劉 杰，杜怡斌，張 輝，李小波，王少斌，尹宗生

胸腺素 β4對(duì)大鼠骨髓源性內(nèi)皮祖細(xì)胞功能的影響

劉 杰1，杜怡斌1，張 輝1，李小波1，王少斌2，尹宗生1

目的觀察梯度濃度胸腺素 β4（Tβ4）對(duì)大鼠骨髓源性內(nèi)皮祖細(xì)胞（EPCs）生物學(xué)行為的影響。方法設(shè)置梯度濃度的 Tβ4分別處理 EPCs，同時(shí)在統(tǒng)一濃度下干預(yù)不同時(shí)間后進(jìn)行細(xì)胞功能學(xué)實(shí)驗(yàn)。采用 CCK-8細(xì)胞增殖試劑盒檢測(cè)靶細(xì)胞的增殖能力，Transwell細(xì)胞遷移檢測(cè)靶細(xì)胞遷移能力以及黏附能力。結(jié)果Tβ4能夠顯著增強(qiáng)體外培養(yǎng) EPCs的增殖、遷移和黏附能力，并且呈現(xiàn)一定的量效關(guān)系，與對(duì)照組相比，在 1 000 ng／m l時(shí)其增殖、遷移及黏附能力均顯著增強(qiáng)（P＜0.05）。在 1 000 ng／m l時(shí)隨著干預(yù)時(shí)間的推移，各時(shí)間點(diǎn)的 EPCs增殖能力均顯著增強(qiáng)且優(yōu)于對(duì)照組（P＜0.05）；與對(duì)照組相比，黏附能力在 48 h達(dá)到最大效應(yīng)（P＜0.05）。結(jié)論Tβ4可增強(qiáng)體外培養(yǎng)的 EPCs的功能，并且呈現(xiàn)一定的量效關(guān)系，1 000 ng／m l Tβ4預(yù)處理 48 h可獲得最優(yōu)效應(yīng)。

內(nèi)皮祖細(xì)胞；胸腺素 β4；增殖；遷移；黏附

內(nèi)皮 祖細(xì)胞 （endothelial progenitor cells，EPCs）是一種能夠分化為成熟內(nèi)皮細(xì)胞，有自我增殖、向缺血區(qū)域“歸巢”、促進(jìn)內(nèi)皮修復(fù)及新生的潛能［1］。神經(jīng)損傷研究［1-2］顯示 EPCs能夠分泌多種細(xì)胞因子促進(jìn)神經(jīng)生發(fā)，減輕炎癥反應(yīng)。研究［3］表明 EPCs移植治療腦損傷能夠顯著減少神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞生成，減輕炎癥反應(yīng)，促進(jìn)神經(jīng)功能恢復(fù)。然而 EPCs功能的不完整和數(shù)量的缺乏等問題嚴(yán)重制約著這一策略在脊髓損傷（spinal cord injury，SCI）治療中的應(yīng)用。胸腺素 β4（thymosin beta4，Tβ4）系由 43個(gè)氨基酸組成的高度保守的多肽［4］，能夠與 G肌動(dòng)蛋白結(jié)合調(diào)節(jié)其聚合反應(yīng)，介導(dǎo)血管及神經(jīng)軸突再生、抑制炎癥反應(yīng)等功能。研究［5］表明，Tβ4可增強(qiáng)多種干細(xì)胞的增殖、遷移及黏附、分化等功能。該實(shí)驗(yàn)擬觀察 Tβ4對(duì)大鼠骨髓源性 EPCs增殖、遷移及黏附能力的影響，為后續(xù)實(shí)驗(yàn)性的 EPCs移植治療 SCI提供實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物SPF級(jí) SD大鼠 90～100 g，雌雄不限，購(gòu)自安徽省實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心。

1.2 主要儀器及試劑CD133抗體、VEGFR-2抗體購(gòu)自美國(guó) Biorbyt公司；Dil標(biāo)記的乙?；兔芏戎鞍祝―il-ac-LDL）購(gòu)自美國(guó) Invitrogen公司；異硫氰酸熒光素荊豆凝集素-1（FITC-UEA-1）購(gòu)自美國(guó)Sigma公司；Transwell（孔徑為 8μm）購(gòu)自美國(guó) Corning公司；重組胸腺肽 β-4（Recombinant）購(gòu)自美國(guó)Peprotech公司；EGM-2完全培養(yǎng)基購(gòu)自瑞士 Lonza公司；鼠纖維連接蛋白（Rat FN）購(gòu)自瑞士 Gene Operation公司；大鼠淋巴細(xì)胞分離液購(gòu)自天津?yàn)笊镏破房萍加邢挢?zé)任公司；免疫熒光二抗均購(gòu)自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司；CCK-8細(xì)胞增殖試劑盒（Cell Counting Kit）購(gòu)自南京諾唯贊生物科技有限公司。

1.3 方法

1.3.1EPCs的分離、培養(yǎng)及鑒定

1.3.1.1EPCs的分離及 培養(yǎng) 參照 文獻(xiàn)［1，6］方法，脫頸椎處死大鼠，無菌條件下取出完整的雙下肢股骨及脛骨，暴露骨髓腔并用 F液反復(fù)沖洗，收集后以 1 800 r／min離心 20 min，棄上清液，5 m l F液 1 800 r／min離心 20 min。另取一無菌離心管量取 C液 5 ml，將上述離心所得液體棄上清液，以 5 m l全血組織稀釋液重懸后逐滴緩慢滴加于上述C液之上，1 500 r／min，離心 25 min（第 20 min時(shí)關(guān)閉電源待其自然靜止）。小心吸取單個(gè)核細(xì)胞層，細(xì)胞洗滌液洗滌 2次，EGM-2完全培養(yǎng)基重懸并計(jì)數(shù)，接種于預(yù)先以 FN（10μg／ml）包被的 24孔板中，37℃、5%CO2溫箱培養(yǎng)，48 h后首次換液棄上清液祛除未貼壁細(xì)胞，隔3 d換液1次，細(xì)胞融合達(dá)90%以上即可傳代。

1.3.1.2EPCs免疫細(xì)胞化學(xué) CD133及 VEGFR-2雙抗體熒光檢測(cè) 參考文獻(xiàn)［1，6］方法，取細(xì)胞融合達(dá)到 90%以上的 EPCs，PBS漂洗 3遍，免疫染色固定液固定 20 min；PBS漂洗，0.3%TritonX-100破膜10 min；PBS漂洗，10%山羊血清封閉 1 h；PBS漂洗，加入 CD133（1∶100）及 VEGFR-2（1∶100）一抗，4℃冰箱過夜；PBS漂洗，滴加相對(duì)應(yīng)二抗（1∶100），37℃避光孵育 1 h；PBS漂洗，加入終濃度 10 μg／ml Hoechst33342核染 5 min；PBS漂洗，抗熒光淬滅液封片，免疫熒光倒置顯微鏡觀察。

1.3.1.3EPCs的 FITC-UEA-1和 Dil-ac-LDL熒光檢測(cè) 參考文獻(xiàn)［1，6］方法，取細(xì)胞融合達(dá)到 90%以上的 EPCs，PBS漂洗，加入 10μg／m l的 Dil-ac-LDL，37℃避光孵育 4 h；PBS漂洗，免疫染色固定液固定20 min；PBS漂洗，加入 10μg／ml的 FITC-UEA-1，37℃避光孵育 1 h；PBS漂洗，抗熒光淬滅液封片，免疫熒光倒置顯微鏡觀察。

1.3.2EPCs體外細(xì)胞功能學(xué)實(shí)驗(yàn)分組 Tβ4梯度濃度組：終濃度分別為 1 000 ng／ml（T1000）、100 ng／m l（T100）、10 ng／m l（T10）、1 ng／m l（T1）的條件培養(yǎng)基；對(duì)照組：含 10%胎牛血清的 EGM-2完全培養(yǎng)基（T0）。

1.3.3CCK-8法測(cè)定 EPCs增殖能力 參考文獻(xiàn)［7］方法，取原代培養(yǎng) 7 d的細(xì)胞，0.25%胰蛋白酶消化收集貼壁細(xì)胞，EGM-2完全培養(yǎng)基重懸并計(jì)數(shù)，以 1×105個(gè)／m l的密度接種于預(yù)先以 FN包被的 96孔板，每孔 100μl，37℃溫箱過夜使細(xì)胞貼壁。加入梯度濃度的 Tβ4條件培養(yǎng)基（分組見前述）干預(yù) 24 h，每組設(shè) 6個(gè)復(fù)孔，并設(shè)置對(duì)照組（完全培養(yǎng)基和細(xì)胞）和空白組（完全培養(yǎng)基）。溫箱孵育 24 h，每孔加入 10μl CCK-8繼續(xù)孵育 4 h后肉眼觀察顯色程度，并用酶標(biāo)儀檢測(cè)450 nm處的光密度（optical delnsity，OD）值。參考文獻(xiàn)［7-8］方法，消化收集細(xì)胞同上，1×105個(gè)／ml的密度接種于預(yù)先以FN包被的 96孔板，每孔 100μl，37℃溫箱過夜使細(xì)胞貼壁。加入含 1 000 ng／ml Tβ4條件培養(yǎng)基分別干預(yù) 24、48、72 h，每組設(shè) 6個(gè)復(fù)孔，并設(shè)置對(duì)照組和空白組。溫箱孵育，每孔加入 10μl CCK-8繼續(xù)孵育4 h后肉眼觀察顯色程度，并用酶標(biāo)儀檢測(cè)450 nm處的 OD值。

1.3.4EPCs遷移實(shí)驗(yàn) 參考文獻(xiàn)［9］方法，消化收集細(xì)胞并調(diào)整濃度 5×105個(gè)／ml備用，將梯度濃度的 Tβ4條件培養(yǎng)基加入 Transwell的下室（600μl／孔），100μl細(xì)胞懸液加入 Transwell的上室，然后將上室小心地掛入已加培養(yǎng)液的下室，溫箱培育 6 h。小心刮除濾膜內(nèi)面未遷移的細(xì)胞，免疫染色固定液固定 20 min，加入終濃度 10μg／ml Hoechst33342核染 5 min，PBS漂洗，免疫熒光倒置顯微鏡觀察并計(jì)數(shù)遷移到濾膜外面的細(xì)胞。

1.3.5EPCs黏附能力 參考文獻(xiàn)［8］方法，培養(yǎng)第7天時(shí)加入梯度濃度的 Tβ4條件培養(yǎng)基繼續(xù)干預(yù)24 h，消化收集貼壁細(xì)胞并計(jì)數(shù)。接種相同數(shù)目的EPCs于預(yù)先包被的培養(yǎng)板中，溫箱培育 30 min，洗去未貼壁細(xì)胞，倒置顯微鏡下觀察并計(jì)數(shù)。參考文獻(xiàn)［8］方法，于末次換液時(shí)加入含 1 000 ng／ml Tβ4條件培養(yǎng)基分別干預(yù) 24、48、72 h，消化收集貼壁細(xì)胞并計(jì)數(shù)。接種相同數(shù)目的 EPCs于預(yù)先包被的培養(yǎng)板中，溫箱培育 30 min，洗去未貼壁細(xì)胞，倒置顯微鏡下觀察并計(jì)數(shù)。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理采用 SPSS 13.0軟件進(jìn)行分析，計(jì)量資料以 ˉx±s表示，各組間比較采用 ANOVA檢驗(yàn)，兩兩比較采用 SNK法檢驗(yàn)，檢驗(yàn)水準(zhǔn) α=0.05。各組實(shí)驗(yàn)重復(fù)3～5次。

2 結(jié)果

2.1 EPCs的培養(yǎng)及鑒定原代分離的單個(gè)核細(xì)胞呈圓形，體積較小，約 7 d呈紡錘樣，條索狀排列生長(zhǎng)的內(nèi)皮樣細(xì)胞形態(tài)特征；收集生長(zhǎng)良好的第2代 EPCs行 CD133和 VEGFR-2雙抗體熒光染色以及結(jié)合 FITC-UEA-1和攝取 Dil-ac-LDL熒 光檢測(cè)，可見目的細(xì)胞 CD133和 VEGFR-2抗原表達(dá)陽性，結(jié)合 FITC-UEA-1和攝取 Dil-ac-LDL表達(dá)陽性（圖1），表明目的細(xì)胞為典型的 EPCs。

2.2 Tβ4對(duì)骨髓源性EPCs增殖活性的影響

2.2.1CCK-8法檢測(cè)梯度 Tβ4對(duì)骨髓源性 EPCs增殖活性的影響 方差分析結(jié)果顯示，與對(duì)照組相比，Tβ4能夠顯著增強(qiáng)骨髓源性 EPCs的活性（F= 49.96，P＜0.01），呈一定的劑量效應(yīng)關(guān)系，兩兩比較結(jié)果顯示在 1 ng／ml Tβ4作用時(shí)與對(duì)照組相比差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義［（0.31±0.14）vs（0.30±0.12）］；與對(duì)照組相比，在 1 000 ng／ml Tβ4時(shí)作用最為顯著（0.40±0.13 vs0.30±0.12，P＜0.05）。見圖2。

2.2.2CCK-8法檢測(cè)不同時(shí)間點(diǎn) Tβ4（1 000 ng／m l）對(duì)骨髓源性 EPCs增殖活性的影響 結(jié)果顯示在 1 000 ng／ml Tβ4條件培養(yǎng)基下隨著培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng)，實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組 EPCs增殖能力均增強(qiáng)，且各時(shí)間點(diǎn)實(shí)驗(yàn)組均明顯優(yōu)于對(duì)照組。與對(duì)照組相比，在 72 h達(dá)到最大效應(yīng)（0.53±0.19 vs0.39±0.23，P＜0.05）。見圖3。

圖1 EPCs形態(tài)學(xué)鑒定A：原代培養(yǎng) EPCs7 d紡錘形分化貼于孔底 ×100；B：Hoechst33342細(xì)胞核染，陽性 ×100；C：TRITC標(biāo)記的 CD133染色，陽性 ×100；D：FITC標(biāo)記的 VEGFR-2染色，陽性 ×100；E：結(jié)合 FITC-UEA-1能力，陽性 ×200；F：攝取 Dil-ac-LDL能力，陽性 ×200

圖2 梯度濃度 Tβ4處理 EPCs與對(duì)照組比較：*P＜0.05

圖3 Tβ4（1 000 ng／m l）不同時(shí) 長(zhǎng)處 理 EPCs與對(duì)照組比較：*P＜0.05

2.3 Transwell法檢測(cè)Tβ4對(duì)骨髓源性EPCs遷移能力的影響方差分析結(jié)果顯示，與對(duì)照組相比，Tβ4能夠顯著增強(qiáng)骨髓源性 EPCs的遷移活性（F= 156.42，P＜0.05），且呈一定的劑量效應(yīng)關(guān)系，兩兩比較結(jié)果顯示各組與對(duì)照組相比差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，且在 1 000 ng／ml Tβ4時(shí)作用最為顯著［（74.44 ±9.32）vs（13.11±4.01），P＜0.01］。見圖4、5。

圖4 Hoechst33342核染 ×100A：對(duì)照組隨機(jī)選取一個(gè)視野下的遷移細(xì)胞；B：T1000組隨機(jī)選取一個(gè)視野下的遷移細(xì)胞

圖5 梯度濃度 Tβ4處理下 EPCs遷移能力與對(duì)照組比較：*P＜0.05，**P＜0.01

2.4 梯度濃度Tβ4干預(yù)24 h對(duì)骨髓源性EPCs黏附能力的影響方差分析結(jié)果顯，與對(duì)照組相比，Tβ-4能夠顯著增強(qiáng)骨髓源性 EPCs的黏附活性（F =111.74，P＜0.05），且呈一定的劑量效應(yīng)關(guān)系，兩兩比較結(jié)果顯示各組與對(duì)照組相比均有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，與對(duì)照組相比，在 1 000 ng／ml Tβ-4時(shí)作用最為顯著（42.00±6.64 vs17.38±2.89，P＜0.01）。見圖6、7。

圖6 Hoechst33342核染 ×100A：對(duì)照組隨機(jī)選取一個(gè)視野下的黏附細(xì)胞；B：T1000組隨機(jī)選取一個(gè)視野下的黏附細(xì)胞

圖7 梯度濃度 Tβ4處理下 EPCs黏附能力對(duì)比 ×100與對(duì)照組比較：*P＜0.05

2.5 不同時(shí)間點(diǎn)Tβ4（1 000 ng／m l）對(duì)骨髓源性EPCs黏附能力的影響在1 000 ng／ml Tβ4條件培養(yǎng)基下隨著干預(yù)時(shí)間的增加，EPCs的黏附能力表現(xiàn)為先增高后減低，48 h作用最為顯著，與對(duì)照組相比差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義［（50.04±5.38）vs（29.92± 4.37），P＜0.05］。見圖8。

3 討論

圖8 不同 時(shí)間 點(diǎn) Tβ4（1 000 ng／m l）對(duì)骨髓源性EPCs黏附能力的影響 ×100與對(duì)照組比較：*P＜0.05

NSC移植治療 SCI一直以來都是研究的熱點(diǎn)，然而，大量實(shí)踐表明移植的 NSC大部分分化為星形膠質(zhì)細(xì)胞參與瘢痕形成，神經(jīng)元生發(fā)的比例很低［10］。隨著研究的深入，有學(xué)者［11］發(fā)現(xiàn)，脊髓本身含有一定數(shù)目的 NSC（內(nèi)源性 NSC）。它規(guī)避了外源性NSC所面臨的諸如來源受限、倫理學(xué)問題及免疫排異反應(yīng)等多種應(yīng)用難題，成為中樞神經(jīng)系統(tǒng)損傷修復(fù)天然“原材料”的最佳來源，其重要性正被越來越多的專家學(xué)者所正視。最新研究［12］表明 NSC移植治療 SCI是通過改變局部微環(huán)境，通過對(duì)內(nèi)源性 NSC的“移植性誘導(dǎo)神經(jīng)生發(fā)”作用，促進(jìn)損傷部位神經(jīng)功能的重建。就本質(zhì)而言即移植的外源性NSC通過分泌神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子及發(fā)揮免疫調(diào)節(jié)等作用，創(chuàng)造無數(shù)個(gè)“熱點(diǎn)區(qū)域”，富集周圍的內(nèi)源性NSC并使之活化，協(xié)同增強(qiáng)神經(jīng)組織的再生修復(fù)能力。可見，這種“內(nèi)生外源性微環(huán)境”的改變對(duì) NSC的定向分化至關(guān)重要。

EPCs系一群能夠增殖分化為幼稚內(nèi)皮細(xì)胞的前體細(xì)胞，它能夠向缺血區(qū)域定向“歸巢”，有明顯促進(jìn)血管內(nèi)皮新生及修復(fù)的作用。研究［13］表明在急性心梗等實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ椭?，通過輸注 EPCs可促進(jìn)缺血部位血運(yùn)重建、改善左室功能和延緩動(dòng)脈粥樣硬化進(jìn)程。腦損傷的研究［5，14］表明神經(jīng)生發(fā)往往于血管生發(fā)之后，血管生發(fā)為神經(jīng)生發(fā)提供了良好的支持與輔助，二者相輔相成，它們所處的環(huán)境稱為神經(jīng)血管微環(huán)境。EPCs經(jīng)靜脈輸注后在損傷部位聚集并分化為血管內(nèi)皮細(xì)胞，參與構(gòu)建新生血管，大大改善了受損部位的局部微環(huán)境，不僅稀釋了炎癥反應(yīng)所產(chǎn)生的大量抑制神經(jīng)干細(xì)胞分化的炎性介質(zhì)，減輕炎癥反應(yīng)，同時(shí) EPCs能夠分泌諸如血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子等細(xì)胞因子協(xié)同 NSC的增殖和分化，表現(xiàn)出明顯的神經(jīng)保護(hù)作用。然而上述功能的執(zhí)行，有賴于 EPCs功能的完整和數(shù)目的完備，因而，增強(qiáng)EPCs的生物學(xué)效應(yīng)顯得尤為重要。

目前發(fā)現(xiàn)，諸多細(xì)胞因子、激素及藥物等［14］都能夠參與動(dòng)員 EPCs、增強(qiáng)其生物學(xué)效應(yīng)的。Tβ4作為一種多功能多肽，介導(dǎo)多種生物學(xué)效應(yīng)諸如血管及神經(jīng)軸突再生、傷口愈合和抑制炎癥反應(yīng)等功能。Morrisetal［15］報(bào)道了 Tβ4能夠通過動(dòng)員少突膠質(zhì)細(xì)胞生成髓鞘的方式促進(jìn)腦卒中大鼠神經(jīng)功能的恢復(fù)，同時(shí)伴隨著微血管密度的增加。

本研究顯示外源性 Tβ4能夠增強(qiáng)骨髓源性EPCs的多種生物學(xué)活性。目前，在 EPCs移植中所面臨的一個(gè)突出的問題即是數(shù)目的不足，因而移植到損傷局部的 EPCs無法發(fā)揮應(yīng)有的生物學(xué)效應(yīng)，本研究表明梯度濃度的 Tβ4對(duì) EPCs的增殖能力有明顯的促進(jìn)作用，且與作用濃度及作用時(shí)間呈正相關(guān)，1 000 ng／ml作用時(shí)間 72 h取得最大效應(yīng)，這與EPCs傳代的初期 1～2 d表現(xiàn)為明顯的“潛伏抑制”狀態(tài)，而3～4 d進(jìn)入指數(shù)增長(zhǎng)期的生長(zhǎng)曲線相符。此外 EPCs有向缺血區(qū)域遷移“歸巢”的能力，其功能的行使有賴于黏附和遷移能力，本實(shí)驗(yàn)表明梯度濃度的 Tβ4對(duì) EPCs的黏附及遷移有明顯的促進(jìn)作用，與作用濃度呈正相關(guān)。黏附能力的實(shí)驗(yàn)顯示，隨著作用時(shí)間的推移，Tβ4對(duì)其黏附能力表現(xiàn)為先促進(jìn)后抑制的效應(yīng)，1 000 ng／ml作用 48 h達(dá)到最大效應(yīng)。

綜上所述，Tβ4能夠增強(qiáng)骨髓源性 EPCs的多種生物學(xué)活性諸如增殖、黏附和遷移的能力，而這些功能直接影響 EPCs向損傷部位 “歸巢”、促進(jìn)血管新生、改善局部微環(huán)境及協(xié)同促進(jìn)神經(jīng)功能恢復(fù)的作用。因此，本研究進(jìn)一步認(rèn)識(shí)了 Tβ4的生物學(xué)效應(yīng)，并通過 Tβ4干預(yù)增強(qiáng) EPCs的功能，從而改善EPCs移植治療中樞神經(jīng)系統(tǒng)損傷這一策略的有效性，為推動(dòng) EPCs移植為主體的治療手段在臨床中的應(yīng)用提供更為廣泛的思路。

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Effects of thymosin beta4 on activity of bonemarrow-derived endothelial progenitor cells

Liu Jie，Du Yibin，Zhang Hui，et al
（Dept of Orthopedics，The First Affiliated Hospital of AnhuiMedical University，Hefei 230032）

Objective To investigate the effects of thymosin beta4（Tβ4）on biological behaviors of bonemarrow-derived endothelial progenitor cells（EPCs）.Methods First，EPCswere stimulated by Tβ4 with different concentration gradients，then processed by Tβ4 with the same concentration for gradient time.The capacities of proliferation，migration and adhesion were determined by CCK-8 assay，Transwellmigration assay and adhesion assay respectively.Results We found Tβ4 could significantly enhance the proliferative，migratory and adhesive capacities of EPCs，the effects of experimentgroup were significantwith the concentration of1 000 ng／m lwhen compared with the control group（P＜0.05）.As time went by，the proliferative capacity of experiment group was better than the control group ateach time point（P＜0.05）；the adhesive capacity was themost significantat the time pointof48 h when compared with the control group（P＜0.05）.Conclusion These results suggest that Tβ4 can increase the proliferative，migratory and adhesive capacities of EPCs，preprocessing with Tβ4（1 000 ng／ml）for 48 h can obtain the optimal effect.

endothelial progenitor cells；thymosinβ4；proliferation；migration；adhesion

R 681.54

A

1000-1492（2016）02-0166-06

時(shí)間：2016-1-20 10：32：26

http：／／www.cnki.net／kcms／detail／34.1065.R.20160120.1032.008.htm l

2015-11-11接收

國(guó)家自然科學(xué)基金（編號(hào)：81171173）；安徽省自然科學(xué)基金（編號(hào)：11040606Q25）

1安徽醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院關(guān)節(jié)與骨腫瘤科，合肥230032

2安徽醫(yī)科大學(xué)第四附屬醫(yī)院骨科，合肥 230032

劉 杰，男，碩士研究生；

尹宗生，男，主任醫(yī)師，教授，博士生導(dǎo)師，責(zé)任作者，E-mail：yinzongsheng1961＠126.com