張長風　張玉琴　余利巖　李淑英

中國醫(yī)學科學院北京協(xié)和醫(yī)學院醫(yī)藥生物技術研究所　北京　100150；①華北理工大學基礎醫(yī)學院

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小月菌屬放線菌分離鑒定程序及生物學特性分析

張長風張玉琴余利巖李淑英①

中國醫(yī)學科學院北京協(xié)和醫(yī)學院醫(yī)藥生物技術研究所北京100150；①華北理工大學基礎醫(yī)學院

[摘要]①目的探討小月菌屬放線菌的生物多樣性，更好地開發(fā)利用放線菌的次級代謝產(chǎn)物及新型藥物的研制。②方法通過對培養(yǎng)特性、形態(tài)特征、生理生化反應、細胞化學組分、系統(tǒng)發(fā)育等方面的分析，對小月菌屬放線菌分離鑒定程序加以歸納，探討其生物學特性。③結果該菌屬形成圓形凸起、表面光滑、無光澤菌落；革蘭陽性菌；胞壁肽聚糖的主要二氨基庚二酸均為meso-DAP和LL-DAP，主要的甲基萘醌均為MK-9(H4)。④結論小月菌屬與近緣屬相關菌構建的系統(tǒng)進化樹上形成獨立的分枝。

[關鍵詞]小月菌屬放線菌分離鑒定

小月菌屬(Microlunatus)是具有磷酸鹽降解潛力的放線菌，并含有生物次級代謝產(chǎn)物合成的部分關鍵酶基因，是基因工程生物合成的新基因材料及新的化學藥物生產(chǎn)的基本原料[1]。為進一步了解小月菌屬放線菌的生物多樣性，更好地開發(fā)利用小月菌屬放線菌天然產(chǎn)物資源，本文從培養(yǎng)特性、形態(tài)特征、生理生化反應、細胞化學組分、系統(tǒng)發(fā)育等方面對小月菌屬放線菌的分離鑒定程序加以歸納，并探討其生物學特性，以便今后能夠更有效地分離發(fā)現(xiàn)更多新型菌株，從而為新型生物基因材料及藥物的開發(fā)奠定基礎。

1材料與方法

1.1材料

1.1.1菌株來源。巖洞土壤[2]、種植高麗參的土壤[3]、紅豆杉的根際土[4]、海蓮樹皮[5]、食用菌的土壤[6]、室內(nèi)的墻體中[7]及海洋沉積物[1]等不同環(huán)境。

1.1.2分離培養(yǎng)基。常用高氏培養(yǎng)基。

1.1.3形態(tài)及培養(yǎng)特性觀察。常用普通光學顯微鏡及電子顯微鏡觀察；用ISP2、ISP3、ISP4、ISP5、察氏瓊脂培養(yǎng)基、馬鈴薯浸汁瓊脂培養(yǎng)基及營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基進行培養(yǎng)特性觀察。

1.1.4生理生化反應。主要包括pH、鹽濃度、溫度耐受、全細胞水解物糖。

1.1.5細胞化學組分分析。甲基萘醌成分、細胞壁肽聚糖成分、磷酸類脂的組成成分、主要脂肪酸的分析及細胞DNA G+C含量分析。

1.1.6系統(tǒng)進化方面分析。提取基因組DNA，進行16S rRNA基因序列擴增，然后在GenBank中Blast進行基因比對，應用MEGA軟件中的鄰接法分析，建立系統(tǒng)進化樹。

2結果

2.1培養(yǎng)特性菌落直徑一般在0.5～2.0mm范圍內(nèi)、圓形凸起、表面光滑、無光澤，淡黃色(或白色)[4]。

2.2形態(tài)特征細胞形態(tài)為半球形(0.8～2.0μm)，并且以單一、成對或成簇的形式存在。處于穩(wěn)定生長期的成對細胞在細胞結合處共用同一細胞壁結構。細胞無運動能力，不形成孢子，革蘭染色陽性[2]。

2.3生理生化反應特性代謝類型為化能異養(yǎng)，以糖和糖醇作為底物的嚴格好氧菌，生長速率緩慢。不耐酸，適宜生長的pH值范圍為5～9；嗜中溫溫度范圍20℃～30℃；無NaCl耐受能力，報道的部分菌株全細胞水解物糖包括：阿拉伯糖(arabinose)、半乳糖(galactose)、鼠李糖(rhamnose)、葡萄糖(glucose)[3,4,7]。

2.4細胞化學組分分析小月菌屬主要化學成分甲基萘醌為MK-9(H4)，胞壁I型，部分菌株含有少量(<10%)MK-8(H4)；胞壁肽聚糖的主要二氨基庚二酸是LL-DAP，肽聚糖中的氨基酸還有丙氨酸(Ala)、甘氨酸(Gly)、谷氨酸(Glutamic)，胞壁肽聚糖類型為A3γ’，其中M.phosphovoms和M.soli的肽橋只包含一個甘氨酸；磷酸類脂主要包括雙磷脂酰甘油(DPG)、磷脂酰甘油(PG)和磷脂酰肌醇(PI)；主要的脂肪酸為anteiso-C15:0，iso-C15：0和iso-C16:0，小月菌屬DNA的G+C含量范圍為65.1～70.9moL%[3～5,7]。

表1　小月菌屬及相關菌屬的分類學特征

注：ND，無數(shù)據(jù)；PG，磷脂酰甘油；DPG，雙磷脂酰甘油；PI，磷脂酰肌醇；GL，未定糖脂；PL，未定磷脂。

2.5系統(tǒng)進化分析小月菌屬各個種之間的序列相似性都在96%以上；在丙酸桿菌科相關菌株的16S rRNA基因序列構建的系統(tǒng)進化樹中形成一個穩(wěn)定的分枝[2～4]。其他相關屬與小月菌屬的生物學特征如表1所示。小月菌屬于丙酸桿菌科，丙酸桿菌科16S rRNA的特征核苷酸包括：688:699(G-C),701(C),823:877(G-C)和1060:1197(U-A)[7～9]。在基于16S rRNA基因序列構建的系統(tǒng)進化樹上，小月菌屬與弗萊德門菌屬(Friedmanniella)、微白霜菌屬(Micropruina)及產(chǎn)丙酸單胞菌屬(Propionicimonas)等[8～10]為鄰(如圖1)；但小月菌屬與近緣屬相關菌株構建的系統(tǒng)進化樹上形成獨立的分枝。

3討論

近年來，隨著不同生理環(huán)境的微生物資源開發(fā)利用，越來越多的小月菌屬也在更廣闊的生物環(huán)境中被發(fā)現(xiàn)：海洋環(huán)境[1]、巖洞土壤[2]、種植高麗參的土壤[3]、紅豆杉的根際土[4]、海蓮樹皮[5]、食用菌的土壤[6]及室內(nèi)的墻體中[7]等。小月菌屬的分離鑒定是通過經(jīng)典分類學方法確定的，如：表型特征、形態(tài)特征、化學分類特征、分子分類學(如：16S rRNA基因序列比對)等生物學特性方法。

圖1　基于丙酸桿菌科菌株的165rRNA基因序列構建的系統(tǒng)進化樹

新的物種放線菌的獲得是獲得新型次級代謝產(chǎn)物(即獲得新的生物資源)的重要前提之一；目前，小月菌屬的獲得主要是基于16SRNA序列分析及其生物學特性分析。隨著大規(guī)模測序技術的發(fā)展，已經(jīng)完成了864株放線菌株的全基因組序列分析，基于基因組學創(chuàng)立的“基因組系統(tǒng)發(fā)育學”將為新的小月菌屬放線菌的發(fā)現(xiàn)提供科學依據(jù)。隨著應用技術的發(fā)展和分類鑒定方法的擴充，越來越多的小月菌屬將被分離、發(fā)現(xiàn)；同時，也為小月菌屬的實際應用奠定基礎。

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(張愛國編輯)

Procedures of isolation & identification and analysis of biological characteristic for genus microlunatus actinomyces

ZHANGChangfeng，ZHANGYuqin,YULiyan，et

al(InstituteofMedicinalBiotechnology,ChineseAcademyofMedicalSciencesandPekingUnionMedicalCollege,Beijing100050,China)

[ABSTRACT]ObjectiveIn order to further understand biodiversity of the genus microlunatus actinomyces,exploitate the secondary metabolites,and develop new drugs.MethodsThe procedures of isolation and identification were summarized,and the biological characteristic were analysed by analysis of cultivating characteristics,morphological characteristics,physiological and biochemical reaction,cell composition and phylogenyetic.ResultsCulture features results showed that the genus microlunatus formed colonies with round convex,smooth of surface,without burnish and Gram positive.meso-DAP and LL-DAP were peptidoglycan composition of the cell wall, MK-9(H4) was as the predominant menaquinone.ConclusionGenus microlunatus actinomyces established an independent branch in neighbour-joining phylogenetic evolutionary tree with related relatives system.

[KEYWORDS]Microlunatus. Actinomycetes. Isolation. Identification

[中圖分類號]Q 939

[文獻標識碼]A

[文章編號]2095-2694(2016)02-85-03

【通訊作者】李淑英。

【作者簡介】張長風(1990-)，男，碩士研究生。研究方向：微生物學。

【基金項目】河北省留學人員科技活動擇優(yōu)資助項目(編號:C20140059)。