功能和底物[8]，但是因為MRP2與藥物的吸收、分布和消除更為緊密相關(guān)，而且在抗癌藥物耐藥性產(chǎn)生中也扮演了重要的角色[9]，所以研究其在細胞中的定位、表達和功能以及它和底物藥物相互作用的機制對今后底物藥物的個體化應(yīng)用具有重要意義。

上述實驗應(yīng)用分子克隆技術(shù)構(gòu)建過表達ABCC2的重組細胞，大大提高了原本在正常細胞中表達量很低的MRP2蛋白，為體外研究ABCC2的功能、底物特異性和外排轉(zhuǎn)運機制等提供有效的實驗手段。在構(gòu)建重組細胞過程中最關(guān)鍵的步驟是構(gòu)建重組質(zhì)粒和轉(zhuǎn)染HEK293細胞。因為目的基因ORF片段有4 638 bp，連接到慢病毒載體PEZ-LV105后形成12 677 bp的重組質(zhì)粒，這已屬于分子過大的質(zhì)粒，不僅轉(zhuǎn)染困難，而且還可能會影響標(biāo)記基因的表達[10]，因此沒有再在載體質(zhì)粒上連接標(biāo)記綠色熒光蛋白基因，但是獲得的重組慢病毒質(zhì)粒轉(zhuǎn)染HEK293后，通過一定濃度嘌呤霉素的篩選和單克隆，輔以堿基測序、RTQ-PCR和Western blot等實驗技術(shù)的檢測驗證，依然可以確定穩(wěn)定重組ABCC2過表達細胞株的成功構(gòu)建。

目前，國內(nèi)外均有應(yīng)用此種技術(shù)研究ABCC2對某些特定藥物轉(zhuǎn)運的影響[11-13]，以此進一步確定其與藥物臨床治療效果(或毒性)的關(guān)聯(lián)。但是轉(zhuǎn)染宿主細胞多用昆蟲細胞(Sf9)或者犬腎細胞(MDCK)，考慮到ABCC2可能在不同物種組織細胞中表達水平和功能的差異性[14]，本實驗選擇了人胚腎細胞(HEK293)。成功構(gòu)建的穩(wěn)定過表達ABCC2基因的細胞株將應(yīng)用到今后體外篩選確定MRP2的特異性外排轉(zhuǎn)運底物及其轉(zhuǎn)運機制等研究中。

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Construction and identification of the recombinant cell line over-expressing ABCC2 gene

WEI Dan-yun,ZHANG Hong,PENG Rui,et al

(DepartmentofPharmacy,RenminHospitalofWuhanUniversity,Wuhan，Hubei430060,China)

Abstract:Objective To construct the lentiviral vecter carrying human ABCC2 gene,then to screen out the stable cell line over-expressing ABCC2 after package and transfection to HEK293 cells,thus to provide cell model to determine substrate drugs of multidrug resistance protein 2(MRP2) in vitro.Methods The primers were designed according to the cDNA sequence of ABCC2 gene from GenBank. The gene were amplified by PCR and connected to lentiviral vector PEZ-LV105. The recombined lentiviral vector was packaged and transfected to HEK293 cells. After puromycin screening,HEK293 cells over-expressing human ABCC2 gene were selected and cloned. Finally,gene sequencing，real-time quantitative PCR(RTQ-PCR)and Western blot assays were performed for identification.Results RTQ-PCR showed that the ABCC2 mRNA in HEK293 cells transfected with exogenous ABCC2 gene was about 320 times higher than that of normal HEK293 cells and blank carrier HEK293 cells. MRP2 protein level in HEK293 cells with ABCC2 gene transfection was nearly 150 times higher than that of normal HEK293 cells and blank carrier HEK293 cells according to the Western blot.Conclusions Stable recombinant cell line over-expressing ABCC2 was successfully generated. The cell line could be useful in the confirmation of substrate drugs of multidrug resistance protein 2(MRP2)and the transport mechanism in vitro.

Key words:ABCC2 gene;over-expression;lentiviral vector;HEK293 cell

(收稿日期：2015-10-09，修回日期：2015-11-23)

doi:10.3969/j.issn.1009-6469.2016.03.007

作者簡介：魏丹蕓，女，碩士研究生通信作者：張洪，男，教授，碩士生導(dǎo)師，研究方向：消化系統(tǒng)疾病藥物的藥劑學(xué)和藥理學(xué)，E-mail:zhanghongwhu@163.com