陳傳喜，楊志勇，袁　紅，王繼平，王大榮

(黃岡市中心醫(yī)院腫瘤科，湖北 黃岡　438000)

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◇藥物分析◇

HPLC測(cè)定注射用奧沙利鉑的含量及有關(guān)物質(zhì)

陳傳喜，楊志勇，袁紅，王繼平，王大榮

(黃岡市中心醫(yī)院腫瘤科，湖北 黃岡438000)

摘要：目的建立注射用奧沙利鉑含量及有關(guān)物質(zhì)的HPLC方法。方法含量和有關(guān)物質(zhì)測(cè)定以十八烷基硅烷鍵合硅膠作為填充劑Zorbax Rx-C(18)(4.6 mm×250 mm)5 μm，以磷酸溶液(取10%磷酸溶液0.6 mL，加水稀釋至1 000 mL，用氫氧化鈉溶液或磷酸調(diào)節(jié)pH值至3.0)—乙腈=99∶1為流動(dòng)相，流速0.8 mL·min(-1)，檢測(cè)波長(zhǎng)209 nm，進(jìn)樣量20 μL。 結(jié)果奧沙利鉑在6～16×10(-3) g·L(-1)濃度范圍內(nèi)線性關(guān)系良好，檢測(cè)限為0.02%，回收率為100.55%(RSD=0.46%)，測(cè)定樣品含量為99.8%，有關(guān)物質(zhì)均小于0.5%。結(jié)論該方法快速，專(zhuān)屬性強(qiáng)，靈敏度高，重現(xiàn)性好，可作為注射用奧沙利鉑的含量及有關(guān)物質(zhì)的檢測(cè)方法。

關(guān)鍵詞：注射用奧沙利鉑；HPLC法；含量；有關(guān)物質(zhì)

注射用奧沙利鉑是第三代鉑類(lèi)抗癌藥物，臨床用于治療晚期結(jié)、直腸癌，對(duì)順鉑耐藥的腫瘤細(xì)胞也有一定作用，且毒副作用比順鉑小[1]，與傳統(tǒng)化療藥物或紫杉類(lèi)藥物間不具交叉耐藥性[2-3]。注射用奧沙利鉑(商品名：樂(lè)沙定RR)由瑞士Debiopharm公司研制開(kāi)發(fā)生產(chǎn)，規(guī)格為50 mg，于1996年首次在法國(guó)上市，現(xiàn)已經(jīng)在歐盟、美國(guó)及我國(guó)等多個(gè)國(guó)家和地區(qū)上市多年，臨床應(yīng)用廣泛。鉑類(lèi)藥物是晚期癌癥的首選方案，但是早期開(kāi)發(fā)的順鉑和卡鉑具有明顯的交叉耐藥性。奧沙利鉑含有DACH基團(tuán)空間位阻作用較強(qiáng)，作用機(jī)制與順鉑類(lèi)似，與其他抗癌藥物聯(lián)合使用無(wú)交叉耐藥性，能有效避免上述缺點(diǎn)。該藥的分子式為C18H14N2O4Pt，分子量397.29，化學(xué)名為 (1R-反式)-(1,2-環(huán)己二胺-N,N’)[草酸(2-)-O,O’] 合鉑。美國(guó)藥典收載了注射用奧沙利鉑的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)[4]，中國(guó)藥典、英國(guó)藥典等均未收載注射用奧沙利鉑的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)，國(guó)內(nèi)原有質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)WS1-(X-090)-2003Z是為奧沙利鉑的無(wú)菌凍干品或奧沙利鉑與乳糖的無(wú)菌凍干品制定，但研究發(fā)現(xiàn)此方法不能將有關(guān)物質(zhì)中的單雜進(jìn)行控制。本文通過(guò)對(duì)現(xiàn)有HPLC的條件進(jìn)行優(yōu)化，得到快速、準(zhǔn)確的測(cè)定注射用奧沙利鉑含量及有關(guān)物質(zhì)的方法。

1儀器與試藥

Agilent 1260型高效液相色譜儀，配紫外檢測(cè)器(Agilent)及安捷倫色譜工作站，電子分析天平(AE240 梅特勒-托利多儀器有限公司)，HDC-S超聲儀(濟(jì)寧亨達(dá)超聲設(shè)備有限公司)。色譜純乙腈(色譜純，TEDIA公司生產(chǎn))，純化水，氫氧化鈉(分析純，天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司)，磷酸(分析純，國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司)。奧沙利鉑標(biāo)準(zhǔn)品(中國(guó)藥品生物制品檢定所，批號(hào)100584-201408)，注射用奧沙利鉑(江蘇恒瑞醫(yī)藥股份有限公司，批號(hào)：14082247，14082547，14092147，規(guī)格50 mg)。

2方法和結(jié)果

2.1色譜條件 色譜柱：Zorbax Rx-C18(4.6 mm×150 mm，5 μm)；流動(dòng)相：磷酸溶液(取10%磷酸溶液0.6 mL，加水稀釋至1 000 mL，用氫氧化鈉溶液或磷酸調(diào)節(jié)pH值至3.0)∶乙腈=99∶1為流動(dòng)相，流速0.8 mL·min-1，檢測(cè)波長(zhǎng)209 nm，進(jìn)樣量20 μL；柱溫：30℃。

2.2溶液配制

2.2.1含量測(cè)定對(duì)照品溶液精密稱(chēng)取經(jīng)105℃干燥至恒重的奧沙利鉑對(duì)照品25 mg，置250 mL容量瓶中，加適量純化水溶解后，定容至刻度，搖勻，配制成濃度為0.1 g·L-1的對(duì)照品溶液，備用。

2.2.2含量測(cè)定供試品溶液取供試品注射用奧沙利鉑適量(相當(dāng)于奧沙利鉑25 mg)，置250 mL容量瓶中，加適量純化水溶解后，定容至刻度，搖勻，配制成濃度為0.1 g·L-1的供試品溶液，備用。

2.2.3有關(guān)物質(zhì)測(cè)定供試品溶液稱(chēng)取“2.2.2”項(xiàng)中注射用奧沙利鉑的粉末適量，精密稱(chēng)定，置于50 mL的容量瓶中，加入適量蒸餾水溶解，補(bǔ)加蒸餾水定容，搖勻。配制成1 mL中含有約0.01 mg奧沙利鉑的溶液。

2.2.4有關(guān)物質(zhì)對(duì)照溶液精密量取“2.2.3”項(xiàng)中的有關(guān)物質(zhì)供試品溶液1 mL，置于100 mL的量瓶中，加入純化水定容至刻度，搖勻。

2.2.5陰性對(duì)照溶液稱(chēng)取甘露醇100 mg、置于100 mL量瓶中，加水稀釋至刻度，濾過(guò)，取適量，稀釋與樣品相同倍數(shù)，即得空白輔料溶液。

2.3方法學(xué)考察

2.3.1專(zhuān)屬性試驗(yàn)取“2.2.1”項(xiàng)下奧沙利鉑對(duì)照品溶液1 mL，置于100 mL的容量瓶中，加入純化水定容至刻度，充分振搖溶解，精密量取 20 μL進(jìn)色譜儀，按照上述色譜條件測(cè)定，記錄色譜圖。按照上述方法分別取“2.2.2”項(xiàng)下含量供試品溶液、 “2.2.3”項(xiàng)有關(guān)物質(zhì)供試品溶液、“2.2.4”項(xiàng)有關(guān)物質(zhì)對(duì)照溶液及“2.2.5”空白輔料溶液各1 mL，稀釋至同等濃度，進(jìn)色譜儀測(cè)定，記錄色譜圖，結(jié)果輔料峰未干擾測(cè)定(圖1)。

圖1　HPLC色譜圖

注：A.含量測(cè)定對(duì)照品溶液；B.含量測(cè)定供試品溶液；C.有關(guān)物質(zhì)測(cè)定供試品溶液；D.有關(guān)物質(zhì)對(duì)照溶液；E.陰性對(duì)照溶液。

再分別取注射用奧沙利鉑適量，研細(xì)，精密稱(chēng)量粉末(約相當(dāng)于主藥10 mg)進(jìn)行如下測(cè)試：(1)酸破壞：將精密稱(chēng)定后的粉末置具塞試管中，加入0.1 mol·L-1鹽酸溶液25 mL，搖勻，置于100℃水浴鍋中4 h，放冷。加入0.1 mol·L-1氫氧化鈉中和并轉(zhuǎn)移至100 mL的容量瓶中，用流動(dòng)相稀釋至刻度，配制成濃度為0.1 g·L-1的溶液，搖勻，過(guò)濾。(2)堿破壞：將精密稱(chēng)定后的粉末置具塞試管中，用0.1 mol·L-1氫氧化鈉溶液25 mL溶解，搖勻，置于100℃水浴鍋中4 h，放冷。加入0.1 mol·L-1鹽酸中和并轉(zhuǎn)移至100 mL的容量瓶中，用流動(dòng)相稀釋?zhuān)渲瞥蓾舛葹?.1 g·L-1的溶液，搖勻，過(guò)濾。(3)氧化破壞：將精密稱(chēng)定后的粉末置具塞試管中，加入30%過(guò)氧化氫溶液10 mL，搖勻，放置12 h，加水稀釋至刻度，配制成濃度為0.1 g·L-1的溶液，搖勻，過(guò)濾。(4)加熱破壞：將精密稱(chēng)定后的粉末置具塞試管中，加水稀釋?zhuān)渲瞥蓾舛?.1 g·L-1的溶液25 mL，置于100℃水浴鍋中4 h，放冷，過(guò)濾。(5)光破壞：將精密成定后的粉末置具塞試管中，加水稀釋?zhuān)渲贸?.1 g·L-1溶液25 mL，置于強(qiáng)光(5 000 Lx)下照射12 h后，放冷。按照上述色譜條件進(jìn)行測(cè)定，記錄色譜圖。結(jié)果顯示樣品在經(jīng)過(guò)酸、堿、氧化、加熱、光照破壞后主成分與各降解產(chǎn)物可以達(dá)到很好的分離(圖2)。

圖2　降解產(chǎn)物測(cè)試HPLC圖

注：F.樣品酸破壞圖譜；G.樣品堿破壞圖譜；H.樣品氧化破壞圖譜；I.樣品加熱破壞圖譜；J.樣品光照破壞圖譜。

2.3.2系統(tǒng)適用性試驗(yàn)分別精密量取“2.2.1”項(xiàng)中奧沙利鉑對(duì)照品溶液、“2.2.2”注射用奧沙利鉑供試品溶液及“2.2.5”項(xiàng)陰性對(duì)照溶液20 μL，按照上述色譜條件進(jìn)樣，色譜柱的理論塔板數(shù)按照奧沙利鉑計(jì)算不得少于2 000，奧沙利鉑與相鄰雜質(zhì)峰的分離度不低于2.0。

2.3.3檢測(cè)限測(cè)定取“2.2.1”項(xiàng)中配制的奧沙利鉑對(duì)照溶液，稀釋至50×10-3g·L-1，按照上述色譜條件進(jìn)樣，根據(jù)信噪比法進(jìn)行試驗(yàn)，得到的結(jié)果：最小檢出量為4×10-6mg(S/N=3)，檢出限為0.02%。

2.3.4線性試驗(yàn)精密稱(chēng)量奧沙利鉑對(duì)照品25 mg，置于25 mL的容量瓶制備成濃度為1.0 g·L-1的溶液，依次精密吸取0.6，0.8，1.0，1.2，1.4，1.6 mL，分別置于100 mL容量瓶中，用流動(dòng)相稀釋至刻度，搖勻，得到濃度依次為6.00，8.01，10.01，12.02，14.02，16.02×10-3g·L-1濃度的溶液，按照上述色譜條件取20 μL依次進(jìn)樣，記錄色譜圖。以?shī)W沙利鉑峰面積Y為縱坐標(biāo)，以進(jìn)樣濃度X為橫坐標(biāo)，得到線性回歸方程為：Y=0.170 1X+0.141 4，r=0.999 8，表明奧沙利鉑在6.00～16.02×10-3g·L-1濃度范圍內(nèi)呈現(xiàn)良好的線性關(guān)系，結(jié)果見(jiàn)圖3。

圖3　奧沙利鉑線性關(guān)系圖

2.3.5精密度及重復(fù)性試驗(yàn)取“2.2.1”項(xiàng)下奧沙利鉑對(duì)照溶液，按照上述色譜條件進(jìn)樣，重復(fù)測(cè)定6次，記錄奧沙利鉑的峰面積，計(jì)算相標(biāo)準(zhǔn)偏差RSD=0.39%，說(shuō)明儀器精密度良好。此外，取14082247批次的注射用奧沙利鉑，精密稱(chēng)量適量的粉末(相當(dāng)于主藥50 mg)，加水稀釋?zhuān)渲瞥蓾舛葹? g·L-1供試品溶液6份，按照上述色譜條件在同一高效液相色譜儀上分別進(jìn)樣，記錄奧沙利鉑面積，其含量平均值為99.78%，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差RSD=0.42%，顯示重現(xiàn)性良好。

2.3.6回收率試驗(yàn)按照處方比例稱(chēng)量適量的輔料，(相當(dāng)于1瓶制劑的輔料量)，分別加入處方量的80%，100%，120%的奧沙利鉑的對(duì)照品，加水溶解并稀釋至刻度，搖勻，每個(gè)含量的溶液分別取3份1 mL加流動(dòng)相稀釋至10 mL作為供試品溶液。精密量取20 μL溶液，按照上述色譜條件進(jìn)液相儀，記錄圖譜，結(jié)果見(jiàn)表1。計(jì)算得平均回收率為100.55%，RSD=0.46%。

表1　加樣回收率數(shù)據(jù)

2.3.7溶液穩(wěn)定性試驗(yàn)取供試品溶液，分別在0、6、12、18、24 h精密吸取20 μL進(jìn)樣，記錄色譜圖，得出峰面積分別為19021、19214、19321、19330、19610，平均峰面積19226，計(jì)算其相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差RSD為0.65%，說(shuō)明奧沙利鉑在24 h內(nèi)溶液穩(wěn)定。

2.4樣品測(cè)定

2.4.1有關(guān)物質(zhì)測(cè)定取上市品注射用奧沙利鉑1瓶，精密稱(chēng)量適量粉末(相當(dāng)于奧沙利鉑50 mg)，置于50 mL的容量瓶中，加水振蕩溶解，補(bǔ)加水稀釋至刻度，搖勻，過(guò)濾，濾液作為供試品。取“2.2.1”項(xiàng)中奧沙利鉑對(duì)照溶液，稀釋與供試品同等濃度作為對(duì)照溶液。精密量取供試品和對(duì)照品溶液20 μL進(jìn)高效液相色譜儀，記錄色譜圖。根據(jù)面積歸一化法計(jì)算有關(guān)物質(zhì)的峰面積。按照上述方法分別測(cè)定3批上市品(批號(hào)：14082247，14082547，14092147)中有關(guān)物質(zhì)測(cè)定結(jié)果分別為0.35%，0.33%，0.36%。

2.4.2含量測(cè)定取上市品注射用奧沙利鉑1瓶，精密稱(chēng)量適量粉末(約相當(dāng)于主藥10 mg)，置于100 mL的容量瓶中，加水溶解，補(bǔ)加水稀釋至刻度，搖勻，作為供試品。取“2.2.1”項(xiàng)中奧沙利鉑對(duì)照溶液稀釋與供試品同等濃度作為對(duì)照溶液。精密量取20 μL對(duì)照品與供試品溶液，進(jìn)高效液相色譜儀，記錄圖譜。按照外標(biāo)法分別測(cè)定3批上市品(批號(hào)：14082247，14082547，14092147)中含量分別為99.8%，99.9%，99.8%。

3討論

在對(duì)上市品有關(guān)物質(zhì)及含量方法學(xué)的研究過(guò)程中[5-6]，按照國(guó)內(nèi)藥品標(biāo)準(zhǔn)[7]研究發(fā)現(xiàn)此條件不能有效的將有關(guān)物質(zhì)進(jìn)行分離，分離度不足1.5，不能作為檢測(cè)有關(guān)物質(zhì)的條件進(jìn)行測(cè)定。

本研究通過(guò)調(diào)整流動(dòng)相的比例和流速，嘗試使用Alltima-C18、Zorbax Rx-C18、HP-35-C18柱在分離度、理論塔板數(shù)、拖尾因子等方面綜合考量，Zorbax Rx-C18柱具有能有效分離奧沙利鉑的有關(guān)物質(zhì)草酸及其他雜質(zhì)，出峰時(shí)間合理。另外通過(guò)專(zhuān)屬性研究酸、堿、高溫、氧化破壞的雜質(zhì)及對(duì)照品最大的吸收峰均在209 nm，此波長(zhǎng)可以將主成分及有關(guān)物質(zhì)較為靈敏的檢測(cè)出。

通過(guò)測(cè)定的結(jié)果顯示在以下條件：磷酸溶液(1 mL磷酸，加水至1 000 mL即得)—乙腈(99∶1)；流速：0.8 mL·min-1；檢測(cè)波長(zhǎng)：209 nm；進(jìn)樣量：20 μL；柱溫：30℃，主峰和輔料、有關(guān)物質(zhì)達(dá)到基線分離要求，色譜峰形對(duì)稱(chēng)符合檢測(cè)要求。

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Determination of content and related substances of Oxaliplatin for Injection by HPLC

CHEN Chuan-xi,YANG Zhi-yong,YUAN Hong,et al

(DepartmentofOncology,HuanggangCentralHospital,Hubei438000,China))

Abstract:ObjectiveTo establish an HPLC method to determine the oxaliplatin content and the related substances of oxaliplatin for injection. Methods The chromatographic separation was performed on Zorbax Rx-C(18)(4.6 mm×250 mm，5 μm)that was made by alkyl-bonded silica gels,phosphoric acid solution(10% phosphoric acid solution 0.6 mL,diluted with water to 1 000 mL,pH adjusted to 3.0 with sodium hydroxide solution or phosphoric acid)- acetonitrile=99∶1; the flow rate was 0.8 mL·min(-1);the detection wavelength was 209 nm; the sample size was 20 μL.Results The linear of oxaliplatin was 6～16×10(-3) g·L(-1). The limits of detection was 0.02%. The average recovery was 100.55%(RSD=0.46%). Determination of the sample average content was 99.8%,and the related substance was less than 0.5%.Conclusions The method is rapid,specific,sensitive,and well repeatable,which can be used to determine the content of oxaliplatin for injection and its related substances.

Key words:oxaliplatin for injection;HPLC;content;related substance

(收稿日期：2015-10-23，修回日期：2016-01-18)

doi:10.3969/j.issn.1009-6469.2016.03.012