范榮莉，蔣　濤，艾　鳳，方　旭，王俊程，龔正清，車傳燕

(安徽科技學(xué)院　動物科學(xué)學(xué)院，安徽　鳳陽　233100)

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利巴韋林對小鼠生長發(fā)育和小腸組織形態(tài)結(jié)構(gòu)的影響

范榮莉，蔣濤，艾鳳，方旭，王俊程，龔正清，車傳燕*

(安徽科技學(xué)院動物科學(xué)學(xué)院，安徽鳳陽233100)

摘要：目的：研究不同劑量的利巴韋林對小鼠生長發(fā)育和小腸組織形態(tài)結(jié)構(gòu)的影響。方法：30只1月齡小鼠隨機(jī)分為3組，對照組灌胃生理鹽水，低、高劑量利巴韋林組分別按照5mg/kg、10mg/kg體重灌胃藥物，連續(xù)用藥14d，每周清晨稱重，采集血液和組織樣品。結(jié)果：利巴韋林能夠提高小鼠日增重，且低劑量用藥7d的促生長效果明顯(P<0.05)。給藥14d后，低劑量組脾臟指數(shù)比高劑量組顯著增加 (P<0.05)。與對照組相比，高、低劑量利巴韋林組紅細(xì)胞數(shù)下降，白細(xì)胞總數(shù)增加，中性粒細(xì)胞數(shù)量極顯著降低(P<0.01)，淋巴細(xì)胞數(shù)量極顯著升高(P<0.01) ，低劑量組白細(xì)胞總數(shù)極顯著增加(P<0.01)。高劑量利巴韋林破壞了小腸黏膜上皮形態(tài)結(jié)構(gòu)，抑制了小腸絨毛發(fā)育；而低劑量利巴韋林能夠提高小腸絨毛長度、隱窩深度、十二指腸絨毛長度和隱窩深度比值，增強(qiáng)小腸功能的發(fā)揮。結(jié)論：利巴韋林具有促進(jìn)機(jī)體生長發(fā)育和調(diào)節(jié)免疫功能的作用，但隨著添加劑量的增加，利巴韋林的促生長和免疫增強(qiáng)效果減弱。在臨床應(yīng)用上，應(yīng)注意根據(jù)不同的個體來確定利巴韋林的適宜添加劑量和合理應(yīng)用時間。

關(guān)鍵詞：利巴韋林；生長發(fā)育；血液生理指標(biāo) ；組織形態(tài)

利巴韋林為鳥苷類化合物，對RNA病毒和DNA病毒具有廣譜抗病毒活性，臨床上常用于治療甲乙型流感病毒、丙型肝炎、輪狀病毒、乙腦病毒、皰疹病毒、流行性出血熱等[1-3]。在畜禽生產(chǎn)中利巴韋林曾被用于治療豬流行性感冒、豬傳染性胃腸炎、雞痘等病毒性傳染病[4]。近年來，隨著畜禽養(yǎng)殖規(guī)模擴(kuò)大，多種因素造成的病毒性傳染病發(fā)病率增加，致使利巴韋林、金剛烷胺等違禁的抗病毒藥物在畜禽生產(chǎn)中仍有違規(guī)使用[5]。此外，調(diào)查顯示利巴韋林在嬰幼兒病毒性疾病的治療中應(yīng)用較多[6]，但利巴韋林的不合理應(yīng)用造成人類和畜禽中毒事件仍時有發(fā)生[7]。因此，利巴韋林的合理應(yīng)用是有效發(fā)揮其抗病毒功效的重要前提。

大量研究表明利巴韋林長期或過量使用可引起血液中白細(xì)胞減少和貧血等不良反應(yīng)[8]，但利巴韋林對機(jī)體生長發(fā)育和小腸組織形態(tài)影響的報道較少。因此，本研究擬通過研究利巴韋林對小鼠日增重、器官指數(shù)、血液生理指標(biāo)以及小腸組織形態(tài)結(jié)構(gòu)的影響，系統(tǒng)地分析口服不同劑量的利巴韋林對機(jī)體健康狀況的影響，為利巴韋林在臨床上的合理應(yīng)用提供科研理論依據(jù)。

1材料與方法

1.1試驗(yàn)材料

30只1月齡清潔級小鼠,購自南京市江寧區(qū)青龍山動物繁殖場，飼養(yǎng)于動物科學(xué)學(xué)院動物房；利巴韋林粉(購自濟(jì)南新瑞宏經(jīng)貿(mào)有限公司)，瑞氏染色液(購自北京雷根生物技術(shù)有限公司)，肝素鈉、枸櫞酸鈉、甲基紅、結(jié)晶紫、多聚甲醛等生化試劑(均購自安徽博美特生物科技有限公司)；切片機(jī)(德國Leica RM2235)，顯微成像系統(tǒng)(OLYMPUS-CH30)，電子天平(YP-600)，電子分析天平(FA-1004N)，恒溫箱(GHP-9050)，烘干箱(CX-GF-b)，微量移液器(Eppendorf)等。

1.2試驗(yàn)設(shè)計(jì)

1.2.1動物飼養(yǎng)小鼠適應(yīng)性飼養(yǎng)7d后，根據(jù)性別和體重隨機(jī)分為三組，每組10只。空白對照組按照0.5mL/只灌服生理鹽水，高劑量、低劑量利巴韋林組的用藥劑量分別為5mg/kg、10mg/kg體重。連續(xù)灌胃14d，于用藥后第7d、14d清晨進(jìn)行空腹稱重。

1.2.2樣品的采集及處理小鼠稱重后，用乙醚麻醉處死，采集血液樣品，解剖分離組織器官并稱重，取約1.5cm的十二指腸、空腸，快速放入4%多聚甲醛中，固定24h后修塊，用于制作石蠟切片。

1.3測定項(xiàng)目及分析方法

1.3.1血液生理指標(biāo)檢測采用血細(xì)胞計(jì)數(shù)板法測定肝素鈉抗凝的血液中紅細(xì)胞總數(shù)和白細(xì)胞總數(shù)，白細(xì)胞分類計(jì)數(shù)參照已有文獻(xiàn)進(jìn)行[9]。每個樣品制作5張血涂片，每張血涂片統(tǒng)計(jì)100個白細(xì)胞中各類白細(xì)胞的數(shù)量。

1.3.2蘇木精-伊紅(H.E)染色組織固定24h后，梯度酒精脫水，二甲苯透明，浸蠟，包埋，修塊，制作厚度為6μm的石蠟組織切片；37℃烤片24h后，二甲苯脫蠟，梯度酒精脫二甲苯至水，經(jīng)蘇木精和伊紅染色，梯度酒精脫水，二甲苯透明，封片。采用Olympus生物顯微鏡觀察小腸組織形態(tài)結(jié)構(gòu)并拍照，每個組織樣品制作五張不連續(xù)切片，每張切片選取5個視野，每個視野選兩根絨毛和隱窩進(jìn)行測量。

1.3.3數(shù)據(jù)處理與分析數(shù)據(jù)均以平均數(shù)±SD表示，采用SPSS16.0軟件進(jìn)行組間差異顯著性比較分析，P<0.01表示差異極顯著，P<0.05表示差異顯著。

2結(jié)果與分析

2.1利巴韋林對小鼠日增重的影響

給藥7d后，與空白對照組相比，低劑量利巴韋林組小鼠的日增重極顯著增加(P<0.01)，而高劑量組小鼠日增重顯著增加(P<0.05)，兩個用藥組之間無明顯差異；給藥14d后，各組間差異不顯著(表1)。

表1　小鼠的日增重變化 ±SD)

注:同列不同大、小寫字母分別表示在0.01和0.05水平上差異顯著,下同。

Note：The different capital and small letters in a column mean significant difference at levels of 0.01 and 0.05, respectively. The same as follow.

2.2利巴韋林對小鼠器官指數(shù)的影響

由表2可見，高劑量利巴韋林組小鼠脾臟、小腸和胸腺指數(shù)最低，且脾臟指數(shù)顯著低于低劑量組(P<0.05)。肝臟、腎臟指數(shù)在各組間無明顯差異。

表2　給藥14d后小鼠的器官指數(shù)變化±SD)

2.3利巴韋林對血液生理指標(biāo)的影響

與對照組相比，高、低劑量利巴韋林組紅細(xì)胞總數(shù)降低，白細(xì)胞總數(shù)升高，其中低劑量組白細(xì)胞總數(shù)極顯著增加(P<0.01)，高、低劑量組嗜中性粒細(xì)胞數(shù)量極顯著降低(P<0.01)，淋巴細(xì)胞數(shù)量極顯著升高(P<0.01)。嗜堿性粒細(xì)胞、嗜酸性粒細(xì)胞和單核細(xì)胞數(shù)量在各組間的比較差異均未達(dá)到統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(見表3)。

表3　給藥14d后小鼠血液部分生理指標(biāo)的變化±SD)

注:同行不同大、小寫字母分別表示在0.01和0.05水平上差異顯著,下同。

Note：The different capital and small letters in a same line mean significant difference at levels of 0.01 and 0.05, respectively.

2.4利巴韋林對小腸組織形態(tài)結(jié)構(gòu)的影響

H.E染色結(jié)果如圖1所示，低劑量利巴韋林組小腸絨毛黏膜上皮組織形態(tài)正常，而高劑量組小腸絨毛頂部出現(xiàn)部分粘膜上皮脫落的現(xiàn)象(如圖1 E 中箭頭所示)，且腸上皮細(xì)胞之間排列不緊密，造成小腸黏膜組織結(jié)構(gòu)的不完整。

圖1　小腸組織形態(tài)結(jié)構(gòu)

由表4可見，低劑量組小腸絨毛長度、隱窩深度、以及十二指腸的絨毛長度和隱窩深度比值均高于其他兩組。高劑量組小腸絨毛長度、絨毛長度與隱窩深度比值均最低。

表4　利巴韋林對小鼠小腸絨毛長度和隱窩深度的影響

3討論

3.1利巴韋林對小鼠生長發(fā)育的影響

利巴韋林作為常用的抗病毒藥物在臨床上被廣泛使用。本研究發(fā)現(xiàn)利巴韋林用藥7d后能夠顯著促進(jìn)小鼠生長發(fā)育，且低劑量的利巴韋林在用藥一周內(nèi)促生長效果最好。用藥14d后，高、低兩種劑量的利巴韋林的促生長效果不明顯，這可能是由于長時間使用利巴韋林延遲了紅細(xì)胞生長而導(dǎo)致貧血[10]，因此臨床上建議給予小劑量治療，且用藥時間為1周為宜。

3.2利巴韋林對小鼠免疫器官指數(shù)的影響

器官指數(shù)是衡量器官生物學(xué)功能的重要特征指標(biāo)之一?？傮w來看，用藥14d后，高劑量的利巴韋林對小鼠免疫器官和小腸器官指數(shù)的影響表現(xiàn)為降低作用，其中對脾臟的影響達(dá)到顯著差異水平，這可能是由于利巴韋林用藥劑量較高時會抑制機(jī)體免疫功能的正常發(fā)揮，且破壞小腸形態(tài)結(jié)構(gòu)，這與以往報道的高濃度利巴韋林對淋巴細(xì)胞有抗增殖作用相一致[11]。低劑量利巴韋林能夠顯著提高脾臟指數(shù)，這表明低濃度的利巴韋林可能主要通過刺激脾臟淋巴細(xì)胞增殖來增強(qiáng)機(jī)體的抗病毒作用。

3.3利巴韋林對小鼠血液生理指標(biāo)的影響

紅細(xì)胞具有運(yùn)輸氧和二氧化碳，對酸、堿物質(zhì)起到緩沖作用[12]，調(diào)控體液免疫和細(xì)胞免疫功能[13]。研究發(fā)現(xiàn)紅細(xì)胞數(shù)隨著利巴韋林注射濃度增高而降低[14]，這在本研究中也被證實(shí)，即利巴韋林組紅細(xì)胞數(shù)量均有一定程度降低，其原因可能是由于利巴韋林過早清除紅細(xì)胞膜蛋白，使紅細(xì)胞膜對氧化作用的易感性增強(qiáng)有關(guān)[15-16]，另一方面可能由于紅細(xì)胞表面存在利巴韋林發(fā)揮抗病毒作用的核苷載體，造成利巴韋林在紅細(xì)胞內(nèi)蓄積，破壞紅細(xì)胞[17]。

白細(xì)胞具有滲出、趨化和吞噬等特性，可保護(hù)機(jī)體不受外來微生物侵襲，其中淋巴細(xì)胞是機(jī)體免疫應(yīng)答功能的重要細(xì)胞成分，中性粒細(xì)胞在血液的非特異性細(xì)胞免疫系統(tǒng)中發(fā)揮重要作用。本研究表明按照5mg/kg、10mg/kg體重給小鼠灌胃利巴韋林，均能夠增加白細(xì)胞總數(shù)和淋巴細(xì)胞數(shù)量，降低嗜中性粒細(xì)胞數(shù)量，表明利巴韋林可能主要通過促進(jìn)淋巴細(xì)胞增殖來調(diào)節(jié)機(jī)體的免疫功能，但抑制非特異性細(xì)胞免疫功能的發(fā)揮。大量研究證實(shí)利巴韋林長期或過量使用可引起白細(xì)胞減少和貧血等不良反應(yīng)[8,14,18]，這與本試驗(yàn)結(jié)果不完全一致，其原因可能是由于利巴韋林的用藥劑量、用藥途徑以及受試動物所處的生理狀態(tài)不同而引起。于宏等研究證實(shí)隨著利巴韋林用藥濃度的增加，白細(xì)胞總數(shù)和淋巴細(xì)胞數(shù)量逐漸下降[18]，這與本試驗(yàn)結(jié)果相符，即添加低濃度的利巴韋林對免疫細(xì)胞的增強(qiáng)效果顯著。

3.4利巴韋林對小鼠小腸組織形態(tài)的影響

小腸組織結(jié)構(gòu)的完整性和功能的正常發(fā)揮對營養(yǎng)物質(zhì)的消化、吸收起到重要作用。絨毛長度和黏膜厚度是小腸消化吸收功能的重要決定因子。本研究發(fā)現(xiàn)，低劑量(5mg/kg)利巴韋林對小腸上皮形態(tài)結(jié)構(gòu)無明顯損傷作用，而高劑量(10mg/kg)利巴韋林使小腸絨毛頂端上皮出現(xiàn)脫落，破壞了黏膜上皮形態(tài)結(jié)構(gòu)的完整性，這一結(jié)果在不同劑量的利巴韋林對仔豬胃腸道形態(tài)結(jié)構(gòu)影響的報道中也得到證實(shí)[18]。

隱窩深度能夠反映小腸上皮細(xì)胞的生成率。絨毛長度和隱窩深度的比值是小腸功能狀態(tài)的綜合反映。低劑量利巴韋林能夠提高小腸絨毛長度、隱窩深度，以及十二指腸絨毛長度和隱窩深度的比值，而高劑量利巴韋林則對小腸絨毛的發(fā)育起到一定抑制作用。低劑量利巴韋林可能通過促進(jìn)小腸組織的生長發(fā)育，增強(qiáng)小腸對營養(yǎng)物質(zhì)的消化吸收功能，進(jìn)而促進(jìn)機(jī)體的生長發(fā)育。

4結(jié)論

利巴韋林具有促進(jìn)機(jī)體生長發(fā)育和調(diào)節(jié)免疫功能的作用，但其作用效果與添加劑量呈現(xiàn)一定的依賴關(guān)系。低濃度利巴韋林的促生長和免疫增強(qiáng)效果較好，對小腸組織形態(tài)沒有破壞作用，而且能夠增加小腸絨毛長度和隱窩深度比值，促進(jìn)小腸對營養(yǎng)物質(zhì)的消化吸收功能。在臨床應(yīng)用上，應(yīng)注意根據(jù)不同的個體來確定利巴韋林的適宜添加劑量和合理應(yīng)用時間。

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(責(zé)任編輯：馬世堂)

Effects of Ribavirin on Growing Development and Small Intestine Morphology and Structure in Mice

FAN Rong-li, JIANG Tao, AI Feng, FANG Xu, WANG Jun-cheng, GONG Zheng-qing, CHE Chuan-yan*

(College of Animal Science，Anhui Science and Technology University，F(xiàn)engyang 233100，China)

Abstract：Objective: To investigate the effect of different doses of ribavirin on growth and development and the small intestinal morphology in mice. Methods: Thirty mice at one month old were randomly divided into three groups, mice in control group were taken normal saline by intragastric administration, mice in low-dose and high-dose ribavirin group were either taken ribavirin according to 5mg/kg、10mg/kg body weight. Ribavirin was administered once daily for 14 consecutive days. We weighed mice every week morning, collected blood and tissue samples. Results: Ribavirin can improve the daily weight gain in mice, and low-dose ribavirin showed significant effect on growth at 7 old day (P<0.05). After having taken medicine for 14 days, spleen index in low -dose ribavirin group was significantly higher than that in high-dose group (P<0.05). In compared with control group, the total number of red blood cell was decreased, white blood cell number was increased, heterophil granulocyte number was reduced significantly (P<0.01), lymphocyte was highly significant increased (P<0.01) in high-dose and low-dose ribavirin group; the total number of white blood cell in low-dose group was very significantly increase(P<0.01). High-dose ribavirin damaged the integrity of morphology and structure in small intestinal mucosa epithelium, inhibited the development of small intestinal villi. Low-dose ribavirin could enhance the villus length, crypt depth, and villus length to crypt depth ratio, so that to deliver the function of small intestine. Conclusions: Ribavirin showed effects of improving growth and development, enhancing immune function. However, the effects of ribavirin on improving growth performance and immunoenhancement were attenuated along with dose increase. At clinical applications, we should take notice of confirming appropriate dosage and reasonable application time in the light of different individual.

Key words:Ribavirin; Growth and development; Blood physiological index; Histomorphology

中圖分類號：S852.16

文獻(xiàn)標(biāo)識碼：A

文章編號：1673-8772(2016)01-0019-06

作者簡介：范榮莉(1992-)，女，安徽省淮北市人，在讀本科生，主要從事腸道微生態(tài)營養(yǎng)與黏膜免疫研究。*通訊作者：車傳燕，講師，E-mail:ccyan1980@163.com。

基金項(xiàng)目：安徽省級大學(xué)生創(chuàng)新創(chuàng)業(yè)訓(xùn)練計(jì)劃項(xiàng)目(AH201410879031)；國家級大學(xué)生創(chuàng)新創(chuàng)業(yè)訓(xùn)練計(jì)劃項(xiàng)目(201310879011)。

收稿日期：2015-11-06