于欣楊震楚元奎于美玲張怡清

1.寧夏醫(yī)科大學(xué)臨床醫(yī)學(xué)院醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)系 寧夏銀川 750004；2.寧夏醫(yī)科大學(xué)臨床學(xué)院心臟中心 寧夏銀川 750004；3.寧夏醫(yī)科大學(xué)藥劑科 寧夏銀川 750004

TNF-a基因結(jié)構(gòu)和功能生物信息學(xué)預(yù)測(cè)1*

于欣1楊震2△楚元奎1于美玲3張怡清1

1.寧夏醫(yī)科大學(xué)臨床醫(yī)學(xué)院醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)系 寧夏銀川 750004；2.寧夏醫(yī)科大學(xué)臨床學(xué)院心臟中心 寧夏銀川 750004；3.寧夏醫(yī)科大學(xué)藥劑科 寧夏銀川 750004

目的：以TNF-a為研究對(duì)象，對(duì)其蛋白結(jié)構(gòu)進(jìn)行生物信息學(xué)預(yù)測(cè)和分析。方法：利用生物信息學(xué)軟件對(duì)基因編碼的蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)、理化性質(zhì)、信號(hào)肽、跨膜結(jié)構(gòu)、亞細(xì)胞定位、二級(jí)結(jié)構(gòu)進(jìn)行生物信息學(xué)分析。結(jié)果：TNF-a為脂溶性、胞外為主的具有信號(hào)肽分泌的蛋白，有8個(gè)磷酸化位點(diǎn)和7個(gè)糖激化位點(diǎn)，二級(jí)結(jié)構(gòu)以β折疊為主；結(jié)論：TNF-a是一個(gè)很重要的細(xì)胞因子，本研究對(duì)TNF-a蛋白結(jié)構(gòu)與功能的初步探索，對(duì)在蛋白質(zhì)水平進(jìn)一步了解TNF-a基因蛋白效應(yīng)，進(jìn)而探索其與高血壓及炎癥的關(guān)系。

TNF-a，生物信息學(xué)

對(duì)于蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)和功能，盡管可以通過(guò)實(shí)驗(yàn)方法來(lái)實(shí)現(xiàn)，但利用生物信息學(xué)可以成本低且快速預(yù)測(cè)分析蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)和功能特性，尤其是對(duì)一些臨床疾病參與的蛋白質(zhì)的基礎(chǔ)研究具有更大理論價(jià)值[1]。 伴隨著分子遺傳學(xué)在檢驗(yàn)醫(yī)學(xué)中的進(jìn)步,一些臨床遺傳學(xué)研究從簡(jiǎn)單的單基因疾病轉(zhuǎn)向于復(fù)雜的多基因疾病研究如心血管疾病，高血壓，各種腫瘤，炎癥[2]等的研究中，TNF-a 是具有多種生物活性的細(xì)胞因子，TNF-a是體內(nèi)與內(nèi)分泌、炎癥關(guān)系最為密切的炎性因子［3］， 以自分泌以及旁分泌等多種形式對(duì)不同器官產(chǎn)生不一樣的生物學(xué)效應(yīng)。筆者利用生物信息學(xué)一些軟件分析 TNF-a不同特點(diǎn)，為研究其在臨床常見(jiàn)疾病如高血壓發(fā)生與發(fā)展能提供思路。

1 材料與方法

1.1 材料序列

以登陸數(shù)列號(hào)（Accession:ADV31546.2 GI:332038858）在Genbank數(shù)據(jù)庫(kù)檢索得到人的蛋白序列。

1.2 方法

筆者通過(guò)在線獲取生物信息學(xué)軟件工具 protparam 分析TNF-a蛋白的物理和化學(xué)特性；利用軟件TargetP和PSORTⅡ綜合分析其亞細(xì)胞定位；采用軟件 SignalP4.0分析信號(hào)肽；采用TMHMM Sever對(duì)TNF-A跨膜結(jié)構(gòu)進(jìn)行預(yù)測(cè)；分別利用NetPhos2.0和NetOGlyc3.1對(duì)其磷酸化位點(diǎn)和糖基化位點(diǎn)進(jìn)行前瞻性分析；利用生物學(xué)軟件 Smart對(duì) TNF-a在線預(yù)測(cè)其保守結(jié)構(gòu)域；利用DNAStar對(duì)其在線分析二級(jí)結(jié)構(gòu)及抗原系數(shù)，所有在線工具網(wǎng)址見(jiàn)文獻(xiàn)［1］。

2 結(jié)果與分析

2.1 軟件分析 采用在線軟件protparam在網(wǎng)上對(duì)TNF-a蛋白的理化性質(zhì)進(jìn)行預(yù)測(cè)分析，發(fā)現(xiàn)TNF-a由233個(gè)氨基酸組成，分子式為 C1152H1825N313O337S6，其相對(duì)分子質(zhì)量數(shù)值是25644.4，理論等電點(diǎn)pI是6.44；在構(gòu)成TNF-a蛋白的二十種氨基酸中，Leu所占成分比例最高，占12.9%，而Met和Trp百分含量較少，占0.9%，未發(fā)現(xiàn)Pyl和Sec。帶負(fù)電荷氨基酸殘基數(shù)為23，帶正電荷氨基酸殘基數(shù)為22；不穩(wěn)定系數(shù)為40.75，依據(jù)Guruprasad方法，分析結(jié)果提示TNF-a蛋白不穩(wěn)定性；脂肪氨基酸系數(shù)是98.37，屬于脂溶性蛋白；總平均親水性為-0.047。

2.2 TNF-a蛋白信號(hào)肽分析

TNF-a分泌蛋白N端15～35位氨基酸的疏水性短肽區(qū)域，引導(dǎo)蛋白質(zhì)的肽鏈通過(guò)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)進(jìn)入腔內(nèi)，這段疏水短肽即為信號(hào)肽。本研究TNF-a蛋白信號(hào)肽是被在線工具SignalP4.0進(jìn)行信號(hào)肽預(yù)測(cè)的，首先在線輸入前七十個(gè)氨基酸，利用神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)模型NN 和隱馬爾可夫模型HMM 進(jìn)行預(yù)測(cè)，隨后給出Y、C、S－score計(jì)測(cè)結(jié)果，通過(guò)Y最大值來(lái)判斷分析信號(hào)肽剪切位點(diǎn)；如何判斷分泌蛋白，多利用S平均值來(lái)判斷。若S平均值高于0.5，則為分泌蛋白，存在信號(hào)肽。預(yù)測(cè)（圖1）表明，C結(jié)果值為0.427，Y結(jié)果值為0.586，S結(jié)果值為0.956，其剪切位點(diǎn)在29～30位氨基酸之間，且S平均值0.956大于0.5，說(shuō)明TNF-a是具有信號(hào)肽的分泌蛋白。

圖1 TNF-a蛋白信號(hào)肽分析

2.3 TNF-a蛋白跨膜結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)

膜蛋白常有以下如胞外區(qū)、跨膜區(qū)和胞內(nèi)區(qū)，跨膜區(qū)就是蛋白在細(xì)胞膜內(nèi)的部分，有的蛋白有一個(gè)或多個(gè)跨膜區(qū)。筆者采用生物在線軟件工具TMHMM2.0Sever對(duì)TNF-a蛋白跨膜結(jié)構(gòu)進(jìn)行分析，結(jié)果（圖 2）表明，TNF-a蛋白或許是由跨膜區(qū)（35～5 7位氨基酸）、胞外區(qū)（蛋白的58～233位氨基酸處于細(xì)胞膜表面）以及胞內(nèi)區(qū)（1～34位氨基酸）部分構(gòu)成的膜蛋白。

圖2 TNF-a蛋白的跨膜結(jié)構(gòu)分析

2.4 TNF-a蛋白的極性預(yù)測(cè)分析

筆者采用在線軟件 protscale把 TNF-a蛋白極性進(jìn)行結(jié)果Zimmerman分析，結(jié)果( 圖3) 顯示該蛋白多肽鏈Arg氨基酸是最高分值52.0；Leu具有最低分值0.130。

圖3 TNF-a蛋白的極性預(yù)測(cè)分析

2.5 TNF-a蛋白的亞細(xì)胞定位分析

把 TNF-a蛋白蛋白序列輸入在線亞細(xì)胞定位生物信息工具TargetP（由丹麥TeKniske大學(xué)生物學(xué)序列分析中心提供）。在序列來(lái)源項(xiàng)選擇noplant ，其他選項(xiàng)用默認(rèn)值由返回的結(jié)果，表明該蛋白大部分（值為 0.891）集中在細(xì)胞其它位置。進(jìn)一步登錄日本的PSORTII Prediction，利用the k-NN Prediction分析，基本確認(rèn)該TNF-a蛋白分子屬于分泌蛋白。主要在11.1 %胞核；胞漿44.4 %； 高爾基體33.3 %； 線粒體11.1 %分泌合成中發(fā)揮生物學(xué)作用。

2.6 TNF-a蛋白翻譯后修飾位點(diǎn)分析

在真核生物中，蛋白質(zhì)翻譯后修飾過(guò)程常見(jiàn)的有糖基化和磷酸化兩種。糖基化通常是修飾天冬酰胺上的N端。其氨基酸的特征序列為 Asn －X－ Ser －Thr， X可表示為任一種氨基酸。機(jī)體一些蛋白需要糖分子/糖鏈等與其它分子相互作用發(fā)揮生物學(xué)作用； 磷酸化多具有功能開(kāi)關(guān)作用，當(dāng)機(jī)體蛋白被磷酸化后方能具備調(diào)控生物體功能代謝的作用；筆者采用在線軟件工具Netphos2.0 Server和NetOGlyc4.0 Server對(duì)TNF-a蛋白進(jìn)行預(yù)測(cè)，其預(yù)測(cè)表明有 8個(gè) Ser（5,27,68,79,80,81,85,209），3個(gè) Thr（83,165,181），4個(gè)Tyr（132,191,195,217）可能成為蛋白激酶磷酸化位點(diǎn)；有下列7個(gè)糖基化位點(diǎn)分別為68,71,79,80,81,83,85位點(diǎn)。

圖4 TNF-a蛋白翻譯后修飾位點(diǎn)分析

2.7 TNF-a蛋白的二級(jí)結(jié)構(gòu)分析

多肽鏈中的主鏈借助氫鍵形成有規(guī)則卷曲折疊的一維構(gòu)象為蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)。本研究利用DNAstar在線預(yù)測(cè)TNF-a蛋白的二級(jí)結(jié)構(gòu)和抗原表位（如圖 5），綜合 Gamien-Robson和Chou-Famsman2兩種方法，預(yù)測(cè)發(fā)現(xiàn)TNF-a的二級(jí)結(jié)構(gòu)主要是α螺旋結(jié)構(gòu)：28.3% 和18.9%；β折疊：51.5%和41.2% ，轉(zhuǎn)角13.7%和34.3%和無(wú)規(guī)則卷曲7.73%。根據(jù)Jameson woff預(yù)測(cè)TNF-a的氨基酸，抗原指數(shù)最小值是0.6，最大值3.4，平均值0.59，高于3.0的區(qū)域主要是20～21, 26,65, 80～82, 86, 177, 216區(qū)段，提示該區(qū)域可能是優(yōu)勢(shì)抗原表位。預(yù)測(cè) TNF-a的氨基酸親水性最小值-2.68，最大值2.60，平均值0.06，在30～55氨基酸明顯低于平均值。

圖5 TNF-a蛋白的二級(jí)結(jié)構(gòu)

3 討 論

1975 年， CarsweII 等給接種卡介苗的小鼠通過(guò)注射脂多糖后，觀察發(fā)現(xiàn)該鼠血清中含有能引起腫瘤出血壞死的活性因子可，稱(chēng)為腫瘤壞死因子( TNF) 。TNF被分類(lèi)TNF-α和 TNF-β兩大類(lèi)，其多由活化的單核細(xì)胞、巨噬細(xì)胞釋放產(chǎn)生，又稱(chēng)惡液素。眾所周知真核生物如單核細(xì)胞等進(jìn)行蛋白質(zhì)翻譯后的修飾過(guò)程主要有蛋白質(zhì)的糖基化和磷酸化，其中蛋白糖基化主要是修飾天冬酰胺上的N端，這種糖基化修飾可以對(duì)免疫分子的結(jié)構(gòu)和功能有一定影響，從而改變機(jī)體對(duì)抗原的應(yīng)答反應(yīng)［4］，同時(shí)蛋白糖基化作用與某些疾病也有緊密關(guān)系，如艾滋病患者所攜帶的HIVgp 120位點(diǎn)上的寡甘露糖位點(diǎn)可以成為潛在的治療靶位點(diǎn)［5］。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)NetOGlyc4.0 Server對(duì)TNF-a蛋白進(jìn)行預(yù)測(cè)，有下列7個(gè)糖基化位點(diǎn)分別為68,71,79,80,81,83,85位點(diǎn)，結(jié)合蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)分析結(jié)果， 其中ser68位于α 螺旋上，69leu、71ser和 79ser位于β－折疊片上， 這些不同位點(diǎn)修飾后的TNF與高血壓等有密切關(guān)系[6,7,8]。筆者采用生物在線軟件工具TMHMM2.0Sever對(duì)TNF-a蛋白跨膜結(jié)構(gòu)進(jìn)行分析，結(jié)果顯示，TNF-a蛋白或許是由跨膜區(qū)（35～57位氨基酸）、胞外區(qū)（蛋白的 58～233位氨基酸處于細(xì)胞膜表面）以及胞內(nèi)區(qū)（1～34位氨基酸）部分構(gòu)成的膜蛋白。預(yù)測(cè)TNF-a的氨基酸親水性在30～55氨基酸明顯低于平均值，說(shuō)明跨膜區(qū)域與親水區(qū)域一致，故揣測(cè)蛋白可能是一個(gè)與細(xì)胞信號(hào)傳導(dǎo)有關(guān)的膜受體蛋白。利用神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)模型NN 和隱馬爾可夫模型HMM 進(jìn)行預(yù)測(cè)，TNF剪切位點(diǎn)在29～30位氨基酸之間,是具有信號(hào)肽的分泌蛋白。腎小管上皮細(xì)胞 TLR4 的活化能特異性的激活核因子出( NF-KB) 途徑，啟動(dòng) IL-6、8、12，TNF-α 和輔助刺激因子CD80、 86 等基因的轉(zhuǎn)錄， 促使細(xì)胞趨化因子的釋放以及巨噬細(xì)胞的浸潤(rùn)，激活急性腎小管損傷中的免疫應(yīng)答。TNF-α 在細(xì)胞免疫、腫瘤免疫等多種生理和病理過(guò)程中發(fā)揮關(guān)鍵作用，同時(shí)TNF-α 和機(jī)體的炎癥反應(yīng)、 免疫反應(yīng)都有著密切關(guān)系［9］。高血壓時(shí)增高的 IL-6 和TNF-α 提升了機(jī)體的炎癥免疫反應(yīng)， 產(chǎn)生過(guò)多的免疫復(fù)合物，這些免疫復(fù)合物可直接增加腎小球通透性，同時(shí)可激活補(bǔ)體，產(chǎn)生 C3a、C5a 等趨化因子吸引炎癥細(xì)胞，釋放炎癥因子、蛋白溶解酶、活性氧，導(dǎo)致腎組織損害。腫瘤壞死因子-α( TNF-α)是腎臟疾病進(jìn)展中的重要調(diào)節(jié)因子之一。

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Bioinformatics prediction of TNF-a gene structure and function

Yu Xin1Yang Zhen2△Chu Yuankui1Zhang Yiqing1YuMeiling1
1 Department of Laboratory Medicine in clinical school, Ningxia Medical University, Yinchuan 750004, China; 2 Heart Center, the Affiliated Hospital of Ningxia Medical University, Yinchuan 750004, China；3 Department of Pharmacy, The Affiliated Hospital of Ningxia Medical University, 750004,Yinchuan, China

Objective:To analysis the bioinformatics of TNF-a gene structure and function.Methods: by means of bioinformatics methods,mainly focused on ananalyzing its encoding protein including its structure ,physical and chemical properties,signal peptide, transmembranes structure, subcellar localization,secondary structure ,higher structure and so on.Results:The results indicated TNF-a protein was stable fat soluble transmembrane protein,located cellular exterior.There are eight phosphorylation sites and seven sugar activation sites ,the secondary structure was primarily composed β fold.Conclusion: TNF - a is a very important cytokines, this study of TNF - a protein structure and function of the bioinformatics prediction, could further strenthen the understand the TNF - a gene and protein effect, and to explore its function and relationship with high blood pressure and inflammation.

TNF-a , Bioinformatics

R737.25

A

1672-5018（2016）11-002-02

國(guó)家自然科學(xué)基金（81260265）

1.作者簡(jiǎn)介：于欣(1977-)，副教授，主要從事心血管疾病的臨床血液免疫分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)室研究?！魍ㄓ嵶髡?，Email: yangzhen080@163.com