伊興旭，陳敬賢，甘 霖，王明麗

◇基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研究◇

VZV糖蛋白 E基因胞外域的原核表達(dá)及其兔抗血清的制備

伊興旭1，陳敬賢2，甘 霖2，王明麗2

目的采用原核表達(dá)系統(tǒng)表達(dá)水痘-帶狀皰疹病毒（VZV）糖蛋白 E（gE）基因的胞外域，將純化后的目的蛋白免疫新西蘭家兔，制備該蛋白特異性抗血清。方法構(gòu)建原核表 達(dá) 質(zhì) 粒 gE-pET-32a（+），測(cè) 序 后 將 其 轉(zhuǎn) 化 至 E．coli BL21，以異丙基硫代 β-D-半乳糖苷（IPTG）誘導(dǎo)，獲得 VZV gE融合蛋白。采 用 SDS-PAGE電泳、Western blot法鑒定其特異性，利用 Ni2+-NTA柱對(duì) gE蛋白進(jìn)行純化，復(fù)性后免疫新西蘭家兔，獲得兔抗 VZV gE血清；采用間接免疫熒光、Western blot法和 ELISA法檢測(cè)該血清的特異性和效價(jià)。結(jié)果成功誘導(dǎo)表達(dá)出 VZV gE融合蛋白，SDS-PAGE鑒定提示其主 要 為 包 涵體表達(dá)，濃 度 約 為 3.01 mg／m l。蛋 白 經(jīng)Ni2+-NTA柱 純化后，純度約 為 90%。Western blot法 顯 示，經(jīng)變性、復(fù)性后的該融合蛋白有良好的免疫反應(yīng)性。用該蛋白免疫新西蘭家兔后獲得兔抗 VZV gE血清。ELISA分析顯示，該兔抗血清的效價(jià)為 1∶6 400。結(jié)論成功構(gòu)建了高效表達(dá) VZV gE蛋白的原核表達(dá)系統(tǒng)，獲得較高純度的 gE蛋白，可以作為 VZV亞單位疫苗的候選抗原，制備了特異性及效價(jià)均較高的兔抗 VZV gE多克隆抗體，為 VZV感染的臨床診斷及治療提供了重要的實(shí)驗(yàn)工具。

水痘 -帶狀皰疹病毒；原核表達(dá)；融合蛋白；兔抗血清

水 痘 -帶 狀 皰 疹 病 毒 （varicella-zoster virus，VZV）即人類皰疹病毒 3型，屬于皰疹病毒 α亞科，為 DNA病毒。病毒主要通過呼吸道分泌物和密切接觸傳播，可引發(fā)兩種不同臨床癥狀的疾病，水痘和帶狀皰疹［1-2］。VZV糖蛋白 E（glycoprotein E，gE）是一種晚期結(jié)構(gòu)蛋白，由 ORF68基因編碼，含有623個(gè)氨基酸（amino acid，AA），其 N端為 544 AA的親水胞外區(qū)，C端是 17 AA的跨膜疏水區(qū)和 62AA的胞內(nèi)區(qū)［3-4］。在 VZV顆粒的表面和宿主細(xì)胞的細(xì)胞膜和胞質(zhì)內(nèi)均含有大量的 gE，其在病毒的不同成熟階段以不同的含糖多肽形式存在，是體液免疫和細(xì)胞免疫應(yīng)答的重要靶點(diǎn)［5-7］。該實(shí)驗(yàn)獲得較高純度的 gE蛋白，可以作為 VZV亞單位疫苗的候選抗原，獲得了特異性及效價(jià)均較高的兔抗 VZV gE多克隆抗體，為 VZV的臨床診斷和治療提供了重要的實(shí)驗(yàn)工具。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 試劑和菌株 參考抗體：鼠抗 VZV gE單克隆抗體（美國 Abcam公司）；異硫氰酸熒光素（fluorescein isothiocyanate，F(xiàn)ITC）和 辣 根 過 氧 化 物 酶（horseradish peroxidase，HRP）標(biāo)記的羊抗鼠 IgG抗體（北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司）；弗氏完全佐劑和弗氏不完全佐劑（美國 Sigma公司）；Alexa Fluor488標(biāo)記的山羊抗兔 IgG（H+L）抗體（美國 Invitrogen公司）；E．coli BL21、pET-32a（+）菌株由本教研室保存（菌種庫）。

1.1.2 細(xì)胞、病毒和新西蘭家兔 人胚胎成纖維細(xì)胞（human embryo fibroblast，HF）為本教研室制備；Vero細(xì)胞購自美國 ATCC機(jī)構(gòu)；VZV臨床分離株為安徽醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院皮膚科帶狀皰疹患者的皮膚水皰液中分離，經(jīng)間接免疫熒光染色排除其他皰疹病毒，并經(jīng) DNA測(cè)序鑒定。HCMV（AD169株）、HSV-1（F株）、HSV-2（Sav株）均為本教研室保存（病毒庫）。新西蘭家兔購自安徽醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心。

1.1.3 引物 參照文獻(xiàn)［8］設(shè)計(jì)引物，上游引物（含Hind III酶切位點(diǎn)）：5′-AGGCAGAAGCTTCCATGGGGACAGTTAATAAACCTGT-3′；下游引物（含 XholⅠ酶 切 位 點(diǎn) ）： 5′-AATAATCTCGAGGGCATATCGTAGAAGTGGTGACG-3′，由上海生工生物技術(shù)服務(wù)有限公司合成。

1.2 方法

1.2.1 重組質(zhì)粒的的構(gòu)建 以 VZV臨床分離株的DNA為 模 板，PCR擴(kuò) 增 VZV gE基 因 胞 外 域 （1 617bp），反應(yīng)條件為 94℃預(yù)變性 5 min；94℃變性50 s；60℃退火 45 s；72℃ 延伸 2 min；共 35個(gè)循環(huán)，最后 72℃延伸 10min。將 PCR產(chǎn)物與 pET-32a（+）載體分別用 Hind III、Xhol I進(jìn)行酶切，凝膠回收 DNA以后，由 T4 DNA連接酶連接 gE基因片段與 pET-32a（+）載體（5 900 bp），并轉(zhuǎn)化至 E．coli BL21感受態(tài)細(xì)胞，涂 AMP抗性 LB板。挑取單個(gè)菌落，擴(kuò)增培養(yǎng)后提取質(zhì)粒，經(jīng)酶切和測(cè)序鑒定。

1.2.2 融合蛋白的表達(dá)及鑒定 挑取單個(gè)重組表達(dá)菌落先于 LB／AMP培養(yǎng)基中少量培養(yǎng)，然后擴(kuò)增培養(yǎng)，當(dāng)光密度（optical density，OD）值約為 1.0時(shí)，加人 0.1%的異丙基硫代 β-D-半乳糖苷（isopropyl β-D-Thiogalactoside，IPTG），32℃ 誘導(dǎo)表達(dá) 5 h后，收集菌體，按常規(guī)方法超聲裂解。分別收集上清液和菌體沉淀，通過 SDS-PAGE電泳分析菌體上清液和沉淀中 gE蛋白的表達(dá)情況，應(yīng)用 Western blot對(duì)目的蛋白的特異性進(jìn)行鑒定（設(shè)置空菌對(duì)照和空載體對(duì)照）。

1.2.3 融合蛋白的復(fù)性及純化 以尿素終濃度為1 mol／L的包涵體洗滌液 （20 mmol／L Tris-HCl、100 mmol／L NaCl、5 mmol／L EDTA、1%Triton），4℃洗滌超聲裂解的菌體沉淀 3次，1 h／次。12 000 r／min離心 15 min，收集包涵體于 I液（8 mol／L尿素、0.5 mol／L NaCl、20 mmol／L咪唑、20 mol／L PBS）中，4℃磁力攪拌下低速溶解。3 000 r／min離心 15 min，收集上清液，經(jīng) 0.45μm濾膜濾過后進(jìn)行柱上復(fù)性和純化：① 樣品上經(jīng) 5個(gè)柱床體積 I液平衡的 Ni2+-NTA柱；② 用 Ⅱ 液 （20 mmol／L咪唑、0.5 mol／L NaCl、20 mol／L PBS）按線性梯度稀釋尿素濃度至零，進(jìn)行蛋白柱上復(fù)性；③ 以 500 mmol／L的咪唑緩沖液線性梯度洗脫目的蛋白；④ SDS-PAGE分析蛋白純度，Lowry法測(cè)定蛋白濃度。

1.2.4 VZV gE兔抗血清的制備 取體重約為 3 kg的雄性新西蘭家兔，免疫前 3 d耳緣靜脈取血作為陰性對(duì)照。初次免疫時(shí)，每只家兔頸部和皮下多點(diǎn)注射 2 m l弗氏完全佐劑乳化的純化抗原（蛋白濃度為 1.0 mg／ml）。第 3周以弗氏不完全佐劑乳化的純化抗原進(jìn)行免疫，方法同前。以后每隔1周均以耳緣靜脈注射抗原純品 1.0 mg，此法免疫 3次。免疫 5次后，耳緣靜脈采血少許，采用 ELISA法分析其多克隆抗體效價(jià)。繼后按常規(guī)方法心臟取血，分離血清，加入 50%甘油分裝，-80℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.5 VZV gE抗原制備的多克隆抗體效價(jià)測(cè)定

采用棋盤滴定確定的 gE抗原的最佳包被濃度 1.0 μg／ml包被 ELISA板，以系列稀釋的兔抗血清（1∶200、1∶400、1∶800、1∶1 600、1∶3 200、1∶6 400、1∶12 800、1∶51 200）作為一抗，設(shè)置 3個(gè)復(fù)孔，陰性對(duì)照組（免疫前兔血清）和空白對(duì)照組。ELISA法測(cè)定各組的 OD值，計(jì)算其 OD的平均值（ˉx）和標(biāo)準(zhǔn)差（s），OD值 ＜ˉx+3S判斷為陰性；OD值 ＞ˉx+3S判斷為陽性。

1.2.6 間接免疫熒光和 Western blot法鑒定多克隆抗體的特異性 分別取 VZV臨床分離株、HCMV AD169株感染實(shí)驗(yàn)室培養(yǎng)的單層 HF細(xì)胞，取 HSV-1（F株）、HSV-2（Sav株）接種至單層 Vero細(xì)胞，進(jìn)行細(xì)胞爬片處理，置37℃、5%CO2溫箱培養(yǎng)。待出現(xiàn)特征性細(xì)胞病變效應(yīng)（cytopathic effect，CPE）后，以 1∶500稀釋的兔抗血清作為一抗，1∶4 000稀釋的 Alexa Fluor488標(biāo)記山羊抗兔 IgG（H+L）作為二抗，采用間接免疫熒光法觀察結(jié)果。

收集上述各病毒感染的細(xì)胞，加入蛋白上樣緩沖液沸水浴 5 min，SDS-PAGE電泳分離目的蛋白，并轉(zhuǎn)移至 PVDF膜上。用本研究制備的 VZV gE家兔免疫血清（1∶6 000）作為一抗，HRP標(biāo)記的羊抗兔 IgG（1∶5 000）作為二抗，檢測(cè)免疫血清中 gE多克隆抗體的特異性。

1.2.7 Protein A親和層析純化兔抗 VZV gE多克隆抗體 將兔抗血清，依次用 50%和 33%濃度的飽和硫酸銨進(jìn)行粗純。然后用 PBS緩沖液充分透析，收集上清液，經(jīng) Protein A親和層析柱純化兔抗VZV gE-IgG。Lowry法測(cè)定蛋白濃度，用 SDS-PAGE分析抗體純度。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理采用 SPSS 18.0軟件進(jìn)行分析，定性數(shù)據(jù)以%表示，定量數(shù)據(jù)以 ˉx±s表示，采用配對(duì)t檢驗(yàn)。

2 結(jié)果

2.1 重組質(zhì)粒的鑒定瓊脂糖凝膠電泳顯示，PCR擴(kuò)增及雙酶切均獲得預(yù)期的 1 617 bp VZV gE基因胞外域片段。見圖1。目的基因片段經(jīng)測(cè)序后，用BLAST法與 GenBank數(shù)據(jù)庫比對(duì)，其序列與 VZV Dumas標(biāo)準(zhǔn)株基因組 DNA的 gE基因相應(yīng)序列符合率為100%。

2.2 VZVgE融合蛋白的表達(dá)及鑒定SDS-PAGE

鑒定顯示，重組菌體的沉淀樣品在約 73 ku處出現(xiàn)清晰的特異性目的條帶，與預(yù)測(cè)的蛋白相對(duì)分子質(zhì)量一致，表明融合蛋白主要以包涵體形式存在。見圖2A。

圖1 VZV gE基因胞外域 PCR擴(kuò)增和 gE-pET-32a（+）酶切鑒定A：VZV gE基因胞外域 PCR擴(kuò)增圖；B：重組質(zhì)粒單、雙酶切鑒定圖；M：Marker；1：目的基因片段；2：陰性對(duì)照；3：重組質(zhì)粒；4：重組質(zhì)粒經(jīng) Xhol I酶切；5：重組質(zhì)粒經(jīng) HandⅢ酶切；6：重組質(zhì)粒經(jīng)雙酶切

2.3 VZVgE融合蛋白的復(fù)性、純化及鑒定取純化后的融合蛋白進(jìn)行 SDS-PAGE鑒定，軟件分析顯示，其純度約為 90%，見圖2B。Lowry法測(cè)定融合蛋白的濃度為 3.01 mg／ml。應(yīng)用鼠抗 VZV gE單克隆抗體進(jìn)行 Western blot鑒定，結(jié)果可見約 73 ku的特異性目的條帶。見圖2C。

圖2 VZV gE融合蛋白經(jīng) SDS-PAGE和 W estern blot特異性鑒定A：融合蛋白的可溶性 SDS-PAGE鑒定圖；B：純化后的融合蛋白 SDSPAGE鑒定圖；C：融合蛋白的 Western blot分析；M：Marker；1：重組菌體破碎前總蛋白；2：重組菌體破碎后上清液；3：重組菌體破碎后包涵體；4：pET-32空載體對(duì)照；5：純化前 gE融合蛋白；6：純化后 gE融合蛋白；7：純化前 gE融合蛋白；8：純化后 gE融合蛋白；9：pET-32空載體對(duì)照；10：BL21空菌對(duì)照

2.4 兔抗 VZVgE多克隆抗體 ELISA法效價(jià)檢測(cè)結(jié)果采用 ELISA法檢測(cè)，結(jié)果顯示，免疫前兔陰性血清 OD值為（0.253±0.037），當(dāng)免疫后血清最大稀釋度 達(dá) 1∶6 400時(shí)，其 OD值 為 0.382＞ˉx+ 3S，采用配對(duì) t檢驗(yàn)分析，與免疫前兔陰性血清組相比，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01），即多克隆抗體效價(jià)為1∶6 400。見圖3。

2.5 兔抗 VZVgE多克隆抗體特異性鑒定采用間接免疫熒光法和 Western blot分析兔抗 VZV gE多克隆抗體的特異性。結(jié)果顯示，gE蛋白免疫血清僅在感染 VZV的 HF細(xì)胞上呈現(xiàn)典型的綠色熒光，在其他皰疹病毒感染的細(xì)胞中都不出現(xiàn)熒光。見圖4。感染了 VZV的 HF細(xì)胞蛋白所在的泳道，出現(xiàn)特異性目的條帶，而其它皰疹病毒感染的細(xì)胞組均為陰性，表明所用 VZV gE重組蛋白制備的兔抗VZV gE多抗具有較高的特異性。見圖5。

圖3 ELISA法分析兔血清中 VZV gE抗體效價(jià)1：血清 1∶200稀釋度；2：血清 1∶400稀釋度；3：血清1∶800稀釋度；4：血清 1∶1 600稀釋度；5：血清 1∶3 200稀釋度；6：血清 1∶6 400稀釋度；7：血清 1∶12 800稀釋度；8：血清 1∶25 600稀釋度；與陰性血清組比較：**P＜0.01

2.6 ProteinA親和層析柱純化兔抗 VZVgE多克隆抗體純化的兔抗 VZV gE多克隆抗體經(jīng) SDSPAGE鑒定，結(jié)果顯示兩條目的條帶，分別為 IgG抗體的輕鏈（25 ku）、重鏈（55 ku）。見圖6。Lowry法測(cè)定抗體濃度為 5.51 mg／m l。

3 討論

VZV基因組為約 124 884 bp的線性雙鏈 DNA分子，包含一個(gè)約105 000 bp的獨(dú)特長片段（UL）和5 400 bp的獨(dú)特短片段（US），被約為 6 800 bp的末端和內(nèi)部重復(fù)序列隔開。基因組共含有 72個(gè)開放讀碼框，除了編碼與病毒復(fù)制、轉(zhuǎn)錄、包裝、釋放等生物活性相關(guān)的蛋白分子以及與宿主細(xì)胞相互作用的蛋白以外，還編碼 gB、gC、gE、gH、gI、gK、gL和 gM共8種病毒糖蛋白，這些糖蛋白在病毒的成熟與包裝方面發(fā)揮著極為重要的作用［9-10］。在處于恢復(fù)期的水痘和帶狀皰疹患者的血清中，VZV抗體主要是針對(duì) gB、gH和 gE病毒的糖蛋白，尤其是以 gE為主要靶點(diǎn)誘導(dǎo)的體液免疫和細(xì)胞免疫，能夠保護(hù)機(jī)體免受病毒攻擊［11-12］。

圖4 間接免疫熒光鑒定多克隆抗體的特異性 ×400A：DAPI染色 VZV感染的 HF細(xì)胞核；B：VZV gE膜熒光染色；C：藍(lán)綠熒光信號(hào)的疊加；D：DAPI染色 HCMV感染的 HF細(xì)胞核；E：HCMV熒光染色；F：DAPI染色 HSV-1感染 Vero細(xì)胞核；G：HSV-1熒光染色；H：DAPI染色 HSV-2感染 Vero細(xì)胞核；I：HSV-2熒光染色

圖5 W estern blot分析多克隆抗體的特異性1：VZV感染的 HF細(xì)胞；2：HCMV感染的 HF細(xì)胞；3：HSV-1感染的 Vero細(xì)胞；4：HSV-2感染的 Vero細(xì)胞；5：正常 HF細(xì)胞；6：正常Vero細(xì)胞

圖6 Protein A親和層析柱純化兔抗 VZV gE的 IgG抗體經(jīng) SDS-PAGE鑒定M：Marker；1：純化前兔抗 VZV gE的 IgG抗體；2：純化過程中的流穿液；3：純化后兔抗 VZV gE的 IgG抗體

融合蛋白經(jīng)原核表達(dá)系統(tǒng)表達(dá)時(shí)，往往因缺乏二硫鍵的形成、糖基化和磷酸化等加工、修飾過程，最后表達(dá)的蛋白會(huì)以無活性或活性較低的包涵體形式存在。本實(shí)驗(yàn)中獲得的融合蛋白并不是完整的成熟蛋白，因此實(shí)驗(yàn)中首先對(duì)包涵體進(jìn)行了變性和復(fù)性處理，并通過鎳柱對(duì)融合蛋白進(jìn)行了親和純化。Western blot表明經(jīng)變性和復(fù)性后的融合蛋白具有較好的免疫反應(yīng)性。研究［13］表明，VZV gE單克隆抗體可以介導(dǎo)抗體依賴的細(xì)胞毒性，在有外源性補(bǔ)體的情況下能中和病毒的感染性。本實(shí)驗(yàn)中以純化的融合蛋白為抗原，免疫新西蘭家兔制備了特異性和效價(jià)較高的多克隆抗體，其是否具有中和病毒效應(yīng)，還有待進(jìn)一步采用中和試驗(yàn)來驗(yàn)證。

本研究成功構(gòu)建了高效表達(dá) VZV gE蛋白的原核表達(dá)系統(tǒng)，為今后構(gòu)建 VZV gE蛋白的真核表達(dá)系統(tǒng)奠定了基礎(chǔ)。目前，國內(nèi)尚無商品化的 VZV抗體供應(yīng)，而國外的 VZV抗體價(jià)格昂貴。制備的兔抗VZV gE多克隆抗體有很高的特異性而且效價(jià)高，這不僅為進(jìn)一步制備 VZV gE單克隆抗體奠定了基礎(chǔ)，也為 VZV感染的臨床治療和病毒感染的早期診斷提供了重要的實(shí)驗(yàn)工具。

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Prokaryotic expression of varicella zoster virus glycoprotein E extracellular domain and preparation of antiserum

Yi Xingxu1，Chen Jingxian2，Gan Lin2，et al
（1Chaohu Hospital of AnhuiMedical University，Hefei 238000；2Deptof Microbiology，AnhuiMedical University，Hefei 230032）

Objective Varicella-zoster virus（VZV）glycoprotein E（gE）extracellular domain was cloned and expressed in E．coli．New Zealand rabbitwas immunized with the recombinant proteins to produce anti-VZV gE polyclonal antibody.Methods Prokaryotic expression plasmid gE-pET-32a（+），which contained the coding sequence for the extracellular domain of VZV gE.The authenticity of the insert was confirmed by DNA sequencing before itwas transformated into E．coli BL21 strain.The fusion proteinswere analyzed byWestern blot and purified with Ni2+-NTA column.The New Zealand rabbitwas immunized with the recombinant gE protein.Antibody titers were determined by ELISA.Resu lts Using prokaryotic expression system，wewere able to successfully induce the expression of VZV gE fusion proteins in E．coli．The fusion proteins reached 3.01 mg／ml in cell lysate and the purity was nearly 90%.The titer of the rabbit anti-VZV gE polyclonal antibody was1∶6 400.Conclusion The extracellular domain of VZV gE proteins are successfully expressed in E．coli，and could be a candidate for VZV vaccine.Highly specific polyclonal anti-VZV gE antibodies are obtained by immunization in New Zealand rabbit，which could be used to develop amethod for VZV laboratory diagnosis.

varicella-zoster virus；prokaryotic expression；fusion protein；polyclonal antibody

R 373.1；R 392.7

A

1000-1492（2016）02-0151-05

時(shí)間：2016-1-20 10：32：25

http：／／www.cnki.net／kcms／detail／34.1065.R.20160120.1032.002.htm l

2015-11-17接收

國家自然科學(xué)基金（編號(hào)：30872253）；安徽省科技廳科技攻關(guān)項(xiàng)目（編號(hào)：08010302179）；校企合作實(shí)踐教育基地（編號(hào)：2012sjjd014）

1安徽醫(yī)科大學(xué)附屬巢湖醫(yī)院檢驗(yàn)科，合肥 238000

2安徽醫(yī)科大學(xué)微生物學(xué)教研室，合肥 230032

伊興旭，男，碩士；

王 明 麗，女，教 授，碩 士 生 導(dǎo) 師，責(zé) 任 作 者，E-mail：1952987441＠qq.com