王含　魏明　　　　　　　　李成浩

(東北林業(yè)大學(xué)，哈爾濱，150040)　　　　(林木遺傳育種國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室(東北林業(yè)大學(xué)))

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毛果楊PtAREB1基因啟動(dòng)子的克隆及功能1)

王含魏明李成浩

(東北林業(yè)大學(xué)，哈爾濱，150040)(林木遺傳育種國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室(東北林業(yè)大學(xué)))

摘要為了研究楊樹ABF2同源基因的表達(dá)規(guī)律，從毛果楊基因組DNA中克隆出PtAREB1基因上游一段1 800 bp序列。序列分析結(jié)果表明，該序列含有逆境脅迫響應(yīng)元件TC-rich repeats、ABA應(yīng)答元件ABRE和茉莉酸甲酯(Methyl Jasmonate，MeJA)應(yīng)答元件TGACG-motif等脅迫相關(guān)元件。在序列分析的基礎(chǔ)上，構(gòu)建了PtAREB1基因啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)GUS報(bào)告基因的植物表達(dá)載體，利用農(nóng)桿菌介導(dǎo)的花粉管通道法獲得轉(zhuǎn)基因擬南芥。結(jié)果表明PtAREB1啟動(dòng)子可以在干旱、ABA、鹽、MeJA和SA脅迫下，驅(qū)動(dòng)GUS基因在轉(zhuǎn)基因擬南芥的根、莖和葉中表達(dá)。說(shuō)明PtAREB1基因可能與干旱、高鹽等脅迫應(yīng)答緊密相關(guān)。

關(guān)鍵詞毛果楊；ABF轉(zhuǎn)錄因子；ABA；啟動(dòng)子；擬南芥

分類號(hào)Q78

Cloning and Functional Identification of Promoter Region ofPtAREB1 fromPopulustrichocarpa

Wang Han, Wei Ming

(Northeast Forestry University, Harbin 150040, P. R. China); Li Chenghao(State Key Laboratory of Tree Genetics and Breeding, Northeast Forestry University)//Journal of Northeast Forestry University，2016,44(4)：18-24.

In order to study the expression and regulation of ABF homologous gene in poplar, a 1 800 bp 5’flanking sequence ofPtAREB1 gene was isolated by PCR from genomic DNA ofPopulustrichocarpa. By promoter sequence analysis, the sequence contained stress-response element TC-rich, ABA-response element ABRE and MeJA-response element TGACG-motif. By sequence analysis, thePtAREB1 promoter was fused to the GUS reporter gene to characterize its expression pattern inP.trichocarpa. From theAgrobacteriummediated transformation ofArabidopsisthaliana, the GUS gene was induced inArabidopsisthaliana, and it expressed in roots, stems and leaves under ABA, drought, high salt, MeJA and SA, suggesting thePtAREB1 promoter was responsive to ABA, drought and high salt stress.

KeywordsPopulustrichocarpa; ABF transcription factor; ABA; Promoter;Arabidopsisthaliana

脫落酸(abscisic acid，ABA)是一種非常重要的植物激素，它的主要作用是在脅迫下對(duì)植物營(yíng)養(yǎng)組織適應(yīng)性有基礎(chǔ)調(diào)節(jié)作用，如干旱和高鹽等[5-6]。在逆境下轉(zhuǎn)錄因子作用于啟動(dòng)子調(diào)控下游基因上調(diào)或下調(diào)的表達(dá)[7]，大多數(shù)受ABA誘導(dǎo)的基因在啟動(dòng)子區(qū)域都有保守序列(C/T)ACGTGGC序列ABRE(ABA responsive element)順式作用元件[8]。ABA反應(yīng)元件結(jié)合蛋白/AREB結(jié)合因子(AREB/ABF)基因亞家族包含在ABA介導(dǎo)的信號(hào)通路中的關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子。ABFs(ABRE blinding factors)可以在非生物脅迫下激活A(yù)BRE相關(guān)基因的表達(dá)，提高植物非生物脅迫耐受性。

近幾年來(lái)，在模式植物研究中ABF轉(zhuǎn)錄因子已成為熱點(diǎn)。ABF基因在諸多非生物脅迫中被特異性誘導(dǎo)表達(dá)。有研究從擬南芥中分離出4種ABF轉(zhuǎn)錄因子，其中ABF1主要參與低溫、ABA脅迫應(yīng)答反應(yīng)；ABF2/AREB1、ABF4/AREB2則主要參與ABA、干旱、高鹽、熱和氧化脅迫應(yīng)答反應(yīng)，ABF3主要受ABA、高鹽、低溫、熱、氧化脅迫誘導(dǎo)[9]。目前與植物逆境脅迫相關(guān)的特異性表達(dá)啟動(dòng)子的研究主要集中在擬南芥(Arabidopsisthaliana)[10]、煙草(Nicotianatabacum)[11]等草本模式植物和棉花(Cotton)[12]、玉米(Zeamays)[13]、谷類植物(Cereal)[14]等農(nóng)作物上，而關(guān)于多年生木本植物，尤其對(duì)楊樹逆境脅迫相關(guān)的特異性表達(dá)啟動(dòng)子的研究少有報(bào)道。

本文從毛果楊中克隆ABF2同源基因PtAREB1的啟動(dòng)子序列，對(duì)其順式作用元件進(jìn)行分析，構(gòu)建pCAMBIA-1303::GUS植物表達(dá)載體，利用花粉管通道法[15]轉(zhuǎn)擬南芥對(duì)該啟動(dòng)子的表達(dá)特性進(jìn)行研究。

1材料與方法

用于提取植物基因組DNA的毛果楊(PopulustrichocarpaTorr. & Gray)取自東北林業(yè)大學(xué)林木遺傳育種國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室。大腸桿菌(Escherichiacoli)感受態(tài)DH5α，根癌農(nóng)桿菌菌株EHA105菌株(本實(shí)驗(yàn)室保存)。植物表達(dá)載體pCAMBIA-1303::GUS。克隆載體pMD18-T購(gòu)自TaKaRa公司。

主要試劑：植物基因組DNA提取試劑盒、瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒以及普通質(zhì)粒小提試劑盒購(gòu)自康為世紀(jì)公司；LATaq酶、核酸分子量標(biāo)準(zhǔn)(DNA marker ladder)、T4-DNA連接酶、限制性內(nèi)切酶BamHI和NcoI等購(gòu)自TaKaRa公司；卡那霉素(Kanamycin)購(gòu)自Amresco公司；氨芐霉素(Ampicillin)購(gòu)自Sigma公司；利福平(Rifampicin)購(gòu)自MYM公司；乙酰丁香酮(Acetosyringone)購(gòu)自Sigma-Aldrich公司；蛋白胨、酵母提取物、NaCl和瓊脂等其余試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純。

1.1毛果楊PtAREB1基因啟動(dòng)子的克隆

以毛果楊葉片為材料用CTAB法提取基因組DNA，用1.2%瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行鑒定。根據(jù)毛果楊PtAREB1基因(POPTR_0001s22790)5′端序列為基礎(chǔ)設(shè)計(jì)引物，上游引物5′GCGGATCCTTGCGATCATCATTTGTT(劃線部位為增加的BamHI酶切位點(diǎn),酶切位點(diǎn)前加兩個(gè)保護(hù)堿基)，3′下游引物ATCCATGGTCACCATCAAACTCTTAACC(劃線部位為增加的NcoI酶切位點(diǎn),酶切位點(diǎn)前加兩個(gè)保護(hù)堿基)。以毛果楊基因組DNA為模板進(jìn)行聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(Polymerase chain reaction,PCR)。20 L PCR反應(yīng)體系包括：2 μL(100 ng)毛果楊基因組DNA、2 μL 10×LA PCR緩沖液、1.6 μL(2.5 mmol·L-1)dNTP、0.4 μL 10-5m·L-1上游引物、0.4 μL 10-5m·L-1下游引物、0.2 μLLATaqDNA聚合酶(5 U·μL-1)、13.4 μLddH2O2。PCR反應(yīng)循環(huán)條件為94 ℃預(yù)變性3 min，94 ℃變性30 s，50 ℃退火30 s，72 ℃延伸2 min，共進(jìn)行35個(gè)循環(huán)；最后72 ℃延伸10 min。

2018年8月28日上午7：00左右接本鎮(zhèn)養(yǎng)殖戶王先生咨詢電話：池塘魚在一次拉網(wǎng)取樣后，零星死亡，用藥后3～4天不吃食，為什么？拉網(wǎng)嚇的？因王先生今年剛從其叔叔手中接過(guò)池塘，是養(yǎng)殖新手，筆者決定到現(xiàn)場(chǎng)實(shí)地看看。

PCR產(chǎn)物經(jīng)1.2%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)后，切下目的條帶，使用凝膠回收試劑盒回收、純化目的片段。參照TaKaRa公司pMD18-T Vector試劑盒的說(shuō)明將目的片段連接到pMD18-T Vector上，并轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞，接種到含氨芐霉素(50 mg·L-1)的LB固體培養(yǎng)基平板上，1 L LB固體培養(yǎng)基含有10 g蛋白胨、5 g酵母提取物、10 g NaCl和12 g瓊脂，37 ℃倒置培養(yǎng)14～16 h，挑取單菌落進(jìn)行PCR獲得陽(yáng)性克隆。陽(yáng)性克隆委托吉林省庫(kù)美生物科技有限公司公司進(jìn)行測(cè)序。

利用PLACE(http://www.dna.affrc.go.jp/PLACE/)及PlantCARE(http://bioinfor matics.psb.ugent.be/webtools/plantcare/html/)在線軟件對(duì)其轉(zhuǎn)錄調(diào)控元件進(jìn)行分析。

1.2植物表達(dá)載體構(gòu)建

將pCAMBIA-1303::GUS質(zhì)粒進(jìn)行BamHI和NcoI雙酶切，同時(shí)將基因重組質(zhì)粒進(jìn)行BamHI和NcoI雙酶切，回收純化目的片段,通過(guò)T4-DNA連接酶連接，并將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞5α，新的重組質(zhì)粒經(jīng)氨芐霉素(50 mg·L-1)和PCR篩選后，獲得PtAREB11303::GUS植物表達(dá)載體，通過(guò)電擊法將PtAREB11303::GUS表達(dá)載體轉(zhuǎn)化到根癌農(nóng)桿菌EHA105感受態(tài)細(xì)胞中，經(jīng)菌液PCR和雙酶切鑒定，獲得陽(yáng)性克隆,完成工程菌制備。

1.3農(nóng)桿菌介導(dǎo)的花粉管通道法轉(zhuǎn)化擬南芥

用花粉管通道法將擬南芥花絮放入已經(jīng)用蔗糖水懸浮的農(nóng)桿菌菌液中(OD=0.8～1.2)浸泡3 s。取出即可。侵染完成后，將擬南芥用保鮮膜包好，并用不透光塑料袋遮蓋上，暗培養(yǎng)16～24 h，取下袋子和保鮮膜，正常光照培養(yǎng)。侵染一周后，按照上述方法進(jìn)行二次侵染。待角果成熟發(fā)黃后，收集T0代種子。37 ℃烘箱中，烘干2 d，放入4 ℃中，3～5 d后，可以篩選種子。進(jìn)行種子消毒后，播種于含50 mg·L-1Kan的1/2MS培養(yǎng)基中，種子萌發(fā)生長(zhǎng)后，取抗性植株種于土壤中，成熟后收種子T1代并通過(guò)PCR鑒定出轉(zhuǎn)基因植株。重復(fù)以上步驟，篩選出T3代轉(zhuǎn)基因株系。

將T3代轉(zhuǎn)基因種子用20%白貓消毒25 min，蒸水清洗干凈，均勻播種在添加50 mg·L-1Kan的1/2MS培養(yǎng)基上。將生長(zhǎng)10 d的轉(zhuǎn)基因植株分別轉(zhuǎn)移至含200 μmol·L-1ABA、200 mmol·L-1甘露醇、150 mmol·L-1NaCl、100 μmol·L-1茉莉酸甲酯(Methyl Jasmonate，MeJA)、100 μmol·L-1水楊酸(salicylic acid，SA)的培養(yǎng)基上進(jìn)行幼苗期ABA、干旱、鹽、MeJA和SA脅迫處理，2 d后取樣。取處理后的植株進(jìn)行GUS組織化學(xué)染色分析，37 ℃染色20 h，然后用70%乙醇脫色，觀察并拍照，GUS染色液的配制：稱取0.5 mg X-Gluc，加入1-2滴DMF使之完全溶解，再加入980 μL磷酸緩沖液(0.1 mol·L-1)，10 μL鐵氰化鉀(5 mmol·L-1)，10 μL亞鐵氰化鉀(5 mmol·L-1)，攪拌均勻后加入1 μL TritonX-100。

2結(jié)果與分析

2.1毛果楊PtAREB1基因啟動(dòng)子的克隆

以毛果楊基因組DNA為模板，通過(guò)PCR擴(kuò)增得到大小約為1.8 kb的片段(圖1)，與預(yù)期基本一致，將此片段回收，與pMD18-T載體連接,經(jīng)菌液PCR驗(yàn)證后,證明該啟動(dòng)子片段已克隆到pMD18-T載體上。陽(yáng)性克隆測(cè)序結(jié)果表明，該序列長(zhǎng)度為1 800 bp。

M.DL5000 DNA Marker;1.PtAREB1基因啟動(dòng)子PCR擴(kuò)增。

2.2PtAREB1基因啟動(dòng)子的序列分析

利用PLACE(http://www.dna.affrc.go.jp/PLACE/)及PlantCARE(http://bioinfor matics.psb.ugent.be/webtools/plantcare/html/)對(duì)其轉(zhuǎn)錄調(diào)控元件進(jìn)行分析(圖2，表1)。結(jié)果表明，該基因啟動(dòng)子區(qū)域中有保證轉(zhuǎn)錄精確開始的TATA-box啟動(dòng)子核心元件、控制轉(zhuǎn)錄效率和頻率的CAAT-box元件。另外，還有G-Box、GT1-motif和Box 4等光應(yīng)答相關(guān)的元件、厭氧誘導(dǎo)反應(yīng)過(guò)程中的順式作用元件ARE和茉莉酸甲酯應(yīng)答元件TGACG-motif。特別是，啟動(dòng)子中還存在逆境脅迫響應(yīng)元件TC-rich repeats和ABA應(yīng)答元件ABRE。

圖2　毛果楊PtAREB1基因啟動(dòng)子序列

元件名稱核心序列功能注釋ABRETACGTGABA應(yīng)答元件AREGGTTT厭氧誘導(dǎo)元件TGACG-mo-tifTGACG茉莉酸甲酯應(yīng)答元件TC-richre-peatsATTTTCT-TCA逆境脅迫響應(yīng)元件ACEACGTGGA光應(yīng)答元件ATCT-motifAATCT-GATCG光應(yīng)答元件BoxITTTCAAA光應(yīng)答元件G-BoxTACGTG光應(yīng)答元件GT1-motifGGTTAA光應(yīng)答元件Sp1CC(G/A)CCC光應(yīng)答元件GAG-motifGGAGATG光應(yīng)答元件Box4ATTAAT光應(yīng)答元件CCGTCC-boxCCGTCC植物分生組織相關(guān)元件CAAT-BOXCAAAT核心元件

2.31303-PtAREB1-GUS植物表達(dá)載體的構(gòu)建及工程菌的制備

新的重組質(zhì)粒經(jīng)菌液PCR驗(yàn)證后得到1.8 kb片段(圖3A)，與預(yù)期吻合，獲得植物表達(dá)載體PtAREB11303::GUS。電轉(zhuǎn)農(nóng)桿菌后，菌液PCR鑒定結(jié)果(圖3B)，質(zhì)粒雙酶切結(jié)果(圖3C)，表明載體構(gòu)建成功。

2.4轉(zhuǎn)基因擬南芥植株的獲得

用花粉管通道法侵染野生型的擬南芥，收獲的種子在添加50 mg·L-1Kan的1/2MS固體培養(yǎng)基上篩選轉(zhuǎn)染成功的植株，直到篩選到T3代得到8個(gè)轉(zhuǎn)基因株系，并用GUS特異的引物進(jìn)行PCR驗(yàn)證，能擴(kuò)增出相應(yīng)條帶(圖4)，證實(shí)是轉(zhuǎn)基因成功的植株。用于GUS染色。

A.重組質(zhì)粒PCR鑒定;B.電轉(zhuǎn)后菌液PCR鑒定;C.重組質(zhì)粒雙酶切鑒定;M1.DL5000 DNA Marker;M2.DL2000 DNA Marker;M3.DL15000 DNA Marker;1.重組質(zhì)粒PCR產(chǎn)物;2.電轉(zhuǎn)后菌液PCR產(chǎn)物;3.植物表達(dá)載體BamHI和NcoI雙酶切產(chǎn)物。

圖3PtAREB1-GUS植物表達(dá)載體的構(gòu)建

M.DL5000 DNA Marker;+.重組質(zhì)粒PtAREB11303::GUS為模板的PCR產(chǎn)物;-.野生型擬南芥DNA為模板的PCR產(chǎn)物;1～8.PtAREB11303::GUS轉(zhuǎn)基因擬南芥T3代DNA。

圖4T3代DNA水平PCR檢測(cè)

2.5PtAREB1基因啟動(dòng)子的GUS組織化學(xué)染色

為了研究該啟動(dòng)子在不同脅迫條件下的組織特異性表達(dá)，將構(gòu)建好的PtAREB11303::GUS表達(dá)載體通過(guò)農(nóng)桿菌介導(dǎo)的花粉管通道法轉(zhuǎn)入擬南芥，對(duì)轉(zhuǎn)入該啟動(dòng)子的擬南芥幼苗進(jìn)行200 μmol·L-1ABA、200 mmol·L-1甘露醇、150 mmol·L-1NaCl、100 μmol·L-1MeJA、100 μmol·L-1SA脅迫處理，對(duì)

不同脅迫處理的植株進(jìn)行GUS組織化學(xué)染色分析。以未經(jīng)脅迫處理的轉(zhuǎn)基因植株做為對(duì)照。結(jié)果如圖5所示，在未經(jīng)脅迫的轉(zhuǎn)基因植株中沒有檢測(cè)到GUS表達(dá)。在甘露醇、ABA、鹽、MeJA和SA脅迫下，轉(zhuǎn)基因植株的根、莖和葉均能被X-Gluc不同程度的染成藍(lán)色。GUS表達(dá)模式在ABA和甘露醇脅迫下，被觀察到在轉(zhuǎn)基因植株根、莖中部和葉；在鹽脅迫下被觀察到在轉(zhuǎn)基因植株根部、莖下部和葉；在MeJA和SA脅迫下，被觀察到在轉(zhuǎn)基因植株根、莖上部和葉，其中SA脅迫下轉(zhuǎn)基因植株根和莖上部、MeJA脅迫下轉(zhuǎn)基因植株莖上部的GUS表達(dá)活性較高。值得一提的是，在ABA和甘露醇脅迫下，在轉(zhuǎn)基因植株根、莖中部和葉的GUS表達(dá)活性較高，與其他脅迫相比被X-Gluc染色加深。從總體來(lái)看，甘露醇、ABA、鹽、MeJA和SA脅迫能促使PtAREB1啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)GUS報(bào)告基因的表達(dá)。

A.未處理;B.200 mmol·L-1甘露醇;C.200 μmol·L-1ABA;D.150 mmol·L-1NaCl;E.100 μmol·L-1MeJA;F.100 μmol·L-1SA。

3結(jié)論與討論

楊樹是我國(guó)重要的造林綠化、工業(yè)用材樹種。楊樹人工林在我國(guó)特別是北方的生態(tài)建設(shè)和商品林建設(shè)中占有不可替代的地位。氣候引起的干旱和氣溫升高導(dǎo)致了全球大范圍的樹木死亡，所以研究植物抗旱性成為林木育種的首要任務(wù)。植物在干旱條件下至少有4條信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑，其中2條信號(hào)途徑依賴ABA[16]。ABA在植物干旱適應(yīng)中很重要，大量研究表明ABA含量可作為評(píng)價(jià)植物抗早能力的指標(biāo)之一[17]。AREBs是ABA反應(yīng)元件結(jié)合蛋白。ABF轉(zhuǎn)錄因子應(yīng)答受不同的脅迫條件影響，比如，ABF1受低溫影響應(yīng)答，ABF2和ABF3受鹽脅迫影響應(yīng)答反應(yīng)，而ABF4受低溫、鹽、和干旱條件影響應(yīng)答反應(yīng)。OsbZIP46是ABF轉(zhuǎn)錄因子同源性較高的基因，過(guò)表達(dá)OsbZIP46水稻對(duì)ABA敏感，在干旱下高效表達(dá)[18]。鹽芥ABFs家族中14-3-3亞族轉(zhuǎn)錄因子對(duì)于基因在逆境表達(dá)有調(diào)控作用，推測(cè)其同樣會(huì)改變擬南芥中基因的逆境表達(dá)[19]。

啟動(dòng)子包含了很多順式作用元件，保證了基因正常調(diào)控，從而使植物在不同環(huán)境下生長(zhǎng)發(fā)育得以高效進(jìn)行。不同的順式元件以相應(yīng)方式調(diào)控著功能性基因，如干旱響應(yīng)啟動(dòng)子包含ABA應(yīng)答因子(ABRE)和保守的干旱響應(yīng)元件(DRE)，保證調(diào)控耐旱性基因高效表達(dá)。本文構(gòu)建了PtAREB1基因的啟動(dòng)子融合GUS表達(dá)載體通過(guò)GUS活性來(lái)進(jìn)行PtAREB1啟動(dòng)子功能的研究。PtAREB1基因與ABF2同源，由此推測(cè)PtAREB1與ABF2基因功能相似。為了初步預(yù)測(cè)PtAREB1可能參與的生物功能，對(duì)其啟動(dòng)子序列進(jìn)行順式作用元件預(yù)測(cè)分析，在啟動(dòng)子區(qū)域發(fā)現(xiàn)厭氧誘導(dǎo)反應(yīng)過(guò)程中必不可少的順式作用元件ARE，抗病和逆境脅迫響應(yīng)作用元件TC-rich repeats，另外還發(fā)現(xiàn)了G-Box、GT1-motif和Box 4等多種光響應(yīng)元件，與激素相關(guān)的原件茉莉酸甲酯應(yīng)答元件TGACG-motif。還包含了5′UTR區(qū)，有研究表明5′UTR區(qū)對(duì)基因的表達(dá)調(diào)控起著重要作用[20]。最重要該啟動(dòng)子含有干旱與ABA應(yīng)答相關(guān)的ABRE順式作用元件。初步猜測(cè)PtAREB1可能與逆境脅迫下植物應(yīng)答相關(guān)，為PtAREB1基因功能預(yù)測(cè)在理論上起到一定作用。本實(shí)驗(yàn)對(duì)不同脅迫處理的植株進(jìn)行GUS組織化學(xué)染色分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)在甘露醇、ABA、鹽、MeJA和SA脅迫下，PtAREB1啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)GUS報(bào)告基因的表達(dá)且GUS表現(xiàn)較高活性，表明PtAREB1基因可能被甘露醇、ABA、MeJA和SA調(diào)控。已有研究證明PtAREB1的同源基因ABF2在ABA、高鹽等脅迫下均上調(diào)表達(dá)[21]。由于PtAREB1基因啟動(dòng)子中含有MeJA應(yīng)答元件，PtAREB11303::GUS轉(zhuǎn)基因擬南芥在MeJA脅迫下應(yīng)答反應(yīng)明顯。有研究表明MeJA可作為內(nèi)源信號(hào)激發(fā)植物防御反應(yīng)[22]。在SA脅迫下PtAREB11303::GUS轉(zhuǎn)基因擬南芥有明顯的應(yīng)答反應(yīng)。研究表明SA是可介導(dǎo)植物局部組織器官或全身在環(huán)境脅迫下產(chǎn)生防御反應(yīng)的重要內(nèi)源信號(hào)[23]。研究中發(fā)現(xiàn)，甘露醇、ABA、鹽、MeJA和SA脅迫可促使PtAREB1啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)GUS報(bào)告基因在擬南芥根、莖和葉片的表達(dá)，推測(cè)逆境脅迫下PtAREB1基因在毛果楊的根、莖和葉片可能會(huì)被誘導(dǎo)表達(dá)。在不同脅迫下，GUS被檢測(cè)到在PtAREB11303::GUS轉(zhuǎn)基因擬南芥的莖部表達(dá)區(qū)段不同，推測(cè)PtAREB1基因在毛果楊莖不同部位的表達(dá)機(jī)制可能不同。bZIP轉(zhuǎn)錄因子家族中TaABP1基因在小麥中受ABA、高鹽、低溫和干旱誘導(dǎo)表達(dá)，在根、莖和葉中都有表達(dá)，但莖中表達(dá)量最高[24]。值得一提的是，在ABA和甘露醇脅迫下，轉(zhuǎn)基因植株葉的GUS表達(dá)活性較高，與其他脅迫相比被X-Gluc染色加深，猜測(cè)PtAREB1啟動(dòng)子可能在保衛(wèi)細(xì)胞中表達(dá)，之前ABF2啟動(dòng)子被報(bào)道其在保衛(wèi)細(xì)胞中表現(xiàn)較高活性[25]。從而推測(cè)該基因可能通過(guò)ABA依賴途徑來(lái)控制葉片氣孔開關(guān)。有研究表明AREB亞族基因TaABL1受ABA調(diào)控表達(dá)并加快轉(zhuǎn)基因小麥在脅迫下氣孔的關(guān)閉速度[26]。研究表明氣孔的關(guān)閉受應(yīng)激激素ABA介導(dǎo)，在干旱條件下ABA可調(diào)節(jié)控制氣孔關(guān)閉的信號(hào)，從而使植物耐旱性提高[27]。

在甘露醇、ABA、鹽、MeJA和SA脅迫下，PtAREB1基因啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)GUS報(bào)告基因在轉(zhuǎn)基因擬南芥中表現(xiàn)出不同活性，說(shuō)明該基因啟動(dòng)子是逆境脅迫誘導(dǎo)表達(dá)型啟動(dòng)子，啟動(dòng)子通過(guò)與轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合控制基因活動(dòng)，意味該基因表達(dá)可能受非生物脅迫的調(diào)控。逆境脅迫下PtAREB1啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)GUS報(bào)告基因在擬南芥中特異性表達(dá)的這些研究結(jié)果，為今后研究PtAREB1基因轉(zhuǎn)基因楊樹在逆境脅迫過(guò)程中應(yīng)答反應(yīng)機(jī)理奠定了基礎(chǔ)。

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收稿日期：2015年10月30日 。

作者簡(jiǎn)介：第一王含，女，1993年12月生，東北林業(yè)大學(xué)林學(xué)院，碩士研究生。E-mail:wanghan_93@163.com。通信作者：李成浩，林木遺傳育種國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室(東北林業(yè)大學(xué))，教授。E-mail:chli0@163.com。

1)國(guó)家“863”計(jì)劃重點(diǎn)項(xiàng)目(2013AA102704)。

責(zé)任編輯：潘華。