焦麗敏，梁　進(jìn)，王　瓊，李紀(jì)強(qiáng)

(1. 佛山市南海區(qū)第六人民醫(yī)院婦科，廣東 佛山　528200；

2.南方醫(yī)科大學(xué)珠江醫(yī)院腫瘤中心，廣東 廣州　510282)

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卵巢癌組織中microRNA-7表達(dá)水平及其臨床意義

焦麗敏1，梁進(jìn)1，王瓊1，李紀(jì)強(qiáng)2

(1. 佛山市南海區(qū)第六人民醫(yī)院婦科，廣東 佛山528200；

2.南方醫(yī)科大學(xué)珠江醫(yī)院腫瘤中心，廣東 廣州510282)

摘要：目的探討microRNA-7在卵巢癌組織中的表達(dá)水平及其臨床意義。方法收集該院確診的卵巢癌患者42例，每例均行手術(shù)切除。同時收集38例良性卵巢上皮囊腫組織作為良性對照組。采用RT-PCR方法分別檢測卵巢癌組織、癌旁組織和良性病變組織樣本microRNA-7的表達(dá)，并分析其表達(dá)與卵巢癌臨床特征的關(guān)系。結(jié)果卵巢癌組織microRNA-7表達(dá)為0.176±0.063，癌旁組織表達(dá)為0.314±0.099，良性病變組織表達(dá)為0.465±0.123。與癌旁組織和良性病變組織比較，卵巢癌組織中microRNA-7 表達(dá)顯著下降(P均<0.05)。microRNA-7的表達(dá)與患者的年齡、病理分型無關(guān)，與臨床分期和區(qū)域淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移相關(guān)(P均<0.05)。單因素分析結(jié)果顯示，microRNA-7高表達(dá)的卵巢癌病人總生存期長于低表達(dá)組(P=0.02)。結(jié)論 microRNA-7在卵巢癌組織中表達(dá)下顯著調(diào)，可能是卵巢癌患者重要的預(yù)后指標(biāo)之一。

關(guān)鍵詞：卵巢癌；微小RNA；microRNA-7；RT-PCR

卵巢癌是常見的婦科惡性腫瘤之一，據(jù)最新統(tǒng)計，在全球范圍內(nèi)，卵巢癌在婦科腫瘤中發(fā)病率居于第3位，而死亡率居于第1位[1]。卵巢癌對于放、化療敏感性較差，且能夠進(jìn)行根治性手術(shù)治療的患者比例較低，因此卵巢癌患者總體預(yù)后不良[2]。在目前治療方法尚未取得突破性進(jìn)展以前，尋找評估卵巢癌預(yù)后的可能指標(biāo)對于提高卵巢癌治療效果具有重要意義。

研究發(fā)現(xiàn)，microRNA在惡性腫瘤的診斷和預(yù)后評估中發(fā)揮越來越重要的作用，microRNA是一類由內(nèi)源基因編碼的長度約為22個核苷酸的非編碼單鏈RNA分子，通過與mRNA完全或不完全配對，通過降解mRNA或阻遏其轉(zhuǎn)錄后翻譯的調(diào)節(jié)機(jī)制，發(fā)揮其獨特的負(fù)調(diào)控基因表達(dá)的能力。microRNA-7是一種具有抑癌作用的microRNA，在結(jié)直腸癌、乳腺癌和肺癌等腫瘤組織中顯著低表達(dá)，具有良好的評估診斷和預(yù)后的作用[3-5]。但在卵巢癌組織中尚未見文獻(xiàn)報道，本文擬檢測卵巢癌組織、癌旁組織和良性病變組織中microRNA-7的表達(dá)，并探討其與卵巢癌臨床特征之間的關(guān)系。

1材料與方法

1.1標(biāo)本來源收集本院婦科2011年1月至2012年1月經(jīng)過病理組織學(xué)確診的42例卵巢癌患者的腫瘤標(biāo)本和癌旁標(biāo)本。在取得標(biāo)本時，均未進(jìn)行手術(shù)或放化療，最終，所有納入患者均經(jīng)過術(shù)后病理學(xué)并影像學(xué)確認(rèn)。收集本院2011年1月至2012年1月經(jīng)過病理組織學(xué)確診的38例卵巢上皮囊腫組織作為良性對照組。

1.2主要試劑與儀器RNA抽提試劑盒(Qiagen，GER)，RT-PCR反應(yīng)試劑盒、dNTPMix、RNasin (TaKaRa公司)，microRNA-7的特異性莖環(huán)引物和探針(Ambion, USA)，U6B的特異性莖環(huán)引物和探針(Ambion，USA)。儀器：V 22000型紫外分光光度計(上海尤尼可儀器有限公司)，移液器(Eppendorf，GER)；低溫高速離心機(jī)購自(Beckman, USA)，7900型定量PCR儀(ABI, USA)。

1.3實驗方法

1.3.1組織標(biāo)本總RNA提取按照RNA提取試劑盒說明書提取組織中的microRNA。RNA，紫外分光光度計測RNA濃度及純度，取吸光值(A)比值為1.8～2.1的樣品用于后續(xù)試驗。

1.3.2qRT-PCR檢測microRNA-7 表達(dá)采用SYBR green法檢測microRNA-7的表達(dá)水平，選用U6snRNA作為內(nèi)參。定量PCR儀進(jìn)行qRT-PCR，將所有cDNA樣品分別配置qRT-PCR反應(yīng)體系，體系配置如下：逆轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物2 μL，10×PCR緩沖液1 μL，PCR特異引物(10 μmol·L-1)各0.4 μL，dNTP(2.5 mmol·L-1)1 μL，MgCl2溶液0.6 μL，0.5 U Taq聚合酶0.2 μL，2 ×ROX Reference Dye 0．2 μL，加水至總體積為8 μL。反應(yīng)條件：95 ℃ 3 min活化Taq聚合酶；40個PCR循環(huán)(95℃ 15 s；60 ℃ 20 s；72℃ 20 s；78℃ 20 s)。擴(kuò)增反應(yīng)結(jié)束后，并從60℃緩慢加熱到99℃。采用Primer 5．0軟件設(shè)計microRNA特異性引物。采用2-△Ct法計算組織中microRNA-7水平。△Ct=Ct(microRNA-7)-Ct(U6)，每個樣本設(shè)立3個平行管。

1.4生存期隨訪隨訪截止于2015年1月1日，采用電話隨訪，隨訪率為92.86%。總生存期從確診日期至死亡或隨訪截止日期。

1.5統(tǒng)計方法應(yīng)用SPSS14.0對實驗數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)處理。計數(shù)資料采用χ2檢驗，計量資料采用t檢驗，生存期分析采用Kaplan-Meier法，兩組生存比較為Logrank檢驗。P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2結(jié)果

2.1microRNA-7分別在卵巢癌組織、癌旁組織和良性病變組織樣本中表達(dá)情況卵巢癌組織microRNA-7表達(dá)為0.176±0.063，癌旁組織表達(dá)為0.314±0.099，良性病變組織表達(dá)為0.465±0.123。與癌旁組織和良性病變組織比較，卵巢癌組織中microRNA-7 表達(dá)顯著下降(P均<0.05)。

2.2卵巢癌組織中microRNA-7表達(dá)水平和臨床病理特征之間的關(guān)系microRNA-7在卵巢癌患者組織中的表達(dá)與年齡和病理類型無關(guān)，與臨床分期、分化程度及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有關(guān)。臨床分期為Ⅲ級、Ⅳ級的患者，microRNA-7表達(dá)水平較低；低分化程度或(和)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的microRNA-7水平降低，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0．05)。見圖1。

2.3卵巢癌患者組織microRNA-7表達(dá)水平和生存期之間的關(guān)系截止至隨訪時間，42例患者中有25例存活，全組中位總生存時間為29.9個月。microRNA-7高表達(dá)組中位總生存時間為40.5個月，明顯高于microRNA-7低表達(dá)組的22.7個月(LOGRANK檢驗P=0.02)，見圖2。

3討論

目前臨床中應(yīng)用的卵巢癌腫瘤標(biāo)志物主要包括糖類抗原125(cancer antigen 125, CA125)和人附睪蛋白4(human epididymis secretory protein 4, HE4)，二者對于卵巢癌的診斷有一定價值，但對于預(yù)測卵巢癌復(fù)發(fā)及預(yù)后存在明顯局限性。進(jìn)一步尋找能夠有效幫助卵巢癌診斷和預(yù)后判定的腫瘤標(biāo)志物具有重要意義。通過研究腫瘤組織中microRNA表達(dá)情況，從而幫助腫瘤的診斷和預(yù)后判定在很多腫瘤中已有研究。在前期研究的基礎(chǔ)上，我們發(fā)現(xiàn)microRNA-7可能同卵巢癌密切相關(guān)。microRNA-7是一個定位在人類基因組3個不同基因位點的內(nèi)含子miRNA，保守存在于在所有物種之中。研究發(fā)現(xiàn)在多種常見惡性腫瘤中miR-7均表達(dá)異常，其在惡性轉(zhuǎn)化和轉(zhuǎn)移中起著重要的作用。本研究發(fā)現(xiàn)：卵巢癌組織中microRNA-7表達(dá)顯著下降，并且同卵巢癌較晚臨床分期和轉(zhuǎn)移等不良預(yù)后因素密切相關(guān)。這一研究同既往microRNA-7在其他腫瘤病灶中表達(dá)相關(guān)研究一致，比如microRNA-7在人類乳腺癌、結(jié)直腸癌、肺癌等多種腫瘤組織中顯著低表達(dá)：有研究采用Real-time PCR技術(shù)檢測多種結(jié)直腸癌細(xì)胞系microRNA-7的表達(dá)，發(fā)現(xiàn)所有的細(xì)胞系的microRNA-7表達(dá)均明顯下調(diào)，同時發(fā)現(xiàn)結(jié)直腸癌組織中microRNA-7表達(dá)較癌旁組織顯著下調(diào)[6]。在乳腺癌組織中microRNA-7的表達(dá)較正常乳腺組織顯著下降，并且microRNA-7的表達(dá)水平同乳腺癌轉(zhuǎn)移呈負(fù)相關(guān)[4]。非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞系A(chǔ)549和 H1299中的microRNA-7表達(dá)顯著下調(diào)；同時與癌旁組織相比，非小細(xì)胞肺癌組織中的microRNA-7表達(dá)同樣下調(diào)[7]。

圖1　卵巢癌患者組織microRN-7表達(dá)和臨床病理特征的關(guān)系(*P<0．05)

圖2　microRNA-7高表達(dá)和低表達(dá)組病人的生存曲線

microRNA在生物體內(nèi)廣泛存在，在調(diào)節(jié)細(xì)胞增殖、凋亡、分化等重要過程中均發(fā)揮重要作用[6,8]，且在物種之間具有高度保守性[9]?；谏鲜鎏卣?，其在惡性腫瘤的發(fā)生、發(fā)展過程中，起到重要作用。有的發(fā)揮原癌基因的作用，有的起到抑癌基因的作用。然而microRNA主要參與轉(zhuǎn)錄后基因表達(dá)調(diào)控，即是通過不完全互補(bǔ)結(jié)合到目標(biāo)靶mRNA 3’非編碼區(qū)端，以一種未知方式誘發(fā)蛋白質(zhì)翻譯抑制，進(jìn)而抑制蛋白質(zhì)合成，阻斷mRNA的翻譯，發(fā)揮其獨特的負(fù)調(diào)控基因表達(dá)的能力。microRNA-7通過何種途徑參與卵巢癌發(fā)生、發(fā)展，至今尚未有明確結(jié)論。然而，在其他腫瘤中已經(jīng)有研究進(jìn)行了初步的探討。有研究采用生物信息學(xué)在乳腺癌組織中分析預(yù)測microRNA-7的靶基因，共有114個靶基因被預(yù)測出[4]，進(jìn)一步對這些靶基因進(jìn)行功能學(xué)分析發(fā)現(xiàn)，這些靶基因的功能與腫瘤細(xì)胞的生長、轉(zhuǎn)移等密切相關(guān)。值得注意的是，microRNA-7對腫瘤細(xì)胞的生物學(xué)效應(yīng)是通過作用于細(xì)胞內(nèi)多個靶點甚至整個信號調(diào)節(jié)網(wǎng)絡(luò)產(chǎn)生的。在研究開始過程中僅研究一個或數(shù)個靶點，但在分析其在細(xì)胞的生物學(xué)行為方面的作用時應(yīng)綜合考慮。

本研究初步發(fā)現(xiàn)microRNA-7可以有助于卵巢癌患者預(yù)后的判斷，microRNA-7在卵巢癌組織中高表達(dá)患者的生存期長于低表達(dá)者。目前在包括卵巢癌在內(nèi)的多種腫瘤組織中檢測的許多microRNA均有類似結(jié)論，比如在細(xì)胞水平microRNA-129-5p可以抑制卵巢癌細(xì)胞的生長和存活時間，起到抑癌作用[10]，microRNA-126在體內(nèi)具有抑制結(jié)腸癌細(xì)胞增殖及侵襲轉(zhuǎn)移，microRNA-19則可以促進(jìn)非小細(xì)胞肺癌的轉(zhuǎn)移，且可能是化療藥物的作用靶點。在臨床研究中，Delfino等對272例卵巢癌患者的799個microRNA進(jìn)行檢測，進(jìn)而分析其與卵巢癌患者生存期和復(fù)發(fā)的關(guān)系，發(fā)現(xiàn)3個microRNA(hsa-miR-16, hsa-miR-22*, and ebv-miR-BHRF1-2)同卵巢癌復(fù)發(fā)和生存期顯著相關(guān)[11]。microRNA-7的功能學(xué)認(rèn)識目前被基本認(rèn)為一個抑癌基因：既可以通過直接作用于重要靶基因而影響細(xì)胞黏附、遷移、侵襲、遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移以及上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化等重要生物學(xué)過程，進(jìn)而影響腫瘤的進(jìn)展；又可以通過促進(jìn)腫瘤對藥物治療的敏感性、抑制腫瘤血管生成等方面間接發(fā)揮抑癌作用。但microRNA-7在卵巢癌中的研究尚少見到[12-16]。本研究因為研究設(shè)計問題未能進(jìn)行復(fù)發(fā)情況分析。同時由于研究時間所限，本研究納入的例數(shù)較少，可能需要進(jìn)一步擴(kuò)大樣本量進(jìn)行分析。

綜上所述，卵巢癌病人組織中microRNA-7表達(dá)水平顯著下降，且其下降與不良臨床特征有關(guān)，且在卵巢癌預(yù)后評估中有一定的價值，可用于輔助卵巢癌的預(yù)后評估。

參考文獻(xiàn)：

[1]Torre LA,Bray F,Siegel RL,et al.Global cancer statistics,2012[J].CA Cancer J Clin,2015,65(2):87-108.

[2]Bacalbasa N,Balescu I,Dima S,et al.Ovarian sarcoma carries a poorer prognosis than ovarian epithelial cancer throughout all FIGO stages: a single-center case-control matched study[J].Anticancer Res,2014,34(12):7303-7308.

[3]Xu K,Chen Z,Qin C,et al.miR-7 inhibits colorectal cancer cell proliferation and induces apoptosis by targeting XRCC2[J].Onco Targets Ther,2014,20(7):325-332.

[4]Kong X,Li G,Yuan Y,et al.MicroRNA-7 inhibits epithelial-to-mesenchymal transition and metastasis of breast cancer cells via targeting FAK expression[J].PLoS One,2012,7(8):e41523.

[5]Xiong S,Zheng Y,Jiang P,et al.PA28gamma emerges as a novel functional target of tumour suppressor microRNA-7 in non-small-cell lung cancer[J].Br J Cancer,2014,110(2):353-362.

[6]Acunzo M,Romano G,Wernicke D,et al.MicroRNA and cancer- a brief overview[J]. Adv Biol Regul,2015,57:1-9.

[7]Xiong S,Zheng Y,Jiang P,et al.PA28gamma emerges as a novel functional target of tumor suppressor microRNA-7 in non-small-cell lung cancer[J]. Br J Cancer,2014,110(2):353-362.

[8]Reddy KB.MicroRNA (miRNA) in cancer[J]. Cancer Cell Int, 2015,15:38.

[9] Sempere LF.Tissue slide-based microRNA characterization of tumors:how detailed could diagnosis become for cancer medicine?[J].Expert Rev Mol Diagn,2014,14(7):853-869.

[10] Tan G,Cao X,Dai Q,et al.A novel role for microRNA-129-5p in inhibiting ovarian cancer cell proliferation and survival via direct suppression of transcriptional co-activators YAP and TAZ[J].Oncotarget,2015,6(11):8676-8686.

[11] Delfino KR,Rodriguez-Zas SL.Transcription factor-microRNA-target gene networks associated with ovarian cancer survival and recurrence[J].PLoS One,2013,8(3):e58608.

[12] Babae N,Bourajjaj M,Liu Y,et al. Systemic miRNA-7 delivery inhibits tumor angiogenesis and growth in murine xenograft glioblastoma[J].Oncotarget,2014,5(16):6687-6700.

[13] Meza-Sosa KF,Perez-Garcia EI,Camacho-Concha N,et al.MiR-7 promotes epithelial cell transformation by targeting the tumor suppressor KLF4[J].PLoS One,2014,9(9):e103987.

[14] Saydam O,Senol O,Wurdinger T,et al.miRNA-7 attenuation in Schwannoma tumors stimulates growth by upregulating three oncogenic signaling pathways[J].Cancer Res,2011,71(3):852-861.

[15] Tu CY,Chen CH,Hsia TC,et al.Trichostatin A suppresses EGFR expression through induction of microRNA-7 in an HDAC-independent manner in lapatinib-treated cells[J].Biomed Res Int,2014,2014:168949.

[16] Zhou X,Hu Y,Dai L,et al.MicroRNA-7 inhibits tumor metastasis and reverses epithelial-mesenchymal transition through AKT/ERK1/2 inactivation by targeting EGFR in epithelial ovarian cancer[J].PLoS One,2014,9(5):e96718.

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Expression and clinical significance of microRNA-7 in tissue of ovarian cancer patients

JIAO Li-min,LIANG Jin,WANG Qiong,et al

(DepartmentofGynecology,The6thPeople’sHospitalofFoshan，NanhaiDistrict,Foshan,

Guangdong528200,China)

Abstract：ObjectiveTo explore the expression of microRNA-7 in tissue of ovarian cancer patients and to analyze the relationship between microRNA-7 and clinical features. Methods We enrolled 42 ovarian cancer patients and 38 controls with benign ovarian epithelial cyst in the study. By the reverse transcription-real time polymerase chain reaction (RT-qPCR), the expression of microRNA-7 was detected in tumor tissues, paracancerous tissues and benign tissues. Results Compared with the controls, microRNA-7 in the tissues of ovarian cancer patients was significantly reduced (P<0.05). The expression of microRNA-7 in the tissues of ovarian cancer patients was not related to the age or pathological type, but to the clinical stage and metastasis (P<0.05). The patients with high microRNA-7 expression had better overall survival than the patients with low microRNA expression. Conclusion The expression of microRNA-7 in tissues of ovarian cancer patients is down regulated, which may become an important prognostic indicator for ovarian carcinoma.

Key words：ovarian carcinoma;microRNA;microRNA-7;RT-PCR

(收稿日期：2015-09-17，修回日期：2015-11-03)

doi:10.3969/j.issn.1009-6469.2016.03.025

通信作者：李紀(jì)強(qiáng)，男，副主任醫(yī)師，研究方向：microRNA在惡性腫瘤生長及轉(zhuǎn)移中的作用，E-mail:banlangen12@163.com

基金項目：國家自然科學(xué)基金(No 81503526)