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新型全反式維甲酸衍生物 4-氨基-2-三氟甲基苯基維甲酸酯對肝癌細(xì)胞株 HepG2增殖的影響

2016-04-27 08:08慧,周青,汪
關(guān)鍵詞:維甲酸衍生物細(xì)胞株

劉 慧,周 青,汪 淵

新型全反式維甲酸衍生物 4-氨基-2-三氟甲基苯基維甲酸酯對肝癌細(xì)胞株 HepG2增殖的影響

劉 慧,周 青,汪 淵

目的研究 4-氨基-2-三氟甲基苯基維甲酸酯 (ATPR)對人肝癌細(xì)胞株 HepG2增殖的影響,并初步探討其可能的作用機(jī)制。方法選取 HepG2細(xì)胞為研究對象,全反式維甲酸(ATRA)和 ATPR分別作用細(xì)胞,應(yīng)用 MTT比色法測定細(xì)胞增殖,流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞周期分布情況,Western blot法檢測 HepG2細(xì)胞內(nèi)周期蛋白 D(cyclinD)及細(xì)胞周期蛋白依賴性激酶 4(CDK4)和 CDK6蛋白表達(dá)量。結(jié)果ATPR能夠顯著抑制 HepG2細(xì)胞的增殖,將細(xì)胞阻滯在 G0/G1期,呈濃度與時間依賴性(P<0.05),并且同濃度、同一處理時間下,ATPR的抑 制率更高(P<0.05);此外,Western blot結(jié)果顯示,ATPR較 ATRA更能顯著下調(diào) HepG2細(xì)胞中cyclinD和 CDK6蛋白表達(dá)水平(P<0.05),而 CDK4蛋白水平在各組變化均不明顯。結(jié)論同等濃度下,ATPR抑制HepG2細(xì)胞增殖的效果明顯強(qiáng)于 ATRA,其機(jī)制可能是 ATPR通過下調(diào) cyclinD和 CDK6蛋白的表達(dá)水平,造成 G0/G1期阻滯,最終導(dǎo)致肝癌細(xì)胞株 HepG2的增殖抑制。

肝癌;HepG2細(xì)胞;全反式維甲酸;4-氨基-2-三氟甲基苯基維甲酸酯;細(xì)胞周期;細(xì)胞增殖

全 反 式 維 甲 酸 (all-trans retinoic acid,ATRA)(圖1)是維生素 A的主要活性代謝物,為維甲酸類藥物的代表,可誘導(dǎo)分化多種腫瘤細(xì)胞,已被廣泛用于治療急性早幼粒細(xì)胞性白血病[1]。Sait et al[2]發(fā)現(xiàn) ATRA能上調(diào)腫瘤細(xì)胞中的血管內(nèi)皮細(xì)胞生長因子(vascular endothelial growth factor,VEGF),促進(jìn)腫瘤血管的生成而引起惡性增殖。此外,ATRA還可產(chǎn)生較強(qiáng)的維甲酸綜合征,長期使用會產(chǎn)生維甲酸抵抗,限制了其在腫瘤治療中的作用[3]。因此,開發(fā)低毒高效的新型維甲酸衍生物是必需的。4-氨基-2-三氟甲基苯基維甲酸酯 (4-amino-2-trifluoromethyl-phenyl retinate,ATPR)(圖2)是由本校合成的新型維甲酸衍生物,研究[4-6]表明在抑制細(xì)胞遷移與誘導(dǎo)分化和凋亡方面,ATPR效果明顯優(yōu)于 ATRA。然而關(guān)于 ATPR對肝癌細(xì)胞株 HepG2增殖的研究較少,相關(guān)的機(jī)制尚不清楚。該研究以肝癌細(xì)胞株 HepG2為模型,通過比較 ATRA與 ATPR對其增殖能力的影響,為新型維甲酸衍生物用于肝癌臨床治療提供科學(xué)依據(jù)。

圖1 ATRA結(jié)構(gòu)式

圖2 ATPR結(jié)構(gòu)式

1 材料與方法

1.1 材料人肝癌細(xì)胞株 HepG2購自美國 ATCC公司;ATPR由安徽醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院提供;ATRA、二甲基亞砜(DMSO)、四甲基偶氮唑藍(lán)(MTT)購自美國 Sigma公司;低 糖 DMEM 培養(yǎng)基購自美國 Gibco公司,4℃儲存?zhèn)溆?;新生牛血清購自杭州四季青生物工程材料有限公司?20℃保存,用前 4℃融化,無需滅活;Coulter DNA檢測試劑盒購自美國 Beckman Coulter公 司;鼠 抗 人 β-actin購 自 美 國 Santa Cruz公司;鼠抗人 cyclinD、CDK6以及兔抗人 CDK4抗體購自上海聯(lián)世生物科技有限公司;辣根過氧化酶(horseradish peroxidase,HRP)標(biāo)記的羊抗鼠 IgG、羊抗兔 IgG、ECL顯色試劑盒以及 BCA定量試劑盒均購自美國 Pierce公司。ATRA、ATPR用 DMSO溶解配制成 20 mmol/L,-20℃避光保存,使用時用完全培養(yǎng)基稀釋至使用濃度。

1.2 方法

1.2.1細(xì)胞株以及細(xì)胞培養(yǎng) 人肝癌細(xì)胞株HepG2用含 10%新生牛血清的低糖 DMEM培養(yǎng)基,并加入青霉素 100 U/ml和鏈霉素 100μg/m l,在 37℃、5%CO2飽和濕度的細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。每 2~3 d換一次液,當(dāng)細(xì)胞密度達(dá) 80% ~90%,用 0.25%胰酶(含 0.53 mmol/L EDTA)傳代,取對數(shù)生長期的細(xì)胞進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

1.2.2細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)(MTT法) 收集對數(shù)生長期細(xì)胞,以 2.5×107/L的密度接種于 96孔板,每孔200μl,邊緣孔用 200μl PBS填充。待細(xì)胞貼壁后棄去培養(yǎng)液,用 PBS輕洗 3遍,然后分別加入含有不同濃度(5、12.5、20、25、50、75、100μmol/L)的ATRA和 ATPR的培養(yǎng)液孵育 48 h,以及同一濃度(25μmol/L)ATRA和 ATPR處理不同的時間(24、48、72、96 h),并設(shè)置細(xì)胞對照組、溶劑對照組(DMSO),其中溶劑對照組是與最大濃度 100μmol/L藥物中所含有的 DMSO等體積,其他藥物組均將 DMSO體積補(bǔ)齊至最大體積,以消除各組溶劑體積不同所造成的干擾。指定作用時間后,每孔加入 20μl MTT,于細(xì)胞培養(yǎng)箱中孵育 4~6 h。小心棄去上清液,每孔加入 100μl DMSO,37℃振動 15 min以溶解結(jié)晶,酶 標(biāo) 儀 檢 測 570 nm 波 長 吸 光 度 (optical density,OD)。每個濃度設(shè)置 6個復(fù)孔,做 3次實(shí)驗(yàn),取平均值。抑制率(%)=(對照組 OD570-試驗(yàn)組 OD570)/對照組 OD570×100%。用 SPSS 16.0計(jì)算藥 物 的 半 數(shù)抑制濃度 (half inhibitory concentration,IC50)。

1.2.3流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞周期 收集處于對數(shù)生長期的 HepG2細(xì)胞,接種于 6孔板,待細(xì)胞貼壁后換成無血清培養(yǎng)基饑餓24 h,使細(xì)胞周期同步化,然后用含 25μmol/L的 ATRA和 ATPR的完全培養(yǎng)液處理細(xì)胞,48 h后常規(guī)消化收集各組細(xì)胞,預(yù)冷PBS洗3次后,用100μl PBS重懸并調(diào)整細(xì)胞密度為 1×106/ml。按 Coulter DNA檢測試劑盒操作,每組加入50μl固定破膜劑,反應(yīng)30 s后立即加入500 μl PI染液,室溫避光反應(yīng) 30 min后用流式細(xì)胞儀檢測,每個標(biāo)本檢測 105個細(xì)胞,重復(fù)計(jì)數(shù) 3次,由ModFIT軟件分析 G0/G1、S、G2/M期細(xì)胞比例。

1.2.4Western blot檢測蛋白表達(dá) 5、25μmol/L的 ATRA和 ATPR分別處理 HepG2細(xì)胞 48 h后,取出細(xì)胞,用預(yù)冷的 PBS洗滌 3遍,在濾紙上控干PBS,并吸去殘余 PBS。然后每組加入 200μl蛋白提取緩沖液(Tris-HCl,pH 7.14,150 mmol/L NaCl,1 mmol/L EDTA,1%Triton X-100,0.1%SDS,5 mg/ml Leupeptin,1 mmol/L PMSF),冰 上 放 置 20 min后,置冰上用細(xì)胞刮刮取細(xì)胞,移入 1.5 ml EP管,并反復(fù)凍融 3次(-80℃、4℃)。之后,在超速冷凍離心機(jī)中 4℃、14 000 r/min離心 30 min,吸取上清液,使用 BCA試劑盒定量,用生理鹽水調(diào)整至相同濃度后,加入等體積的 4×蛋白上樣緩沖液,煮沸 8~10 min,-80℃保存待用。等量的各組樣品用于 SDS-PAGE電泳,然后將蛋白轉(zhuǎn)移到 PVDF膜上。轉(zhuǎn)膜成功后,室溫下用含 5%的脫脂奶粉封閉2 h或者4℃封閉過夜,接著將膜放入用一抗稀釋液配制的一抗中,4℃孵育過夜。經(jīng) TBST(含 0.05% Tween-20)洗滌 3遍后加入相應(yīng)濃度 HRP標(biāo)記的二抗室溫孵育 2 h,用 TBST洗滌 3遍后,TBS洗滌 1遍,每遍 10 min。在暗室中將等比例混合后的 ECL試劑 A液和 B液均勻涂于膜上,X線片曝光,顯影,定影。底片掃描后使用 Quantity One軟件分析條帶的灰度值。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理采用 SPSS 16.0軟件進(jìn)行分析,實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)均以 ˉx±s表示;組間數(shù)據(jù)比較采用單因素方差分析,兩兩比較采用 LSD-t檢驗(yàn)。

2 結(jié)果

2.1 ATRA和ATPR對HepG2細(xì)胞增殖的影響

MTT結(jié)果顯示,當(dāng)細(xì)胞經(jīng)不同濃度的 ATRA和ATPR處理 48 h后,與細(xì)胞對照組相比,低濃度的ATRA組(5、12.5、20、25μmol/L)對細(xì)胞無抑制作用,當(dāng)作用濃度升至 50μmol/L,開始以劑量依賴方式抑制 HepG2細(xì)胞株的增殖(FATRA=53.919,P<0.05),而 ATPR組從低濃度到高濃度均能抑制細(xì)胞的生長,并呈濃度依賴關(guān)系(FATPR=8 269.029,P<0.05),見圖3。通過 SPSS 16.0計(jì)算出 ATRA和ATPR的 IC50分別為 102.190、31.723μmol/L。隨后選取 25μmol/L藥物濃度分別作用于 HepG2細(xì)胞24、48、72、96 h,隨著藥物處理時間的延長,抑制率逐漸升高。相比之下,同一處理時間下 ATPR較ATRA的抑制率更高(F24h=44.499,F(xiàn)48h=271.387,F(xiàn)72h=1 479.019,F(xiàn)96h=2 130.531,P<0.05),見圖4。以上結(jié)果均提示,與同一濃度的 ATRA相比,ATPR對 HepG2細(xì)胞增殖抑制作用更強(qiáng)。

圖3 不同濃度的 ATRA及 ATPR對 HepG2細(xì)胞增殖的作用1:細(xì)胞對照組;2:溶劑對照組;3:5μmol/L;4:12.5μmol/L;5:20μmol/L;6:25μmol/L;7:50μmol/L;8:75μmol/L;9:100μmol/L;與細(xì)胞對照組比較:*P<0.05

圖4 ATRA和 ATPR對 HepG2細(xì)胞增殖的作用1:細(xì) 胞對 照組;2:溶 劑 對 照 組;3:ATRA 25μmol/L;4:ATPR 25 μmol/L;與細(xì)胞對照組比較:*P<0.05;與同一時間的 ATRA組比較:#P<0.05

2.2 ATRA以及ATPR對HepG2細(xì)胞周期的影響25μmol/L ATRA和 ATPR處理 HepG2細(xì)胞 48 h后,流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞周期顯示,與溶劑對照組相比,25μmol/L的 ATPR能夠顯著抑制 HepG2細(xì)胞增殖(P<0.05),使 G0/G1期細(xì)胞的比例明顯增加,而 同 濃 度 的 ATRA 組 無 明 顯 作 用 (FG0/G1= 123.523,F(xiàn)S=74.587,F(xiàn)G2=63.385),見圖5。以上結(jié)果提示 ATPR能將 HepG2細(xì)胞周期阻滯在 G0/G1期,從而抑制細(xì)胞增殖。

2.3 ATRA及ATPR對HepG2細(xì)胞中cyclinD、CDK 4和CDK 6蛋白水平的影響5、25μmol/L ATRA和 ATPR作用細(xì)胞 48 h后,與細(xì)胞對照組相比,ATPR能明顯下調(diào) cyclinD與 CDK6的水平(P<0.05),而 ATRA 組 變 化 不 顯 著 (FcyclinD=65.190、FCDK6=65.651)。同時,CDK4蛋白的表達(dá)水平在各組中均變化不明顯(FCDK4=5.298),見圖6。

3 討論

肝癌是我國最常見的惡性腫瘤之一,經(jīng)治療的早期肝癌,5年生存率僅為 50%,占惡性腫瘤死亡率的第二位[7-8]。除手術(shù)切除外,藥物化療是治療肝癌的重要手段,但由于療效缺乏特異性,并且長期用藥會產(chǎn)生 耐 性,從 而 影響了藥物 治 療 效 果[9]。因此,尋找高效、安全的新型抗癌藥是必要的。本實(shí)驗(yàn)室采用的 ATPR是在 ATRA的結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)上進(jìn)行羧基改造而成。研究[4-5,10]證實(shí),ATPR可以有效抑制肺癌細(xì)胞株 A549、胃癌細(xì)胞株 BGC-823以及乳腺癌細(xì)胞株 MDA-MB-231的遷移。

細(xì)胞增殖是通過細(xì)胞分裂方式增加細(xì)胞數(shù)量的復(fù)雜過程,是細(xì)胞生命活動的重要特征之一。然而,當(dāng)正常細(xì)胞在多種因素的影響下,細(xì)胞周期調(diào)節(jié)失控,獲得自主生長信號,導(dǎo)致細(xì)胞無限增殖,就會產(chǎn)生腫瘤[11],肝癌的發(fā)生發(fā)展也是肝癌細(xì)胞無限增殖的結(jié)果。因此,該文主要從細(xì)胞增殖方面,研究 ATRA與新型維甲酸衍生物 ATPR對肝癌 HepG2細(xì)胞株的作用。MTT實(shí)驗(yàn)顯示,ATPR從低濃度到高濃度(5~100μmol/L)均能夠抑制 HepG2細(xì)胞的增殖,有濃度依賴性和時間依賴性,抑制率遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于同等濃度下的 ATRA,即在相同濃度與作用時間下,ATPR抑制 HepG2細(xì)胞增殖的能力比 ATRA更強(qiáng)。

圖5 ATRA與 ATPR對肝癌 HepG2細(xì)胞周期的影響A:溶劑 對照組 ;B:ATRA 25μmol/L;C:ATPR 25μmol/L;與溶 劑對 照組 比較:*P<0.05

圖6 ATRA和 ATPR對 HepG2細(xì)胞 內(nèi) cyclinD、CDK 4和 CDK 6蛋白表達(dá)的影響1:細(xì)胞對照 組 ;2:溶 劑 對 照 組 ;3:ATRA 5μmol/L;4:ATRA 25 μmol/L;5:ATPR 5μmol/L;6:ATPR 25μmol/L;A:ATRA和 ATPR對HepG2細(xì)胞內(nèi) cyclinD蛋白的影響;B:ATRA和 ATPR對 HepG2細(xì)胞內(nèi) CDK4和 CDK6蛋白表達(dá)的影響;與細(xì)胞對照組比較:*P<0.05;與相同濃度的 ATRA組比較:#P<0.05

細(xì)胞周期檢測點(diǎn)是細(xì)胞增殖調(diào)控的關(guān)鍵位點(diǎn),包括細(xì)胞周期蛋白 cyclin和細(xì)胞周期蛋白依賴性激酶 CDK的調(diào)控系統(tǒng)[11]。流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞周期發(fā)現(xiàn),ATPR可以顯著導(dǎo)致 HepG2細(xì)胞阻滯在 G0/G1期,抑制細(xì)胞增殖,這與MTT結(jié)果是一致的。CyclinD蛋白在細(xì)胞增殖過程中發(fā)揮重要作用,是調(diào)節(jié) G1期細(xì)胞增殖信號的關(guān)鍵蛋白,其可與 CDK4或CDK6形成激酶復(fù)合物,使關(guān)鍵底物 PRb磷酸化,加快釋放轉(zhuǎn)錄因子 E2F,從而加速 G1/S期轉(zhuǎn)換[11-12]。細(xì)胞周期的失控會導(dǎo)致細(xì)胞惡性增殖,從而導(dǎo)致癌癥[11,13],因此,開發(fā)抗癌藥物來抑制細(xì)胞周期的進(jìn)程顯得尤為重要。有研究[14]表明,在食管癌細(xì)胞株EC-9706和乳腺癌細(xì)胞株 MDA-MB-231中,通過抑制 cyclinD和 CDK4的水平,能夠誘導(dǎo)細(xì)胞 G0/G1期阻滯,從而抑制細(xì)胞增殖。因此,本研究檢測了 cyclinD、CDK4和 CDK6蛋白,結(jié)果顯示,經(jīng) ATPR處理48 h后的 HepG2細(xì)胞 cyclinD和 CDK6表達(dá)降低,而 CDK4蛋白水平恒定。因此,ATPR可能通過下調(diào) cylinD和 CDK6蛋白水平來減少 cyclinD和 CDK6復(fù)合物的形成,抑制細(xì)胞周期 G1向 S期轉(zhuǎn)變,致使細(xì)胞阻滯在 G0/G1期,最終實(shí)現(xiàn)對 HepG2細(xì)胞的增殖抑制作用。

本實(shí)驗(yàn)研究中,ATRA較其衍生物 ATPR對 cyclinD及 CDK6的抑制能力較弱,這可能與二者調(diào)節(jié)肝癌 HepG2細(xì)胞增殖方面存在不同的作用機(jī)制有關(guān)。研究[15]顯示 ATRA及其衍生物通過其核受體發(fā)揮抗癌作用,目前已發(fā)現(xiàn)兩種維甲酸受體家族:RARs和 RXRs家族,分別都有 α、β、γ3個亞型。ATRA與其衍生物通過與細(xì)胞內(nèi)相應(yīng)維甲酸受體結(jié)合后,特異性結(jié)合到靶基因調(diào)控區(qū)的維甲酸應(yīng)答元件(RARE)上,選擇性地激活或抑制基因轉(zhuǎn)錄,調(diào)節(jié)細(xì)胞的增殖、分化和凋亡[15]。研究[5]證明 在胃癌BGC-823細(xì)胞中,ATPR較 ATRA能顯著下調(diào) RARα和 RARβ受體,導(dǎo)致 ATPR抑制 BGC-823細(xì)胞遷移的能 力 更 強(qiáng)。因 此,ATRA 與 ATPR 調(diào) 節(jié) 肝 癌HepG2細(xì)胞增殖機(jī)制的不同可能與其進(jìn)入 HepG2細(xì)胞內(nèi)結(jié)合不同的維甲酸受體有關(guān),二者對受體調(diào)節(jié)的研究也正在本實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行。

綜上所述,在同等濃度下,新型維甲酸衍生物ATPR較 ATRA更能顯著抑制肝癌細(xì)胞株 HepG2的增殖。其機(jī)制可能是通過下調(diào) cyclinD和 CDK6的表達(dá)水平阻滯 HepG2細(xì)胞周期進(jìn)展,從而抑制細(xì)胞增殖,為肝癌的藥物治療提供了新的實(shí)驗(yàn)依據(jù)。然而,細(xì)胞增殖是一個極其復(fù)雜且受嚴(yán)格調(diào)控的過程,ATPR如何下調(diào) cyclinD和 CDK6的機(jī)制以及相關(guān)通路仍不清楚,有待后續(xù)研究進(jìn)一步探討。

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Effects of a novel all-trans retinoid acid derivative 4-am ino-2-trifluoromethyl-phenyl retinate on the proliferation of HepG2 cells

Liu Hui,Zhou Qing,Wang Yuan
(Dept of Biochemistry and Laboratory of Molecular Biology,AnhuiMedical University;Dept of Key Laboratory,Gene Resource Utilization for Severe Disease of Anhui Province,Hefei 230032)

Objective To explore the effects of4-amino-2-trifluoromethyl-phenyl retinate(ATPR)on the proliferation of human hepatocellular carcinoma(HCC)HepG2 cells and preliminarily clarify the probable mechanisms. Methods HepG2 cells were used as the research model and treated with all-trans retinoic acid(ATRA)and ATPR respectively.The viability of HepG2 cells was investigated by MTT assay.Flow cytometry was used to detect cell cycle distribution.The expression of cyclinD,cyclin-dependent kinase 4(CDK4) and CDK6 proteins in HepG2 cellswere detected by Western blot.Results ATPR significantly inhibited the proliferation of HepG2 cells in a dose-and time-dependentmanner compared with cell group and arrested cells on G0/G1phase(P<0.05). The inhibition rate of ATPR wasmuch higher than that of ATRA at the same dose for the indicated time(P<0.05).In addition,Western blot results showed that ATPR down regulated the expression of cyclinD and CDK6 more dramatically than ATRA(P<0.05),while CDK4 expression was constant in all groups.Conclusion ATPR exhibits a better inhibitory effect on HepG2 cells proliferation than ATRA.The mechanism may be partly through down regulating the expression of cyclinD and CDK6 to cause G0/G1arrest,which finally leads to growth inhibition.

hepatocellular carcinoma;HepG2 cells;all-trans retinoic acid;4-amino-2-trifluoromethyl-phenyl retinate;cell cycle;cell proliferation

R 735.7;R 966;R 34

A

1000-1492(2016)02-0156-05

時間:2016-1-20 10:32:26

http://www.cnki.net/kcms/detail/34.1065.R.20160120.1032.004.htm l

2015-11-17接收

國家自然科學(xué)基金(編號:81272399);安徽省自然科學(xué)基金(編號:090413116)

安徽醫(yī)科大學(xué)分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)室、生物化學(xué)與分子生物學(xué)

教研室、安徽省 /省部共建教育部重要遺傳病基因資源利用重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,合肥 230032

劉 慧,女,碩士研究生;

汪 淵,男,教授,博士生導(dǎo)師,責(zé)任作者,E-mail:aydesm-1@163.com

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