何　偉　陳　歡　陳衛(wèi)民

湖北職業(yè)技術(shù)學(xué)院醫(yī)學(xué)院　湖北孝感　432000；①華中科技大學(xué)同濟(jì)醫(yī)院

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Cyclin D1、Ki-67在口腔黏膜白斑和口腔鱗癌中的表達(dá)

何偉陳歡陳衛(wèi)民①

湖北職業(yè)技術(shù)學(xué)院醫(yī)學(xué)院湖北孝感432000；①華中科技大學(xué)同濟(jì)醫(yī)院

[摘要]①目的探討Cyclin D1、Ki-67在口腔黏膜白斑和口腔鱗癌中的表達(dá)及意義。②方法免疫組化SP法檢測(cè)10例正?？谇火つぁ?2例上皮單純?cè)錾责つぐ装摺?3例上皮不典型增生性白斑、42例口腔鱗癌組織中的Cyclin D1、Ki-67蛋白表達(dá)情況，使用SPSS 17.0 軟件包對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理。③結(jié)果Cyclin D1在上皮不典型增生性白斑和口腔鱗癌蛋白陽(yáng)性表達(dá)率為39.1%、42.9%，顯著高于上皮單純?cè)錾园装?(16.7%)和正?？谇火つ?10.0%)，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；Ki-67在上皮不典型增生性白斑和口腔鱗癌蛋白陽(yáng)性表達(dá)率為78.3%、90.5%，顯著高于上皮單純?cè)錾园装?41.7%)和正?？谇火つ?30.0%)，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；Cyclin D1在口腔鱗癌中的表達(dá)與腫瘤分化程度及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有關(guān)(P<0.05)，與臨床分期無關(guān)(P>0.05)，Ki-67在口腔鱗癌中的表達(dá)與腫瘤分化程度、臨床分期及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移均有關(guān)(P<0.05)；Cyclin D1與Ki-67在口腔鱗癌組織中的表達(dá)呈正相關(guān)。④結(jié)論Cyclin D1、Ki-67在上皮不典型增生性白斑和口腔鱗癌中的高表達(dá)提示二者在口腔黏膜白斑的癌變和口腔鱗癌的發(fā)生發(fā)展中起重要作用。

[關(guān)鍵詞]Cyclin D1Ki67口腔黏膜白斑口腔鱗癌

口腔黏膜白斑(Oral Leukoplakia，OLK)好發(fā)于中老年男性，上皮組織增生是其主要病理特點(diǎn)，是口腔黏膜最常見的癌前病變，約有3%～5%的白斑會(huì)發(fā)展為口腔鱗癌[1](Oral squamous cell cancer,OSCC)。OSCC是口腔頜面部最常見的惡性腫瘤。Cyclin D1是較早發(fā)現(xiàn)的原癌基因，主要影響細(xì)胞周期調(diào)控，可促進(jìn)細(xì)胞周期G1-S期的轉(zhuǎn)換，使細(xì)胞增殖。Ki-67是反映組織增殖活性的核抗原，其異常表達(dá)見于很多惡性腫瘤報(bào)道，但在OLK和OSCC中的表達(dá)情況報(bào)道還不多。本研究采用免疫組化SP法對(duì)OLK和OSCC組織中Cyclin D1和p27蛋白表達(dá)進(jìn)行檢測(cè)，旨在探討OLK的癌變機(jī)制和Cyclin D1、Ki-67在OSCC發(fā)生、發(fā)展中的作用及臨床意義。

1資料與方法

1.1臨床資料所有標(biāo)本均來自華中科技大學(xué)同濟(jì)醫(yī)院病理科存檔的蠟塊。OLK標(biāo)本35例，其中12例上皮單純?cè)錾园装摺?3例上皮不典型增生性白斑；不同病理分級(jí)的OSCC標(biāo)本42例，所有OSCC患者術(shù)前均無放化療史，術(shù)后經(jīng)過病理科確診。42例OSCC標(biāo)本按病理組織分化程度分為高～中分化28例，低分化14例；臨床分期T1～T2期20例，T3～T4期22例；伴頸淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移24例，無轉(zhuǎn)移18例。取口腔整形手術(shù)中的10例正?？谇火つぷ鳛檎?duì)照?；颊吣挲g52～76歲，中位年齡61歲。

1.2主要試劑與方法鼠抗人Cyclin D1單克隆抗體、鼠抗人Ki-67核抗原單克隆抗體、即用型SP超敏試劑盒、DAB顯色劑、PBS緩沖液、防脫片劑等購(gòu)自武漢博士德生物科技公司。標(biāo)本經(jīng)4%甲醛固定，石蠟包埋，4μm厚連續(xù)切片3張，石蠟切片采用高壓修復(fù)抗原，免疫組化SP法染色，操作步驟按SP試劑盒說明書進(jìn)行，DAB顯色，所有染色均設(shè)陽(yáng)性及陰性對(duì)照。

1.3結(jié)果評(píng)定由2名高級(jí)職稱的病理醫(yī)師盲法閱片，在200倍光鏡下隨機(jī)選取5個(gè)背景和染色清楚的部位進(jìn)行圖像分析，計(jì)數(shù)100個(gè)細(xì)胞，取其平均值。按照Cyclin D1和Ki-67陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)占視野中總細(xì)胞數(shù)的百分比計(jì)數(shù)。Cyclin D1和Ki-67蛋白染色陽(yáng)性信號(hào)均為細(xì)胞核出現(xiàn)棕黃色顆粒狀著色為標(biāo)準(zhǔn)，著色細(xì)胞數(shù)量≤10%為陰性(-)；著色細(xì)胞數(shù)量>10%為陽(yáng)性(+)。

1.4統(tǒng)計(jì)學(xué)處理采用SPSS 17.0軟件包進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行t檢驗(yàn)、χ2檢驗(yàn)、Spearman等級(jí)相關(guān)分析，P<0.05認(rèn)為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2結(jié)果

2.1Cyclin D1、Ki-67蛋白在不同組織類型中的表達(dá)情況Cyclin D1、Ki-67蛋白均陽(yáng)性表達(dá)于細(xì)胞核，正?？谇火つそM織中Cyclin D1、Ki-67陽(yáng)性表達(dá)于上皮基底層；上皮單純?cè)錾园装咧械腃yclin D1、Ki-67陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)量增多，漸向基底上層陽(yáng)性表達(dá)；上皮不典型增生性白斑中Cyclin D1、Ki-67陽(yáng)性表達(dá)從基底層向表層推移；鱗癌組織中Cyclin D1、Ki-67陽(yáng)性細(xì)胞分布于癌巢周圍，散在分布于全層，見圖1、2、3、4、5、6。

圖1正常口腔黏膜中Cyclin D1蛋白的表達(dá) (SP×200)

圖2上皮不典型增生性白斑Cyclin D1蛋白的表達(dá) (SP×200)

圖3口腔鱗癌中Cyclin D1蛋白的表達(dá) (SP×200)

圖4正?？谇火つぶ蠯i-67蛋白的表達(dá) (SP×200)

圖5上皮不典型增生性白斑Ki-67蛋白的表達(dá) (SP×200)

圖6口腔鱗癌中Ki-67蛋白的表達(dá) (SP×200)

2.2Cyclin D1、Ki-67蛋白陽(yáng)性表達(dá)口腔鱗癌和上皮不典型增生性白斑中Cyclin D1、Ki-67陽(yáng)性率均明顯高于正?？谇火つそM、上皮單純?cè)錾园装呓M，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，上皮不典型增生性白斑組高于上皮單純?cè)錾园装撸町愑薪y(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；口腔鱗癌組高于上皮不典型增生性白斑組、上皮單純?cè)錾园装呓M高于正?？谇火つそM，但差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；見表1。

2.3Cyclin D1、Ki-67蛋白表達(dá)與OSCC的臨床病理參數(shù)關(guān)系Cyclin D1蛋白在OSCC中的表達(dá)與腫瘤的分化程度、有無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有關(guān)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，與腫瘤的臨床分期無關(guān)，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；Ki-67蛋白在OSCC中的表達(dá)與腫瘤的分化程度、臨床分期、有無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有關(guān)，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見表2。

表1　Cyclin D1、Ki-67蛋白在不同組織類型中的表達(dá)

注：與正?？谇火つそM、上皮單純?cè)錾园装呓M比較，△P<0.05；上皮不典型增生性白斑組與上皮單純?cè)錾园装呓M比較，*P<0.05

表2　Cyclin D1、Ki-67蛋白表達(dá)與OSCC臨床病理參數(shù)關(guān)系

2.4CyclinD1與Ki-67在OSCC中表達(dá)的相關(guān)性在OSCC組中，CyclinD1、Ki-67蛋白表達(dá)均陽(yáng)性者17例，均陰性者1例；CyclinD1蛋白表達(dá)陽(yáng)性，Ki-67蛋白表達(dá)陰性者1例；CyclinD1蛋白表達(dá)陰性，Ki-67蛋白表達(dá)陽(yáng)性者12例。經(jīng)Spearman等級(jí)相關(guān)統(tǒng)計(jì)分析，在OSCC中CyclinD1與Ki-67的表達(dá)呈正相關(guān)。

3討論

OLK組織病理學(xué)上分為上皮單純性增生和上皮不典型增生，上皮不典型增生是較常見的癌前病變，易發(fā)展成為OSCC，趙今等報(bào)道上皮異常增生患者癌變率為21.67%[2]。OSCC的預(yù)后較差，5年生存率不足60%[3]。口腔黏膜從正常組織發(fā)展到OLK、OSCC是多因素造成的，其病理過程是多階段、多步驟的連續(xù)過程，細(xì)胞增殖正向調(diào)控因子的增強(qiáng)和細(xì)胞增殖負(fù)向調(diào)控因子的減弱與此過程有關(guān)。

Cyclin D1是重要的細(xì)胞周期調(diào)控蛋白，主要調(diào)控細(xì)胞周期G1期，是一種重要的原癌基因，其過度表達(dá)已在多種惡性腫瘤中有報(bào)道[4～7]，在細(xì)胞周期中Cyclin D1與CDK4和CDK6形成復(fù)合體，導(dǎo)致Rb蛋白磷酸化，促進(jìn)G1/S期轉(zhuǎn)移，在這個(gè)過程中致癌因子與Cyclin D1相互作用使細(xì)胞分裂生長(zhǎng)失控以致癌變，當(dāng)Cyclin D1蛋白高表達(dá)時(shí)，提示細(xì)胞有可能異常增殖甚至癌變。本組資料顯示，Cyclin D1作為一種原癌基因，在正常組織、上皮單純性增生白斑、上皮不典型增生白斑、OSCC表達(dá)率分別為10.0%、16.7%、39.1%、42.9%呈逐漸升高趨勢(shì)，提示Cyclin D1可能在OLK的癌變中起了一定的作用。Cyclin D1的高表達(dá)是OSCC的重要分子事件，本研究發(fā)現(xiàn)Cyclin D1的高表達(dá)與患者的腫瘤部位、臨床分期等因素?zé)o關(guān)，但與細(xì)胞的分化程度、淋巴結(jié)的轉(zhuǎn)移有明顯的相關(guān)性，低分化組Cyclin D1蛋白陽(yáng)性表達(dá)率明顯高于高中分化組，轉(zhuǎn)移組明顯高于未轉(zhuǎn)移組，提示Cyclin D1可能在OSCC發(fā)展中起重要作用。

Ki-67是目前應(yīng)用較多的增殖細(xì)胞標(biāo)記物，除了Go期不表達(dá)，Ki-67在細(xì)胞繁殖的每個(gè)階段都有表達(dá)，細(xì)胞有絲分裂后Ki-67丟失抗原決定簇，迅速降解，其半衰期較短，檢測(cè)結(jié)果可靠，可較好地反映細(xì)胞的增殖活性。Ki-67在乳腺癌、食管鱗狀細(xì)胞癌、陰莖鱗狀細(xì)胞癌等惡性腫瘤中的高表達(dá)均有報(bào)道[8～10]，Ki-67高表達(dá)對(duì)腫瘤的擴(kuò)散轉(zhuǎn)移及預(yù)后有重要影響，本組資料顯示，在口腔正常黏膜、單純性增生白斑、上皮不典型增生白斑、OSCC組織中Ki-67陽(yáng)性表達(dá)率分別為30.0%、41.7%、78.3%、90.5%，陽(yáng)性表達(dá)呈逐漸升高趨勢(shì)，本研究發(fā)現(xiàn)，Ki-67蛋白在OSCC中的表達(dá)與腫瘤的分化程度、臨床分期、有無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有關(guān)，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，說明以上因素可能影響Ki-67在腫瘤組織中的表達(dá)，因此Ki-67抗原的檢測(cè)對(duì)于判斷OSCC的臨床性質(zhì)及預(yù)后具有一定的參考價(jià)值，為合理制訂臨床治療計(jì)劃提供了依據(jù)，本組資料顯示，Cyclin D1和Ki-67蛋白在OSCC中的表達(dá)呈正相關(guān)，說明二者在OSCC發(fā)生發(fā)展過程相互影響，協(xié)調(diào)作用。

綜上所述，Cyclin D1、Ki-67在中老年人口腔黏膜組織中的高表達(dá)提示患者有口腔癌前病變及轉(zhuǎn)化為OSCC的可能性，應(yīng)提高警惕，密切隨訪；在OSCC組織中聯(lián)合檢測(cè)Cyclin D1、Ki-67蛋白有助于了解OSCC的生物學(xué)行為，可以為患者早期診斷和干預(yù)治療提供分子生物學(xué)支持。

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(岳靜玲編輯)

Expression and significance of cyclin D1 and Ki-67 in oral leukoplakia and oral squamous cell carcinoma

HEWei，CHENHuan，CHENWeimin

(DepartmentofStomatology,HubeiVocationalandTechnicalCollege,HubeiXiaogan432000,China)

[ABSTRACT]ObjectiveTo study the expression and significance of cyclin D1and Ki-67 in oral leukoplakia and oral squamous cell carcinoma.MethodsImmunohistochemistry of SP method was used to detect the expression of 10 cases of normal oral mucosa,12 cases of simple epithelial hyperplasia type leukoplakia,23 cases of atypical epithelial proliferative leukoplakia,42 cases of oral squamous cell carcinoma of cyclin D1 and Ki-67 protein expression,using SPSS 17.0 software package was used for data processing.ResultsCyclin D1 in epithelial dysplasia leukoplakia and oral squamous cell carcinoma positive expression rate was 39.1%,42.9%,it was significantly higher than that of simple hyperplastic leukoplakia(16.7%) and normal oral mucosa(10%),the difference was statistically significant(P<0.05);Ki-67 in epithelial dysplasia and oral squamous cell carcinoma of white spot protein positive expression rate was 78.3%,90.5%,it was significantly higher than that of simple hyperplastic leukoplakia(41.7%) and normal oral mucosa(30%),the difference was statistically significant(P<0.05);Cyclin D1 in oral squamous cell carcinoma and the expression of tumor differentiation and lymph node metastasis(P<0.05),but not with clinical stage(P>0.05),Ki-67 in oral squamous cell carcinoma and the expression of the degree of tumor differentiation,clinical stage and lymph node metastasis(P<0.05);Cyclin D1 and K-i 67 in oral squamous cell carcinoma was positively correlated.Conclusion the high expression of cyclin D1 and Ki-67 in epithelial dysplasia leukoplakia and oral squamous cell carcinoma,which suggests that the two plays an important role in the development of oral leukoplakia and oral squamous cell carcinoma.

[KEYWORDS]Cyclin D1.Ki-67.Oral leukoplakia.Oral squamous cell carcinoma

[中圖分類號(hào)]R 739.8

[文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼]A

[文章編號(hào)]2095-2694(2016)02-139-04

【通訊作者】陳衛(wèi)民。

【作者簡(jiǎn)介】何偉(1971-)，男，醫(yī)學(xué)碩士，副教授、副主任醫(yī)師。研究方向：口腔頜面腫瘤。