郭玉娟，謝園園，儲德勇，徐元宏，沈繼龍，

Ⅱ型弓形蟲和血吸蟲重疊感染對小鼠肝纖維化作用的實驗研究

郭玉娟1，2，謝園園1，儲德勇1，徐元宏3，沈繼龍1，3

目的觀察Ⅱ型弓形蟲和日本血吸蟲重疊感染對小鼠肝纖維化的影響，探討弓形蟲感染誘導的抗感染免疫對血吸蟲感染致小鼠肝臟纖維化的免疫調節(jié)作用。方法BALB／c小鼠建立重疊感染模型：預先感染血吸蟲（模型Ⅰ組）；預先感染 PRU株弓形蟲（模型Ⅱ組）；對照：只感染尾蚴組和正常對照組。取上述小鼠血液及肝臟，HE和 Masson膠原纖維染色法觀察肝臟蟲卵肉芽腫大小和肝纖維化面積；檢測纖維化指標透明質酸（HA）和肝臟羥脯氨酸（HYP）含量。結果模型Ⅰ組小鼠肝臟病理及纖維化指標檢測與相應對照組未見顯著差異；模型Ⅱ組動物血清 HA和肝臟 HYP顯著低于相應對照組（P＜0.001），肝臟蟲卵肉芽腫大小和纖維化面積均顯著減?。≒＜0.001）。結論預先感染Ⅱ型弓形蟲可能誘導機體的 Th1型應答的偏移，在此微環(huán)境下可負向調控血吸蟲肝臟纖維化狀態(tài)的 Th2應答，從而延緩和減弱肝纖維化的發(fā)生和發(fā)展。

Ⅱ型弓形蟲；日本血吸蟲；雙重感染；肝纖維化

日本血吸蟲病主要由沉積于組織的蟲卵內活毛蚴分泌 的 可 溶 性 蟲 卵 抗 原 （soluble egg antigens，SEAs）引起的免疫性疾病［1］。在血吸蟲感染感染后4～6周，機體以 Th1免疫反應為主；在感染后 6～8周蟲卵成熟后，其分泌的 SEA抗原促使 Th2免疫反應加強［1］。最終因促纖維生成和溶解因素不平衡而導致細胞外基質（extracellular matrix，ECM）大量沉積［2］，從而繼發(fā)肝纖維化和肝硬化。剛地弓形蟲是一種專性有核細胞內寄生的機會致病性的原蟲，血清學調查顯示，全球約 30%的人口均有不同程度感染，歐美國家感染率更高［3］。弓形蟲感染后，在機體的固有免疫后，機體以持續(xù)的 Th1免疫反應為主［4］。感染血吸蟲和弓形蟲可以介導宿主產生不同的免疫反應，建立重疊感染的小鼠模型，觀察先感染血吸蟲再感染弓形蟲以及先感染弓形蟲再感染血吸蟲，是否可以導致宿主免疫調節(jié)狀態(tài)發(fā)生改變，并觀察能否最終減弱日本血吸蟲病肝纖維化程度。

1 材料與方法

1.1 實驗動物及釘螺SPF級 BALB／c小鼠，雌性6～8周齡，18～20 g，室溫 20～22℃，標準飼料及普通自來水喂養(yǎng)，購自北京維通利華實驗動物技術有限公司；感染日本血吸蟲尾蚴的陽性釘螺，購自江蘇省血吸蟲病防治研究所。

1.2Ⅱ型弓形蟲包囊本實驗室長期在小鼠內傳代保存的 typeⅡ 型 PRU株 弓 形蟲。取口服感 染PRU包囊30 d以上的小鼠，麻醉后無痛處死，酒精消毒后，取出腦組織；將腦組織勻漿，涂片計數(shù)包囊備用。

1.3 試劑羥脯氨酸（hydroxyproline，HYP）試劑盒（南京建成生物工程研究所）；透明質酸（hyaluronic acid，HA）ELISA試劑盒（武漢華美生物工程有限公司）；Masson染色試劑盒（北京索萊寶科技有限公司）；甲醛和無水乙醇（上海化學試劑公司）。

1.4 實驗儀器Minispin小型離心機和臺式冷凍離心機（德國 Eppendorf）；電子天平（上海天平儀器廠）；隔水式電熱培養(yǎng)箱（江蘇東臺縣電器廠）；超聲細胞粉碎機（寧波科聲儀器廠）；光學顯微鏡（日本Nikon公司）。

1.5 實驗分組取小鼠84只，隨機分成 7組，建立模型Ⅰ和模型Ⅱ重疊感染模型，并設置對照。模型Ⅰ組：預先感染血吸蟲，感染血吸蟲尾蚴后 16周處死，1%水合氯醛麻醉小鼠后固定，腹部剃毛。尾蚴置玻片計數(shù)（15±2）條，貼于小鼠腹部 15 min。分為Ⅰ1組（預先感染尾蚴后 42 d灌胃包囊）、Ⅰ2組（預先感染尾蚴后 56 d灌胃包囊）、Ⅰ3組（尾蚴感染組）、Ⅰ4組（正常鼠對照）。模型Ⅱ組：預先感染弓形蟲，感染血吸蟲尾蚴后 8周處死，小鼠預先灌胃PRU包囊10個，再感染血吸蟲尾蚴（15±2）條。分為Ⅱ1組（口服包囊后35 d感染尾蚴）；Ⅱ2組（僅感染尾蚴組）、Ⅱ3組（正常小鼠對照）。

1.6 HA水平測定摘取眼球法收集血液于 1.5 m l EP管，37℃ 孵育 30 min，4 000 r／min離 心 10 min，收集血清。ELISA法檢測血清 HA水平，按試劑盒說明操作。

1.7 HYP含量測定稱取小鼠肝臟組織 0.1 g，按HYP檢測試劑盒說明書操作，測量肝組織中 HYP含量。

1.8 病理學檢查

1.8.1病理組織學觀察 取每只小鼠相同部位的肝臟組織，4%中性甲醛固定后石蠟包埋，3μm連續(xù)切片，貼附于經(jīng)10%多聚賴氨酸防脫片劑預處理的載玻片上。常規(guī)脫蠟，HE染色，脫水、透明、封固。光學顯微鏡下觀察肝組織病理變化及測量肉芽腫大小。同等設置條件下拍照，并利用 Image-Pro Plus軟件計算肉芽腫面積，統(tǒng)計分析。

1.8.2膠原纖維染色分析 Masson膠原纖維染色石蠟切片常規(guī)脫蠟，Masson復合液 5 min，0.2%醋酸水溶液輕輕洗；5%磷鎢酸 5～10 min，0.2%醋酸水溶液洗兩次；苯胺藍染色液 5 min，0.2%醋酸水溶液洗 2次。脫水、透明、中性樹脂封固。觀察膠原沉積情況并判斷肝纖維化程度，同等設置條件下拍照，并利用 Image-Pro Plus軟件計算每張圖片纖維化面積，統(tǒng)計分析。

1.9 統(tǒng)計學處理采用 SPSS 16.0統(tǒng)計軟件進行分析，數(shù)據(jù)用 ˉx±s表示；兩兩比較采用 t檢驗，多組之間兩兩比較采用方差分析。

2 結果

2.1 小鼠的存活率統(tǒng)計與對照組相比，模型Ⅰ的3個實驗組小鼠存活率有差異。重疊感染提高了小鼠的死亡率，后期存活的動物出現(xiàn)豎毛、怠動、發(fā)抖、厭食和消瘦等現(xiàn)象明顯；模型Ⅱ的2個實驗組小鼠存活率無顯著差異，后期存活的小鼠精神狀態(tài)和飲食情況一般。各組小鼠的存活率分別為Ⅰ1組33.3%；Ⅰ2組 41.7%；Ⅰ3組 66.7%；Ⅱ1組 41.7%；Ⅱ2組 50%；正常對照組Ⅰ4組和Ⅱ3組 100%。見圖1。

2.2 肝組織病理學變化模型Ⅰ的 3組實驗組小鼠肝臟表面布滿大量大小不一的肉芽腫結節(jié)，質地較硬，肝臟顏色呈深黑褐色，相比于正常肝臟體積縮小。鏡下見大量蟲卵肉芽腫。肉芽腫周圍及匯管區(qū)有明顯橋樣結構，可見大量結節(jié)形成，出現(xiàn)肝硬化表現(xiàn)。HE染色結果顯示3組小鼠之間肉芽腫大小差異無統(tǒng)計學意義（Levene=0.911，F(xiàn)=0.012），Masson染色結果顯示 3組小鼠之間纖維化面積差異無統(tǒng)計學差異（Levene=0.206，F(xiàn)=0.192），見圖2、3。模型Ⅱ的2組實驗組小鼠肝臟表面布滿大量大小不一的顆粒，質地相對于模型Ⅰ要軟，肝臟顏色灰褐色，相比于正常肝臟體積增大。鏡下見大量蟲卵肉芽腫，肉芽腫及匯管區(qū)纖維增生明顯，大量炎性細胞浸潤。但鏡下觀察可明顯發(fā)現(xiàn)模型Ⅱ的組Ⅱ1小鼠相比于組Ⅱ2蟲卵肉芽腫減少，纖維化程度降低，見圖4、5。模型Ⅱ兩組小鼠 HE染色顯示，Ⅱ1組相比于Ⅱ2組小鼠蟲卵肉芽腫減少，差異有統(tǒng)計學意義（F=1.065，P＜0.001）；Masson染色顯示Ⅱ1組相比于Ⅱ2小鼠纖維化面積減少，差異有統(tǒng)計學意（F =5.110，P＜0.001）。

2.3 血清HA水平、肝HYP含量模型Ⅱ各組血清 HA水平、肝 HYP含量見圖6。模型Ⅱ實驗組小鼠Ⅱ1血清 HA水平（F=3.217，P＜0.001）、肝HYP（F=0.451，P＜0.001）含量均顯著低于Ⅱ2。

圖1 各組小鼠存活率統(tǒng)計結果A：模型Ⅰ組；B：模型Ⅱ組

圖2 模型Ⅰ組小鼠肝臟肉芽腫病理圖 HE×100A：Ⅰ1組；B：Ⅰ2組；C：Ⅰ3組；D：Ⅰ4組

圖3 模型Ⅰ組小鼠肝臟纖維化病理圖 Masson×100A：Ⅰ1組；B：Ⅰ2組；C：Ⅰ3組；D：Ⅰ4組

圖4 模型Ⅱ組小鼠肝臟肉芽腫病理圖 HE×100A：Ⅱ1組；B：Ⅱ2組；C：Ⅱ3組；與Ⅱ2組比較：***P＜0.001

3 討論

血吸蟲病肝纖維化是蟲卵肉芽腫所致膠原合成與降解失衡而使膠原過度沉積的結果。肝星狀細胞（hepatic stellate cells，HSCs）的活化是血吸蟲肝纖維化的關鍵事件［5］。HYP是肝臟膠原蛋白的特征性成分之一，其含量高低可以直接反映肝臟纖維化的嚴重程度。另外，HA在肝內由 HSCs合成并釋放入血液，血中的 HA由肝細胞代謝，肝纖維化時 HSCs增多，而肝細胞代謝能力下降，因此引起外周血中HA水平上升。所以血清 HA水平也是反映肝纖維化的一項敏感指標［6］。

圖5 模型Ⅱ小鼠肝臟纖維化病理圖 Masson×100A：Ⅱ1組；B：Ⅱ2組；C：Ⅱ3組；與Ⅱ2組比較：***P＜0.001

圖6 模型Ⅱ小鼠肝臟纖維化指標 HA和 HYP濃度A：血清 HA；B：肝 HYP；與Ⅱ2組比較：***P＜0.001

血吸蟲感染早期，機體的免疫應答以 Th1型應答為主。而 Th1型細胞因子如 IFN-γ和 IL-2等可以誘導炎癥反應而抑制膠原沉積［7-8］。隨著病程進展，發(fā)生 Th1／Th2偏移，因而在血吸蟲感染慢性期和晚期以 Th2型應答為主［9］。而 Th2優(yōu)勢應答則通常伴隨 IL-4、IL-5、IL-13、TGF-β1等細胞因子的高表達。IL-4和 IL-13是有效 促膠原 形成的 細胞因子［9］，后者還可通過 TGF-β1依賴和非依賴方式，活化 HSCs，促進膠原產生以及纖維化的形成。因此，以蟲卵肉芽腫作為始動因子的 Th2應答及其細胞因子參與的膠原合成以及 ECM的形成，是肝臟纖維化的主要病理過程。

弓形蟲是一種有核細胞內專性寄生的原蟲。雖然弓形蟲屬內只有剛地弓形蟲一個物種，但是近年來對世界各地人畜分離株的種群結構分析發(fā)現(xiàn)，弓形蟲具有豐富的遺傳多樣性，歐洲和北美流行的弓形蟲以Ⅰ型、Ⅱ型和Ⅲ型為主［10］。對不同基因型的多態(tài)性效應分子誘導的宿主免疫應答發(fā)現(xiàn)，在感染早期的宿主固有免疫應答中，Ⅱ型弓形蟲株（弱毒株）的 GRA15Ⅱ可誘導宿主巨噬細胞出現(xiàn)顯著的偏移，驅動巨噬細胞向經(jīng)典途徑活化的巨噬細胞（M1）極化［11］。即使在弓形蟲感染宿主的適應性免疫應答中，同樣是以 M1／Th1優(yōu)勢應答為主［12］。基于血吸蟲病肝臟纖維化病理進程中的 Th2應答機制，本實驗以弓形蟲 PRU包囊預先感染小鼠后不同時間，血吸蟲尾蚴再行感染，結果表明，小鼠預先經(jīng)口感染Ⅱ型弓形蟲 PRU包囊 35 d后，給予血吸蟲尾蚴經(jīng)皮膚感染，小鼠存活率不僅沒有受到影響，而且其肝臟纖維化各項檢測指標均顯著下降。表現(xiàn)為小鼠肝臟蟲卵肉芽腫減少，HE染色和 Masson染色顯示纖維化面積縮小；血清HA水平和肝組織 HYP含量均顯著低于對照組。以上結果提示，Ⅱ型弓形蟲誘導的宿主Th1型免疫應答可顯著抑制小鼠血吸蟲病肝臟纖維化的病理進程和嚴重程度。其機制可能與PRU株弓形蟲感染誘導的 M1／Th1應答對肝臟纖維化發(fā)生發(fā)展起重要作用的 TGF-β的抑制作用有關。弓形蟲誘導的 M1／Th1的偏移與Ⅱ型蟲株的致密顆粒蛋白 15（GRA15Ⅱ）有關［13］。用 GRA15Ⅱ重組慢病毒誘導肝臟 kupffer細胞的 M1偏移進行早期肝臟纖維化的預防和治療研究正在進行中。

本研究提示，預先感染弓形蟲 PRU株建立的宿主的 Th1的微環(huán)境，可能導致機體 Th2應答減弱或遲滯，或者可增強 Th1應答中某些促纖維溶解分子的表達。例如 Wynn et al［14］發(fā)現(xiàn)在感染血吸蟲之前給與小鼠 IL-12（M1／Th1型應答的重要細胞因子），預先建立 Th1應答免疫環(huán)境，可以顯著減輕小鼠慢性期纖維化，其肝臟肉芽腫和膠原沉積明顯減少。值得關注的是，小鼠感染血吸蟲42 d或56 d后再給予弓形蟲感染，不但未見肝臟纖維化的明顯緩解，反而升高了小鼠的死亡率，其機制尚待深入研究。

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Experimental study on the effects of Toxoplasma gondii and Schistosoma japonicum overlapping infection on the liver fibrosis in m ice

Guo Yujuan1，2，Xie Yuanyuan2，Chu Deyong1，et al
（1Dept of Parasitology and Microbiology，Anhui Medical University，Hefei 230032；2Dept of Laboratory，The People’s Hospital of Lujiang County，Hefei 231500）

Objective To explore the positive effect of overlapping infection of Toxoplasma gondii and Schistosomiasis japonica on the hepatic fibrosis ofmice.Methods BALB／c mice（specific pathogen free）were transcutaneously infected with（15±2）larvae of Schistosoma japonicum to generate amodel of chronic infection after 42～56 days of larval infection，followed by an intragastric infection of 10 cysts Toxoplasma gondii PRU strain（group I）.Simultaneously，mice received 10 cysts infection of Toxoplasma gondii to establish a chronic infection with 35 days，followed by（15±2）larvae infection of Schistosoma japonicum（groupⅡ）.Equal number of normal animals were taken as control.Blood and liver tissue sampleswere collected for HE and Masson staining respectively.The size of liver egg granulomas and fibrosis areasweremeasured.Additionally，hyaluronic acid（HA）and hydroxyproline（HYP）in sera were tested.Results Pre-infection of PRU strain of Toxoplasma before Schistosoma japonicum infection resulted in a remarkable amelioration of hepatic fibrosis in mice，presenting the reduced size of egg granulomas and tissue fibrosis（P＜0.001）.And HA and HYP levelswere significantly decreased in themice with Toxoplasma pre-infection（P＜0.001）.In contrast，the established chronic infection of schistosomiasis ofmice，followed by oral reinfection with 10 cysts of Toxoplasma，did not show any inhibitory effects on hepatic fibrotic procession.Conclusion Pre-establishment of Th1 immune response induced by Toxoplasmamay help the animalswhich were infected with Schistosoma japonicum to ameliorate the procession of hepatic fibrosis.

Toxoplasma gondii；Schistosoma japonicum；overlapping infection；liver fibrosis

R 382.33；R 383.2+4

A

1000-1492（2016）02-0161-05

時間：2016-1-20 10：32：26

http：／／www.cnki.net／kcms／detail／34.1065.R.20160120.1032.006.htm l

2015-11-17接收

國家自然科學基金（編號：81471983、81171606）；安徽高校省級自然科學研究項目（編號：KJ2014A106）

1安徽醫(yī)科大學病原生物學教研室，合肥 230032

2安徽省廬江縣人民醫(yī)院檢驗科，合肥 231500

3安徽醫(yī)科大學第一附屬醫(yī)院檢驗科，合肥 230032

郭玉娟，女，碩士研究生；

沈繼龍，男，教 授，博 士 生 導 師，責 任 作 者，E-mail：shenjilong53＠126.com