張楊,邱祖明,吳順清 (荊州文物保護中心技術(shù)研究部,湖北荊州434020)吳剛珂,任貽軍許航,毛毓華(長江大學荊州臨床醫(yī)學院荊州市中心醫(yī)院檢驗醫(yī)學部,湖北荊州434020)

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湖北鳳凰山西漢古尸保存液中氨基酸含量研究

張楊,邱祖明,吳順清 (荊州文物保護中心技術(shù)研究部,湖北荊州434020)
吳剛珂,任貽軍許航,毛毓華
(長江大學荊州臨床醫(yī)學院荊州市中心醫(yī)院檢驗醫(yī)學部,湖北荊州434020)

[摘要]湖北江陵鳳凰山168號漢墓西漢古尸從出土后一直采用12.5%濃度福爾馬林液體保存,到現(xiàn)在已近40年。為了了解古尸保存狀況,采用超高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法(UPLC-MS)對尸體和內(nèi)臟保存液中的17種氨基酸含量進行了研究。結(jié)果表明:從兩種保存液中均檢測出了微量的氨基酸,氨基酸的檢出說明西漢古尸機體蛋白質(zhì)出現(xiàn)了化學降解,導致其顯微結(jié)構(gòu)出現(xiàn)了損傷,對古尸的長久保存不利。該分析結(jié)果為古尸保存液的研究和配制提供了參考。

[關(guān)鍵詞]西漢古尸；保存液；氨基酸；超高效液相色譜-質(zhì)譜儀

[引著格式]張楊,邱祖明,吳順清,等.湖北鳳凰山西漢古尸保存液中氨基酸含量研究[J].長江大學學報(自科版),2016, 13(6):7～11.

1975年6月8日,我國文物考古工作者在湖北荊州楚故都紀南城內(nèi)發(fā)掘了鳳凰山168號西漢墓。該墓葬不僅出土了一批珍貴文物,還出土了一具保存完好的西漢古尸。根據(jù)墓中的竹牘記載,死者下葬于文帝十三年,即公元前167年,距發(fā)掘出土已有2142年,是當時我國發(fā)現(xiàn)的時代最早的一具古尸。出土時古尸的整體外觀和各內(nèi)臟器官的大體形態(tài)以及軟骨、骨骼肌、結(jié)締組織等組織結(jié)構(gòu)保存完好,軟骨細胞清晰可見,結(jié)締組織膠原纖維保存著十分完好的超微形態(tài)和分子結(jié)構(gòu)[1]。

古尸從1975年出土到現(xiàn)在一直保存在自配的保存液中,當保存液由于多種原因消耗后,進行一定量的補充,使其保持在一定水平。古尸出土后,尚未對保存液中氨基酸的含量進行分析檢測,鑒于此,本研究采用超高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法(UPLC-MS)對尸體和內(nèi)臟保存液中的氨基酸含量進行了分析檢測,以便于了解古尸保存情況,為改良保存液提供依據(jù),以利于古尸長久保存。

1　材料與方法

1.1樣品

本次分析的保存液分別來源于浸泡尸體和內(nèi)臟的保存液,保存尸體的稱為尸體保存液(Corpse preservationsolution,CPS),用來浸泡內(nèi)臟的稱為內(nèi)臟保存液(Visceralpreservationsolution,VPS)。

1.2儀器和試劑

超高效液相色譜,型號:ACQUITY,產(chǎn)地:美國Waters公司；三重四極桿質(zhì)譜儀,型號:Xevo TQD,產(chǎn)地:美國Waters公司；高速冷凍離心機,型號:3K15,產(chǎn)地:德國SIGMA公司；漩渦混勻器,型號:QT-2,產(chǎn)地:上海琪特分析儀器有限公司。

甲酸,質(zhì)譜用,批號:W09011204,美國Waters公司；乙腈,色譜純,批號:1651130232,德國Merck公司；氨基酸標準品均購自于中國食品藥品檢定研究院,丙氨酸(140680-201303)、精氨酸(140685-201305)、門冬氨酸(140691-200401)、胱氨酸(140632-200502)、谷氨酸(140690-201203)、甘氨酸(140689-201103)、組氨酸(140693-201102)、異亮氨酸(140683-200401)、亮氨酸(140687-201102)、甲硫氨酸(140684-201102)、苯丙氨酸(140676-200405)、脯氨酸(140677-201206)、絲氨酸(140688-201102)、蘇氨酸(140682-200401)、色氨酸(140686-201303)、酪氨酸(140609-201212)、纈氨酸(140681-201202)；純凈水,批號:2122YC,杭州娃哈哈集團有限公司。

表1　氨基酸質(zhì)譜其他監(jiān)測條件

1.3LC-MS/MS條件

1)色譜條件 超高效液相色譜分析柱,CAPCELL PAKC18(2.0mm×100mm,5μm),產(chǎn)地:日本資深堂；流動相A:乙腈,流動相B:0.02%甲酸,梯度洗脫:0～3min,2%流動相A:98%流動相B, 3～10min,2%流動相A～5%流動相A:98%流動相B～95%流動相B,10～12min,5%流動相A～2%流動相A:95%流動相B～98%流動相B；流速:0.20mL/min；進樣體積:5μL；柱溫:20℃。

2)質(zhì)譜條件 電噴霧離子源(ESI),正離子掃描；質(zhì)譜多反應監(jiān)測(multiplereactionmonitoring, MRM)掃描分析；毛細管電壓3300V；離子源溫度350℃；霧化氣和脫溶劑氣均為氮氣,碰撞氣為氬氣；脫溶劑氣溫度150℃,流速650L/h；質(zhì)譜選擇反應監(jiān)測其他條件見表1。選取色氨酸(Try)標準溶液提取離子色譜圖見圖1。

圖1　Try標準溶液提取離子色譜圖

1.4樣品處理方法

分別吸取CPS,VPS各5mL移至帶蓋塑料離心管中,渦旋混勻2min,以15000rpm高速離心3min,吸取上清液供超高效液相色譜—質(zhì)譜進樣分析。

2　結(jié)果

2.1線性關(guān)系

將17種氨基酸混合標準溶液稀釋成0.20、0.50、1.0、2.0、5.0、10.0μmol/mL系列濃度溶液,測定后以峰面積為縱坐標,以氨基酸的濃度為橫坐標,進行線性回歸,得到線性方程和相關(guān)系數(shù),結(jié)果表明在該濃度范圍內(nèi)17種氨基酸均呈現(xiàn)良好的線性關(guān)系,同時將氨基酸標準溶液稀釋后檢測,得到各氨基酸的檢測限(見表2)。

2.2精密度

將17種氨基酸混合標準溶液稀釋成5.0、1.0、0.20μmol/mL三個濃度,依次連續(xù)進樣6次,計算各氨基酸峰面積的相對標準偏差(RSD)值,結(jié)果見表3。

2.3穩(wěn)定性

取1.0μmol/mL的17種氨基酸混合標準溶液分別在室溫條件下于0、2、4、6、12、24h進樣測定,計算RSD值,結(jié)果表明氨基酸在24h內(nèi)較穩(wěn)定(見表4)。

2.4回收率

分別配制濃度為6μmol/mL、1μmol/mL、0.3μmol/mL的氨基酸標準溶液進行回收率試驗,進樣分析6次后計算平均回收率及RSD,結(jié)果見表5～表7。

表2　17種氨基酸線性范圍

表3　17種氨基酸各濃度下精密度(n=6)

表4　17種氨基酸的穩(wěn)定性(n=6)

表5　氨基酸標準溶液(6μmol/mL)回收率

2.5檢測結(jié)果

本次樣品檢測各氨基酸濃度見表8。

3　討論

3.1檢測方法學的評估

1958年,Spackman等[1]用陽離子交換色譜與柱后茚三酮衍生結(jié)合的方法分析蛋白質(zhì)中的氨基酸,氨基酸的分析實現(xiàn)了自動化。此后氨基酸分析的許多新方法相繼得到應用[2],目前普遍采用離子色譜法[3,4]、高效液相色譜法[5,6]、液相色譜—質(zhì)譜法等[7,8]。UPLC保持了高效液相色譜的基本原理,其理論依據(jù)于VanDeemter經(jīng)驗方程[9],隨色譜柱中裝填固定相粒度的減小,色譜柱的理論塔板高度也小,色譜柱的柱效越高,并可獲得更寬的線速度范圍,達到分離分析的高速、高效和高靈敏度。為此, UPLC在技術(shù)上實現(xiàn)了各個關(guān)鍵環(huán)節(jié)系統(tǒng)性的優(yōu)化創(chuàng)新和組合[10]。UPLC-MS技術(shù)是目前用于定量檢測氨基酸最好的質(zhì)譜技術(shù),根據(jù)氨基酸母離子質(zhì)量數(shù)與碎片離子質(zhì)量數(shù),選擇母粒子—子離子對,允許符合要求的子離子進入碰撞室,碰撞結(jié)束后,只記錄設(shè)定子離子信號,通過母粒子與子離子的兩次選擇,去除干擾離子,降低化學背景,提高靈敏度。在分析化學領(lǐng)域,這種質(zhì)譜掃描模式已成熟運用于復雜體系的小分子化合物分析[11]。

表6　氨基酸標準(1μmol/mL)溶液回收率

表7　氨基酸標準溶液(0.3μmol/mL)回收率

流動相的選擇分別考察了以0.2%、0.1%、0.05%、0.02%甲酸與乙腈配比作為流動相,結(jié)果發(fā)現(xiàn)各氨基酸峰面積差別不大,隨著甲酸濃度的降低,各氨基酸的保留時間提前,故甲酸的濃度選擇為0.02%。在考察流動相比例時,先用0.02%甲酸乙腈(96∶4)時發(fā)現(xiàn)Phe與Try保留時間較長,出峰時間較晚,經(jīng)反復試驗選用實驗中的梯度洗脫方法,各氨基酸峰形較好、保留時間適合。

表8　各氨基酸檢測結(jié)果

17種氨基酸標準品在所選擇的條件下完全分離,峰型比較對稱,干擾也小,說明在此條件下各氨基酸能夠得到很好的分離,對處于相同條件下的CPS、VPS也能得到理想的結(jié)果。表2～5顯示17種氨基酸濃度與峰面積呈良好的線性關(guān)系,線性范圍0.2～10μmol/mL,最小檢出限為0.005～0.5μmol/mL,相關(guān)系數(shù)均在0.998以上,精密度RSD (5.0μmol/mL)在0.71%～3.98%之間,回收率(6.0μmol/mL)在90.63～102.93%之間,氨基酸在24h內(nèi)較穩(wěn)定。此法具有操作簡便易行、準確度高、重現(xiàn)性好等優(yōu)點。

人體內(nèi)所有蛋白質(zhì)都是由20種氨基酸組成的多聚體,由于本次購買的氨基酸標準品只有17種,所以提供17種氨基酸檢測數(shù)據(jù)。

3.2氨基酸的含量探討

蛋白質(zhì)是生命活動的基礎(chǔ),其分子組成有一定的規(guī)律性,氨基酸是構(gòu)成蛋白質(zhì)的基本單位,是生物體的基本組成成分之一,也是生物體中含量最豐富的生物大分子[12]。氨基酸具有堿性的α-氨基和酸性的α-羧基,可在酸性溶液中與質(zhì)子(H+)結(jié)合呈帶正電荷的陽離子(—NH3+),也可在堿性溶液中與OH—結(jié)合,失去質(zhì)子變成帶負電荷的陰離子(—COO—),具有兩性解離的特性[12]。氨基酸的解離方式取決于其所處溶液的酸堿度[12]。從表6.檢測結(jié)果可看出,CPS和VPS檢出濃度最高的2種均是Ala、Asp,均未檢出的有7種分別是Cys、His、Met、Pro、Ser、Try、Tyr,在VPS中另有3種未檢出,分別是Lle、Leu和Val,未能檢出,表明其含量極微或在檢測線以下甚至是沒有。以上結(jié)果表明組織中的氨基酸在目前的條件下不被溶出或溶出量極少,CPS和VPS分別對尸體和內(nèi)臟起到了較好的保護作用。

童建斌等通過對保存液pH值對馬王堆古尸蛋白質(zhì)保存的影響的研究,結(jié)果發(fā)現(xiàn)保存液pH值的適當提高有助于降低保存液中總氮量和氨基酸含量,有利于古尸蛋白質(zhì)的保存[13]。筆者認為,氨基酸具有兩性解離的特性,本次檢測的17種氨基酸有非極性脂肪族氨基酸如Gly,等電點5.97；極性中性氨基酸如Ser,等電點5.68；芳香族氨基酸如Try,等電點5.89,酸性氨基酸如Asp,等電點2.77；堿性氨基酸如Arg,等電點10.76,無論如何改變保存液的pH,都會偏離部分氨基酸的等電點,從而會導致其解離。我們對CPS和VPS的pH進行了測定,分別為5.35和3.85,其中CPS的pH與其推薦使用的最適pH相近,VPS的pH是否需要調(diào)整還有待商榷。張軼霽等用相近方法對血清中20種游離氨基酸含量進行了測定,認為該方法與傳統(tǒng)的衍生化氨基酸分析方法相比,具有無需衍生,操作簡便,干擾因素少、分析時間短,使用樣本量小等特點,線性范圍適宜、精密度好、準確度高、靈敏及穩(wěn)定性好等優(yōu)點[14]。王一紅等利用液相色譜—質(zhì)譜/質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)分析18種游離氨基酸后,認為直接測定樣品中游離氨基酸,分析速度快,靈敏度高,定性和定量準確,適合各種樣品中游離氨基酸的測定[15]。

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[編輯] 一凡

[作者簡介]張楊(1970—),男,副研究館員,碩士,現(xiàn)主要從事皮質(zhì)文物保護技術(shù)研究;通信作者:吳順清, wsqdx2@263.net。

[基金項目]國家科技支撐計劃資助項目(2012BAK14B00)。

[收稿日期]2015—12—16

[中圖分類號]R446

[文獻標志碼]A

[文章編號]1673—1409(2016)—04—0007—05