張兵　及曉宇　聶顯光　王玉成

(林木遺傳育種國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室(東北林業(yè)大學(xué))，哈爾濱，150040)

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檉柳ThbHLH1上游表達(dá)調(diào)控基因1)

張兵及曉宇聶顯光王玉成

(林木遺傳育種國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室(東北林業(yè)大學(xué))，哈爾濱，150040)

摘要通過檉柳轉(zhuǎn)錄組分析克隆得到了一條bHLH基因(ThbHLH1)。在此基礎(chǔ)上，本研究通過TAIL-PCR的方法克隆ThbHLH1轉(zhuǎn)錄因子的啟動(dòng)子序列，長2 061 bp。經(jīng)PLACE等軟件分析發(fā)現(xiàn)，ThbHLH1啟動(dòng)子中存在多個(gè)DOF元件，利用酵母單雜交和染色質(zhì)免疫共沉淀試驗(yàn)(ChIP試驗(yàn))研究發(fā)現(xiàn)，檉柳的ThDof16基因可識(shí)別ThbHLH1基因啟動(dòng)子中的DOF元件，說明ThDof16基因是調(diào)控ThbHLH1基因表達(dá)的上游調(diào)控因子。另外，通過基因槍技術(shù)瞬時(shí)轉(zhuǎn)化煙草葉片，進(jìn)行GUS染色和GUS酶活測(cè)定的試驗(yàn)，得到進(jìn)一步驗(yàn)證。

關(guān)鍵詞轉(zhuǎn)錄因子;ThbHLH1基因;非生物脅迫;基因表達(dá)調(diào)控;酵母單雜交;ChIP試驗(yàn);GUS酶活測(cè)定;GUS染色

分類號(hào)S792.12；Q78

Upstream Regulator ofThbHLH1 fromTamarixhispida

Zhang Bing, Ji Xiaoyu, Nie Xianguang, Wang Yucheng

(The State Key Laboratory of Forest Genetics and Breeding, Northeast Forestry University, Harbin 150040, P. R. China)//Journal of Northeast Forestry University，2016,44(4)：13-17,24.

AbHLHgene,ThbHLH1 was cloned from transcriptome ofTamarixhispida. The promoter region ofThbHLH1 with 2061 bp in length was cloned using TAIL-PCR. There were many DOF motifs in the promoter ofThbHLH1, and yeast one hybrid and ChIP analysis were performed to determine the upstream of ThbHLH1. The results showed that a DOF protein fromT.hispida,ThDof16 can bind to these DOF motifs in the promoter ofThbHLH1, and is the upstream regulator ofThbHLH1. The GUS staining and GUS enzyme activity determination assays of the transient-transformed tobacco leaves, which were obtained by gene-gun bombardment technology, were performed.

KeywordsTranscription factor;ThbHLH1; Abiotic stress; Gene expression regulation; Yeast one-hybrid; ChIP; GUS enzyme activity assay; GUS staining

bHLH轉(zhuǎn)錄因子是一類重要的轉(zhuǎn)錄因子家族，植物中的bHLH蛋白分布非常地廣泛，功能也相當(dāng)多樣化[1]。在植物中，擬南芥的bHLH基因家族由162個(gè)成員組成[2]。研究表明bHLH結(jié)構(gòu)域含有一個(gè)特征序列模式，由一個(gè)HLHM及其上游富含堿性氨基酸順序的核酸順序組成[3]。bHLH轉(zhuǎn)錄因子結(jié)構(gòu)中的bHLH結(jié)構(gòu)域，具有與DNA結(jié)合和與bHLH蛋白形成同源或異源二聚體的能力。同時(shí)，bHLH蛋白以同源或異源二聚體形式與DNA上E—盒(E-box)序列CANNTG結(jié)合而發(fā)揮功能。研究發(fā)現(xiàn)，bHLH轉(zhuǎn)錄因子在生物的生長發(fā)育調(diào)控過程中起著極為重要的作用[4]，在高等植物不同組織中廣泛存在，在植物花器官發(fā)生、激素應(yīng)答和植物次生代謝中扮演了非常重要的角色[5-6]。目前，對(duì)植物bHLH轉(zhuǎn)錄因子在抗逆調(diào)控方面的研究較少，但研究結(jié)果表明，該基因是一類重要的抗逆轉(zhuǎn)錄調(diào)控基因，對(duì)多種逆境都起調(diào)控作用[7]。

檉柳(Tamarix)，屬檉柳科檉柳屬植物，為落葉灌木或小喬木，是優(yōu)良的防風(fēng)固沙植物，耐干旱、鹽堿，廣泛分布于不同程度的鹽漬化土壤，其體內(nèi)具有一套有效的抗逆系統(tǒng)。因此，是研究木本植物抗逆機(jī)理，分離重要耐鹽基因的理想物種之一。植物抗鹽的重要機(jī)理之一是以各種方式降低地上部分鹽分的濃度，一些植物能夠進(jìn)化出特殊器官，通過主動(dòng)泌鹽、被動(dòng)拒鹽以及稀釋鹽分來達(dá)到避鹽的目的，從而提高在鹽脅迫下的適應(yīng)性[8]。目前，對(duì)于植物bHLH轉(zhuǎn)錄因子家族蛋白的功能只有少部分得到了解析，對(duì)植物bHLH的生物學(xué)功能研究較少。因此，bHLH基因在抗逆中的調(diào)控尚有待于深入研究。通過對(duì)7個(gè)不同檉柳組織不同處理的cDNA文庫分析，我們共獲得了2萬多EST序列。從這些EST序列中鑒定了7個(gè)編碼bHLH的EST序列。實(shí)時(shí)定量PCR分析表明，有一條bHLH基因的表達(dá)能夠被鹽、旱等處理所誘導(dǎo)，顯示它參與檉柳的耐鹽、抗旱的調(diào)控。在此基礎(chǔ)上，我們對(duì)ThbHLH1基因的上游調(diào)控因子進(jìn)行系統(tǒng)研究，進(jìn)而揭示ThbHLH1基因調(diào)控植物耐鹽脅迫的分子機(jī)理。

1材料與方法

檉柳種子播種于人工土(V(沙)∶V(草炭土)=3∶1)中，溫室的相對(duì)濕度為65%～75%，光照強(qiáng)度為21.62 lx，置于溫度為(22±2)℃。取2月苗齡用于試驗(yàn)研究。小葉煙草(Nicotianatabacum)由本實(shí)驗(yàn)室保存。

1.1ThbHLH1基因啟動(dòng)子克隆與分析

以檉柳基因組DNA為模板，進(jìn)行TAIL-PCR反應(yīng)。通過PLACE(http://www.dna.affrc.go.jp/PLACE/)數(shù)據(jù)庫和PlantCARE數(shù)據(jù)庫(http://bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/plantcare/htmL/)預(yù)測(cè)ThbHLH1基因啟動(dòng)子序列的主要順式作用元件。

1.2報(bào)告載體的構(gòu)建

ThbHLH1基因啟動(dòng)子中含有多個(gè)與抗逆功能相關(guān)的DOF元件，分別將含有DOF元件的啟動(dòng)子片段(pHIS2-DOF p+)和它的寡核苷酸片段(串連成3個(gè)重復(fù)序列pHIS2-DOF)同時(shí)引入他們的突變片段(pHIS2-DOF p-、pHIS2-DOF M1-M7)，并且引入酶切位點(diǎn)(表1)，然后將序列插入pHIS2誘餌載體的報(bào)告基因上游，分別構(gòu)建重組報(bào)告載體pHIS2-DOF p+和pHIS2-DOF p-。

表1　靶DNA的單鏈寡核苷酸序列及pHIS2載體兩端引物

注：“__”為引入的限制性內(nèi)切酶EcoRI和SacI的位點(diǎn)。

1.3檉柳ThDof基因cDNA文庫的構(gòu)建

根據(jù)檉柳轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)分析，共得到20個(gè)檉柳Dof基因(ThDof)。以上述20個(gè)ThDof基因?yàn)槟０澹瑪U(kuò)增含有pGADT7-Rec2載體同源融合序列的基因片段，與SmaI線性化的pGADT7-Rec2載體同源融合，轉(zhuǎn)入Top10大腸桿菌，測(cè)序后保存菌種，提取質(zhì)粒用于后續(xù)試驗(yàn)。

1.4酵母單雜交

按照Clontech公司酵母單雜交手冊(cè)進(jìn)行菌株Y187感受態(tài)細(xì)胞制備，將構(gòu)建好的報(bào)告載體和ThDof基因文庫共轉(zhuǎn)化酵母Y187，分別涂布于SD/-Trp、SD/-Leu、SD/-Leu/-Trp和SD/-His/-Leu/-Trp/3-AT互作篩選培養(yǎng)基上固體培養(yǎng)基，30 ℃倒置培養(yǎng)3～5 d。

1.5陽性克隆的互作分析

挑取SD/-His/-Leu/-Trp/3-AT篩選平板上的陽性克隆，于SD/-His/-Leu/-Trp液體培養(yǎng)基中30 ℃震蕩(250 r/min)培養(yǎng)1～2 d，提取酵母質(zhì)粒；以pGADT7-Rec2載體上的引物M5’AD和M3’AD，對(duì)酵母文庫/AD質(zhì)粒進(jìn)行PCR，檢測(cè)文庫/AD質(zhì)粒中插入片段的長度。把所得到的AD質(zhì)粒轉(zhuǎn)化大腸桿菌TOP10，在含有Kan的LB平板上篩選，37 ℃倒置培養(yǎng)16～20 h，第2天挑單克隆，進(jìn)行PCR，選取陽性克隆擴(kuò)繁，提取質(zhì)粒，測(cè)序。選取測(cè)序準(zhǔn)確的陽性克隆所對(duì)應(yīng)的酵母菌液，于SD/-His/-Leu/-Trp液體培養(yǎng)基中30 ℃震蕩(250 r/min)培養(yǎng)1～2 d，分別稀釋10、100、1 000和10 000倍，取2 μL點(diǎn)于SD/-His/-Leu/-Trp(3-AT:30 mM)上，30 ℃倒置培養(yǎng)2 d，拍照。

1.6報(bào)告載體與效應(yīng)載體的構(gòu)建

將順式作用元件DOF(AAAG)、DOF的突變體“CCCA”及含有和不含有DOF元件的啟動(dòng)子片段的寡核苷酸片段串連成3個(gè)拷貝重復(fù)序列，與CaMV 35S minimal promoter(46 bp)連接，并引入HindⅢ和NcoⅠ酶切位點(diǎn)，直接進(jìn)行DNA合成。將合成的序列定向插入pCAMBIA1301表達(dá)載體，構(gòu)建報(bào)告表達(dá)載體pCAM-DOF、pCAM-DM7、pCAM-DOF p+和pCAM-DOF p-。

1.7基因槍瞬時(shí)轉(zhuǎn)化煙草驗(yàn)證ThDof16與順式作用元件結(jié)合

選取小葉煙草(4周苗)約2 cm×2 cm大小的葉片，背面向上平鋪在MS培養(yǎng)基上，暗處理2～3 d，備用。將構(gòu)建好的報(bào)告載體與效應(yīng)載體用鎢粉包埋，制作微彈，按照PDS-1000基因槍操作方法瞬時(shí)轉(zhuǎn)化煙草，將轟擊完畢的培養(yǎng)皿密封置于人工氣候室中暗培養(yǎng)36～48 h，然后用GUS染液染色，觀察拍照。

1.8GUS酶活的測(cè)定

取0.1 g瞬時(shí)轉(zhuǎn)化的煙草葉片于1.5 mL離心管中，加入液氮研磨，加入600 μL酶提取液；13 000 r/min 4 ℃離心10 min，取適量的上清，用考馬斯亮藍(lán)法測(cè)定蛋白的含量；取50 μL含GUS的上清加入到450 μL 37 ℃預(yù)熱的檢測(cè)液(2 mmol/LMUG溶液)中。迅速充分混勻，并立刻取出50 μL加入950 μL反應(yīng)終止液(0.2 mol/L Na2CO3)，將該管作為酶促反應(yīng)的0點(diǎn)；然后分別在5、10、20、30、45、60 min分別取出50 μL的反應(yīng)液，轉(zhuǎn)入950 μL的反應(yīng)終止液中；用熒光分光光度計(jì)在激發(fā)波長365 nm、發(fā)射波長455 nm下，測(cè)定不同時(shí)間點(diǎn)的熒光值。將MU母液用反應(yīng)終止液(1 mmol/L)稀釋成濃度范圍在0～10 μmol/L的系列標(biāo)準(zhǔn)液，通過測(cè)定它們的熒光強(qiáng)度作出一條標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算GUS酶活值。

1.9ChIP驗(yàn)證ThDof16與DOF元件在ThbHLH1啟動(dòng)子中的互作

將ThDof16基因同源融合到pBI121-GFP載體，構(gòu)建pBI121-ThDof16-GFP載體，轉(zhuǎn)入EHA105農(nóng)桿菌，瞬時(shí)侵染2～3周苗齡煙草。取轉(zhuǎn)化的煙草20～25棵(質(zhì)量1～5 g)按照Haring的方法略有改進(jìn)進(jìn)行ChIP研究，真空條件下將材料浸泡在3%甲醛溶液中交聯(lián)10 min，用無菌水洗滌1次，浸泡在180 mmol/L甘氨酸溶液中5 min終止交聯(lián)。用超聲波進(jìn)行染色質(zhì)破碎，將其破碎成0.2到0.8 kb。將染色質(zhì)分成2份，一份用作GFP抗體(碧云天,中國)免疫共沉。另一份進(jìn)行兔IgG抗體對(duì)照。向兩個(gè)管中加入20 μL的Protein A+G Agarose beads，進(jìn)行免疫共沉淀。向IP沉淀的兩個(gè)管加入20 μL的5 M NaCl，65 ℃溫浴6 h，逆轉(zhuǎn)交聯(lián)。用氯仿抽提溶液，作為PCR的模板，電泳檢測(cè)。

2結(jié)果與分析

2.1ThbHLH1啟動(dòng)子序列的生物信息學(xué)結(jié)果

通過TAIL-PCR獲得ThbHLH1基因起始密碼子ATG上游2 061 bp長的序列。通過PlantCARE及PLACE進(jìn)行分析，預(yù)測(cè)可能含有的主要順式作用元件，結(jié)果如圖1。發(fā)現(xiàn)其具有啟動(dòng)子的基本轉(zhuǎn)錄元件GATA-box、GGATA-box、GATAA-box和CAAT-box，及與抗逆相關(guān)的元件DOF、MYC、W-box、I-box等。

圖1　ThbHLH1基因啟動(dòng)子序列

2.2重組報(bào)告載體的獲得

根據(jù)啟動(dòng)子元件分析結(jié)果發(fā)現(xiàn)含有多個(gè)DOF元件，其中-610～-256中包含4個(gè)DOF順式作用元件，說明DOF元件在基因ThbHLH1的表達(dá)調(diào)控中起重要作用。根據(jù)各順式作用元件合成的寡核苷酸單鏈，進(jìn)行退火反應(yīng)，合成靶DNA，將其與線性化的pHIS2載體連接后轉(zhuǎn)化TOP10，菌液PCR,pHIS2-靶DNA的擴(kuò)增條帶與以pHIS2質(zhì)粒為模板擴(kuò)增的片段大小一致，pHIS2-靶DNA重組質(zhì)粒構(gòu)建成功(圖2)。

M.DL2000;1.DOF元件、2～8.DM1～DM 7突變?cè)?bào)告載體菌液PCR電泳結(jié)果。

2.3ThDof基因特異識(shí)別DOF順式作用元件

通過酵母單雜交將重組報(bào)告載體質(zhì)粒、酶切線性化的文庫載體(pGADT7-Rec2)和ThDofs共轉(zhuǎn)化酵母Y187細(xì)胞，通過其在SD/-His/-Leu/-Trp+3-AT(30 mmol/L)的培養(yǎng)基中，生長出現(xiàn)大小差異明顯的菌落，判斷不同的酵母菌落中文庫/AD載體和報(bào)告載體的互作強(qiáng)弱不同，從其中選取互作能力強(qiáng)的菌落進(jìn)行擴(kuò)繁。以M5’AD和M3’AD為引物，挑取二次篩選的酵母進(jìn)行菌落PCR，測(cè)序，得到一條Dof基因(ThDof16)(圖3)。

M.DL2000;其中4號(hào)泳道為ThDof16。

2.4ThDof16基因?qū)υ屯蛔冊(cè)淖R(shí)別

分別將突變?cè)?bào)告載體pHIS2-DOF和pHIS2-DM1-7與酶切線性化的文庫載體(pGADT7-Rec2)與ThDof16共轉(zhuǎn)化酵母Y187感受態(tài)，挑取單菌落于SD-Leu/-Trp液體培養(yǎng)基搖菌至OD值0.8，稀釋10、100、1 000和10 000倍，取2 μL菌液點(diǎn)于SD/-His/-Leu/-Trp+3-AT(50 mmol/L)的固體培養(yǎng)基上，30 ℃倒置培養(yǎng)2～3 d，拍照。結(jié)果發(fā)現(xiàn)突變?cè)d體pHIS2-M1-7在TDO/30 mM 3-AT上無法正常生長(圖4A)，說明DOF元件中的每個(gè)堿基對(duì)于ThDof16的識(shí)別都起到不可替代的作用。

2.5ThDof16基因?qū)hbHLH1基因啟動(dòng)子片段的結(jié)合

將構(gòu)建的含順式作用元件的pHIS2-DOF P(+)和pHIS2-DOF P(-)如圖4B，與酶切線性化的文庫載體(pGADT7-Rec2)與ThDof16共轉(zhuǎn)化酵母Y187感受態(tài)，pHIS2-P53和pGADT7-Rec2-P53共轉(zhuǎn)化酵母Y187，作為陽性對(duì)照；pHIS2-P53和pGADT7-Rec2-ThDof16共轉(zhuǎn)化酵母Y187，作為陰性對(duì)照。挑取單菌落于SD-Leu/-Trp液體培養(yǎng)基搖菌至OD值0.8，稀釋10、100、1 000和10 000倍，取2 μL菌液點(diǎn)于SD/-His/-Leu/-Trp+3-AT(50 mmol/L)的固體培養(yǎng)基上，30 ℃倒置培養(yǎng)2～3 d(圖4C)。結(jié)果發(fā)現(xiàn)ThDof16可與含有相應(yīng)順式作用元件的啟動(dòng)子片段互作，當(dāng)啟動(dòng)子片段缺失元件，則不能互作。說明，ThDof16能夠特異性地結(jié)合啟動(dòng)子中的DOF位點(diǎn)，來調(diào)控基因的表達(dá)。

A.酵母單雜交驗(yàn)證ThDof16對(duì)DOF元件的識(shí)別；B.啟動(dòng)子片段選?。籆.酵母單雜交驗(yàn)證ThDof16對(duì)包含DOF元件的啟動(dòng)子片段的互作。

圖4酵母單雜交驗(yàn)證ThDof16識(shí)別DOF元件結(jié)果

2.6GUS基因在煙草體內(nèi)的瞬時(shí)表達(dá)

植物過表達(dá)載體(pROKⅡ-ThDof16)作為效應(yīng)載體(effector)，pCAM-DOF、pCAM-DM7、pCAM-DOFp+、pCAM-DOFp-為報(bào)告載體(reporter)(圖5A)，通過基因槍共轉(zhuǎn)化煙草葉片，GUS染色結(jié)果顯示煙草葉片呈現(xiàn)斑點(diǎn)狀藍(lán)色；而對(duì)照組GUS染色結(jié)果顯示煙草葉片未呈現(xiàn)藍(lán)色(圖5B)。ThDof16能夠特異性地結(jié)合ThbHLH1啟動(dòng)子中的DOF元件來調(diào)控基因的表達(dá)。GUS酶活測(cè)定結(jié)果表明，只有報(bào)告載體時(shí)，通過基因槍轉(zhuǎn)化的煙草的GUS活性很低。表達(dá)載體(pROKⅡ-ThDof16)與效應(yīng)載體(pCAM-DOF、pCAM-DM7、pCAM-DOFp+、pCAM-DOFp-)通過基因槍共轉(zhuǎn)化煙草葉片，進(jìn)行GUS酶活測(cè)定(圖5C)；結(jié)果顯示在植物體內(nèi)ThDof16和能夠特異性地結(jié)合ThbHLH1啟動(dòng)子中的DOF位點(diǎn)，來調(diào)控基因的表達(dá)。

A.報(bào)告載體和效應(yīng)載體的構(gòu)建;B.GUS染色結(jié)果;C.GUS酶活測(cè)定。

2.7ChIP研究ThDof16與DOF元件在ThbHLH1啟動(dòng)子中的互作

通過啟動(dòng)子分析，選取包含和不包含DOF順式作用元件的5個(gè)片段，1(-1 857～-1 538)、2(-1 531～-1 208)、3(-1 158～-849)、4(-787～-429)、5(-311～-11)，其中第一段不包含DOF元件(圖6A)，以Input，ChIP+，和ChIP-為模板，進(jìn)行PCR驗(yàn)證，PCR結(jié)果表明Input為模板均出現(xiàn)特異條帶；ChIP+為模板，片段2、3、4、5均有條帶，只有片段1沒有條帶顯示；ChIP-為模板PCR結(jié)果均無條帶顯示(圖6B)，結(jié)果表明植物體內(nèi)與ThDof16互作的片段為含有DOF元件的啟動(dòng)子片段。該結(jié)果驗(yàn)證了ThDof16能夠特異識(shí)別ThbHLH1啟動(dòng)子中的DOF元件。進(jìn)一步證明了ThDof16通過識(shí)別ThbHLH1啟動(dòng)子中的DOF元件調(diào)控ThbHLH1基因的表達(dá)，即ThDof16為ThbHLH1的上游調(diào)控因子。

A.啟動(dòng)子中包含和不包含DOF順式作用元件的片段結(jié)構(gòu);B.ChIP-PCR電泳結(jié)果，其中B圖中M表示DL2000。

3結(jié)論與討論

本研究根據(jù)已知的抗逆相關(guān)基因ThbHLH1的cDNA序列克隆得到ThbHLH1的全序列，通過PlantCARE及PLACE分析啟動(dòng)子中可能含有的順式作用元件發(fā)現(xiàn)，其中含有啟動(dòng)子的基本順式作用元件及DOF(AAAG)、G-box、W-box、I-box、WRKY和MYC等與信號(hào)傳遞途徑相關(guān)的順式作用元件，說明其可能與抗逆相關(guān)。因此，我們將設(shè)計(jì)利用酵母單雜交系統(tǒng)來研究ThbHLH1上游調(diào)控基因。

3結(jié)論

采用過熱蒸汽干燥方法對(duì)50 mm厚柳杉鋸材進(jìn)行了試驗(yàn)研究，結(jié)果表明：干燥周期為110 h，全程干燥速率為0.011 8 h-1，終含水率、厚度含水率偏差及殘余應(yīng)力均達(dá)到一級(jí)指標(biāo)要求，且合格率達(dá)到100%。外觀干燥缺陷方面，順彎翹曲率、橫彎翹曲率和扭曲率平均值均能達(dá)到鋸材干燥質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)中的一級(jí)指標(biāo)要求，翹曲率平均值達(dá)到干燥質(zhì)量二級(jí)指標(biāo)要求，總合格率達(dá)90.32%。經(jīng)過熱蒸汽干燥后柳杉的紋孔發(fā)生破裂，木材的孔隙增加，有利于木材干燥速度及干燥質(zhì)量的提高。

建議對(duì)同一批試材采用常規(guī)干燥和過熱蒸汽干燥進(jìn)行直接對(duì)比，以為企業(yè)提供參考，為柳杉鋸材的工業(yè)化利用提供技術(shù)依據(jù)。

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收稿日期：2015年9月10日。

作者簡(jiǎn)介：第一張兵，女，1990年11月生，林木遺傳育種國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室(東北林業(yè)大學(xué))，碩士研究生。E-mail:763557804@qq.com。通信作者：王玉成，林木遺傳育種國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室(東北林業(yè)大學(xué))，教授。E-mail:wangyucheng@ms.xjb.ac.cn。

1)黑龍江省杰出青年科學(xué)基金(JC201102)。

責(zé)任編輯：潘華。